一種外源表達甲酸脫氫酶的酵母工程菌及其構建方法和應用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種外源表達甲酸脫氫酶的酵母工程菌，其分類命名為巴斯德畢赤酵母(Pichia.Pastoris)，已保藏于中國普通微生物菌種保藏管理中心，登記入冊編號為CGMCC?NO：8924，保藏日期為2014年3月17日。本發(fā)明還公開了上述酵母工程菌的構建方法和應用。本發(fā)明的酵母工程菌經甲醇誘導后，測的粗酶活為27.9U/mL。
【專利說明】一種外源表達甲酸脫氫酶的酵母工程菌及其構建方法和應 用

【技術領域】
[0001] 本發(fā)明屬于基因工程【技術領域】，具體涉及一種表達甲酸脫氫酶的工程菌及其構建 方法和應用。

【背景技術】
[0002] 甲酸脫氫酶（Formate dehydrogenase, FDH)屬于D-2-輕基酸脫氫酶類，廣泛存在 于甲醇利用型的細菌及酵母中，根據其4級結構輔基構象和類型分為幾種不同類型，其中 最為重要的一類就是NAD+依賴型甲酸脫氫酶（EC1. 2. 1. 2)，它是NAD+/NADH輔酶循環(huán)中研 究最多的酶。可以在催化甲酸轉化為二氧化碳的同時將NAD+還原為NADH。該類型的甲酸 脫氫酶是由兩個相同的亞基所組成，沒有包含其他金屬離子和輔基，其催化過程中的一個 顯著的特點就是來自底物的氫離子直接轉移到NAD+的煙堿C4原子上，無需酸堿催化步驟。
[0003] 由于甲酸/甲酸脫氫酶輔酶再生體系具有底物價格低、酶來源廣、產物易于從體 系中去除和低濃度的底物不影響其他酶活力等優(yōu)點，所以使得甲酸脫氫酶體系成為最成功 的輔酶再生系統(tǒng)，目前已應用于手性化合物的工業(yè)生產，工業(yè)化大規(guī)模的生產應用應該是 德國Degussa公司成功利用博伊丁假絲酵母（Candida boidinii)的FDH生產L-叔亮氨酸。


【發(fā)明內容】

[0004] 本發(fā)明所要解決的技術問題是針對主流獲取甲酸脫氫酶技術上的不足，提供一種 能夠將目的酶分泌到菌體細胞外的酵母工程菌，以實現為后續(xù)快速有效地分離提純甲酸脫 氫酶提供粗酶液，帶來降低成本、提高菌體利用率和甲酸脫氫酶工業(yè)化生產技術革新的應 用價值。
[0005] 本發(fā)明還要解決的一個技術問題是提供上述酵母工程菌的構建方法。
[0006] 本發(fā)明最后要解決的技術問題是提供上述酵母工程菌的應用。
[0007] 為解決上述技術問題，本發(fā)明所采用的技術方案如下：
[0008] -種外源表達甲酸脫氫酶的酵母工程菌，其分類命名為巴斯德畢赤酵母（Pichia. Pastoris)，已保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心（簡稱CGMCC);地 址：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號中國科學院微生物研究所；郵編：100101 ;登記入冊 編號為CGMCC N0. 8924 ;保藏日期為2014年3月17日。
[0009] 上述外源表達甲酸脫氫酶的酵母工程菌是轉化有重組突變質粒pPICZ a A-fdh的 分泌型巴斯德畢赤酵母菌，其中，所述的重組突變質粒pPICZ a A-fdh是以醇氧化酶-1基因 為啟動子，并含有甲酸脫氫酶基因和Zeocin?抗性基因。
[0010] 上述外源表達甲酸脫氫酶的酵母工程菌的構建方法，其特征在于，該方法包括如 下步驟：
[0011] (1)應用PCR方法獲得甲酸脫氫酶基因（如SEQ ID No :1所示）；
[0012] (2)應用常規(guī)重組質粒構建方法構建重組質粒pPICZ a A-fdh ;
[0013] (3)將重組質粒pPICZ a A-fdh用Sal I線性化后，電擊轉化入宿主菌巴斯德畢赤 酵母中，即構成重組菌；
[0014] (4)將上述重組菌經過抗生素篩選和甲醇誘導表達后，即得出能夠外源表達甲酸 脫氫酶的酵母工程菌。
[0015] 步驟（1)中，使用引物設計軟件設計引物并應用PCR方法獲得甲酸脫氫酶基因， 引物設計軟件采用Stratagene公司的在線引物設計軟件QuikChangc? Primer Design Program。
[0016] 步驟⑵中，所述的重組質粒pPICZa A-fdh是將甲酸脫氫酶基因插入到 質粒pPICZ a A中形成的重組質粒。具體方法參見Invitrogen公司的Mulit-Copy PichiaExpression Kit 操作手冊。
[0017] 步驟（3)中，將重組質粒pPICZ a A-fdh用Sal I內切酶線性化后電擊轉化入宿主 菌巴斯德畢赤酵母之前，先將其轉化到大腸桿菌中進行擴增。
[0018] 上述外源表達甲酸脫氫酶的酵母工程菌在制備甲酸脫氫酶中的應用。
[0019] 具體的應用方法為，將外源表達甲酸脫氫酶的酵母工程菌CGMCC N0. 8924在BMGY 培養(yǎng)基中培養(yǎng)至〇D6(?為2?6,離心上清后用BMMY重懸至0D_為1. 0用以誘導表達，維持 甲醇濃度為lv/v%，將所得的BMMY菌液誘導產酶96小時。
[0020] 有益效果：本發(fā)明所得到的甲酸脫氫酶外源表達酵母工程菌，能夠外源表達甲酸 脫氫酶到細胞外，使得提純甲酸脫氫酶的技術要求變得更簡便，與傳統(tǒng)的破碎細胞后再提 純甲酸脫氫酶工藝條件更加的簡便。本發(fā)明的酵母工程菌經甲醇誘導后，測的粗酶活為 27.9U/mL。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0021] 圖1重組質粒pPICZ a A-fdh的結構示意圖。
[0022] 圖2誘導表達后的酶活示意圖。

