一種重組甲酸脫氫酶及其制備方法和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于基因工程領(lǐng)域，涉及一種重組甲酸脫氫酶及其制備方法和應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 氧化還原酶在六大類酶中占30%?35%，其在催化制備手性醇、羥基酸、氨基酸 等方面具有重要的應(yīng)用價(jià)值。在氧化還原酶所催化的反應(yīng)中，隨反應(yīng)的進(jìn)行會(huì)消耗一定量 的輔酶，其中約80%的反應(yīng)以尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD，NADH)作輔酶。由于輔酶NADH 價(jià)格昂貴，為控制生產(chǎn)成本，在將氧化還原酶應(yīng)用于藥物及其中間體的生產(chǎn)時(shí)，必須提供高 效、低成本的輔酶再生系統(tǒng)：即把輔酶從氧化態(tài)再生為還原態(tài)，或從還原態(tài)再生為氧化態(tài)， 以使輔酶的含量保持在一定的水平，保證酶催化反應(yīng)的順利進(jìn)行。
[0003] 輔酶的循環(huán)是氧化還原酶工業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)的瓶頸因素，甲酸脫氫酶（Formate Dehydrogenase，F(xiàn)DH，EC 1. 2. 1. 2)是輔酶NAD+和NADH再生循環(huán)體系中的關(guān)鍵酶，它可以將 甲酸氧化為CO2，同時(shí)將NAD +還原為NADH。甲酸脫氫酶催化的反應(yīng)不可逆且反應(yīng)徹底，反應(yīng) 中涉及的甲酸價(jià)格低廉且很多酶對(duì)其有很高的耐受性。此反應(yīng)唯一的副產(chǎn)物即CO 2，而CO2 對(duì)反應(yīng)體系中任何酶的活性均無(wú)影響，且易于從反應(yīng)體系中逃逸，不影響產(chǎn)物的分離純化。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的之一在于提供一種甲酸脫氫酶基因突變體及其編碼的重組甲酸脫 氫酶，含有該基因的重組表達(dá)載體、基因工程菌及其制備方法，以及該重組甲酸脫氫酶在輔 酶NAD +和NADH再生循環(huán)體系中的應(yīng)用，并將其用于相關(guān)原料藥及醫(yī)藥中間體的生產(chǎn)。
[0005] -種甲酸脫氫酶基因突變體，核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示。
[0006] -種重組甲酸脫氫酶，選自（1)由SEQ ID NO. 2所示氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；或 是（2)由SEQ ID NO. 2中所示的氨基酸序列經(jīng)過(guò)取代、缺失或者添加一個(gè)或者幾個(gè)氨基酸 且具有甲酸脫氫酶活性的由（1)衍生的蛋白質(zhì)。
[0007] -種含有所述的甲酸脫氫酶基因突變體的重組載體。其可通過(guò)本領(lǐng)域常規(guī)方法將 本發(fā)明的重組甲酸脫氫酶基因的核苷酸序列連接于各種載體上構(gòu)建而成。所述的載體可為 本領(lǐng)域常規(guī)的各種載體，優(yōu)選pETDuet-Ι。
[0008] 一種生產(chǎn)所述的重組甲酸脫氫酶的基因工程菌，所述基因工程菌中包含所述的甲 酸脫氫酶基因突變體。
[0009] 所述基因工程菌的宿主細(xì)胞優(yōu)選大腸埃希氏菌（Escherichia coli)BL21(DE3); 進(jìn)一步優(yōu)選將本發(fā)明所述的含甲酸脫氫酶基因突變體的重組載體轉(zhuǎn)染大腸埃希氏菌 (Escherichia coli)BL21(DE3)所得；最優(yōu)選保藏號(hào)為 CCTCC NO :M 2014304,保藏日為 2014年6月30日，保藏機(jī)構(gòu)為中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心的基因工程菌E. Coli BL21(DE3) FDH 1109〇
[0010] 一種所述的重組甲酸脫氫酶的制備方法，包括如下步驟：培養(yǎng)本發(fā)明所述的基因 工程菌，獲得重組表達(dá)的重組甲酸脫氫酶。
[0011] 所述的制備方法，優(yōu)選在一定生產(chǎn)罐發(fā)酵條件下，進(jìn)行工業(yè)化制備所述重組甲酸 脫氫酶的步驟；其中所述生產(chǎn)罐發(fā)酵條件優(yōu)選：DO 30%以上，空氣流量I: I. 5vvm。
[0012] 本發(fā)明所述的重組甲酸脫氫酶在輔酶NAD+和NADH再生循環(huán)體系中的應(yīng)用。
[0013] 本發(fā)明所述的重組甲酸脫氫酶在生產(chǎn)2-[3-(E)-[3-[2_(7-氯-2-喹啉基）乙烯 基]苯基]-3-羥基丙基]苯甲酸甲酯中的應(yīng)用。
[0014] 有益效果：
[0015] 本申請(qǐng)開(kāi)發(fā)了一個(gè)具有較好催化活性的重組甲酸脫氫酶，用于輔酶NAD+和NADH 再生循環(huán)體系，它可以將NAD+還原為NADH，以使反應(yīng)體系的輔酶含量保持在一定的水平，從 而保證氧化還原酶所催化反應(yīng)的順利進(jìn)行。
[0016] 本發(fā)明所涉及的酶具有優(yōu)良的催化活力，其所催化的反應(yīng)簡(jiǎn)單溫和，無(wú)廢物排放， 反應(yīng)轉(zhuǎn)化率高，具有較好的應(yīng)用前景。
【附圖說(shuō)明】
[0017] 圖1在由重組酮還原酶催化制備2-[3-(E)-[3-[2_(7-氯-2-喹啉基）乙烯基] 苯基]-3-羥基丙基]苯甲酸甲酯的反應(yīng)中，重組甲酸脫氫酶參與了輔酶NADH的再生。
[0018] 圖2甲酸/FDH輔酶再生系統(tǒng)
[0019] 生物材料保藏信息
[0020] 本發(fā)明提供的工程菌屬于大腸埃希氏菌（Escherichia coli)，分類命名為大腸桿 菌 BL21(DE3)FDH1109,拉丁文名 Escherichia coli BL21(DE3)FDH 1109,已于 2014 年 6 月 30日保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏地址為中國(guó)武漢武漢大學(xué)，保藏號(hào)為CCTCC NO : M2014304。
【具體實(shí)施方式】
[0021] 根據(jù)本發(fā)明一個(gè)實(shí)施例的重組甲酸脫氫酶基因，其來(lái)源博伊丁假絲酵母Candida boidinii (Genbank:DQ458777)。根據(jù)易錯(cuò)PCR和定點(diǎn)突變方法對(duì)其進(jìn)行突變，從而獲得該 重組氨基轉(zhuǎn)移酶突變體目的基因，其基因序列為SEQ ID NO. 1。
[0022] 根據(jù)本發(fā)明一個(gè)實(shí)施例的重組甲酸脫