【具體實施方式】
[0023] 根據下述實施例，可以更好地理解本發(fā)明。然而，本領域的技術人員容易理解，實 施例所描述的內容僅用于說明本發(fā)明，而不應當也不會限制權利要求書中所詳細描述的本 發(fā)明。
[0024] 實施例1 :目的基因的獲得。
[0025] 根據NCBI上的博伊丁假絲酵母的FDH基因設計引物用于獲得甲酸脫氫酶基因， 引物設計軟件采用Stratagene公司的在線引物設計軟件QuikChange :、S: primer Design Program。選用EcoRI和Notl酶切位點，引物設計如下（下劃線為酶切位點）：
[0026] c. boipp. f5, - GAATTCATGAAGATCGTTTTAGTC- 3'
[0027] c. boitt. r5, - GCGGCCGCTTATTTCTTATCGTGTTT- 3'
[0028] 表1PCR反應參數
[0029]

【權利要求】
1. 一種外源表達甲酸脫氫酶的酵母工程菌，其分類命名為巴斯德畢赤酵母（Pichia. Pastoris)，已保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，登記入冊編號為 CGMCC NO. 8924,保藏日期為2014年3月17日。
2. 根據權利要求1所述的外源表達甲酸脫氫酶的酵母工程菌，其特征在于，它是轉化 有重組突變質粒pPICZ a A-fdh的分泌型巴斯德畢赤酵母菌，其中，所述的重組突變質粒 pPICZ a A-fdh是以醇氧化酶-1基因為啟動子，并含有甲酸脫氫酶基因和Zeocin?抗性基 因。
3. 權利要求1所述的外源表達甲酸脫氫酶的酵母工程菌的構建方法，其特征在于，該 方法包括如下步驟： (1)應用PCR方法獲得甲酸脫氫酶基因； ⑵構建重組質粒pPICZ a A-fdh ; (3) 將重組質粒pPICZ a A-fdh用Sal I線性化后，電擊轉化入宿主菌巴斯德畢赤酵母 中，即構成重組菌； (4) 將上述重組菌經過抗生素篩選和甲醇誘導表達后，即得出能夠外源表達甲酸脫氫 酶的酵母工程菌。
4. 根據權利要求3所述的外源表達甲酸脫氫酶的酵母工程菌的構建方法，其特征在 于，步驟（2)中，所述的重組質粒pPICZ a A-fdh是將甲酸脫氫酶基因插入到質粒pPICZ α A 中形成的重組質粒。
5. 根據權利要求3所述的外源表達甲酸脫氫酶的酵母工程菌的構建方法，其特征在 于，步驟⑶中，將重組質粒pPICZ a A-fdh用Sal I內切酶線性化后電擊轉化入宿主菌巴 斯德畢赤酵母之前，先將其轉化到大腸桿菌中進行擴增。
6. 權利要求1所述的外源表達甲酸脫氫酶的酵母工程菌在制備甲酸脫氫酶中的應用。
7. 根據權利要求6所述的應用，其特征在于，將外源表達甲酸脫氫酶的酵母工程菌 CGMCC NO. 8924在BMGY培養(yǎng)基中培養(yǎng)至0D6(i(i為2?6,離心上清后用BMMY重懸至0D6QQ為 1. 〇用以誘導表達，維持甲醇濃度為lv/v%，將所得的BMMY菌液誘導產酶96小時。
【文檔編號】C12N15/81GK104087522SQ201410306082
【公開日】2014年10月8日 申請日期:2014年6月30日 優(yōu)先權日:2014年6月30日
【發(fā)明者】李鑫, 孫秀程, 歐陽嘉, 姜婷, 勇強, 余世袁, 鄭兆娟, 徐勇, 陳牧, 連之娜 申請人:南京林業(yè)大學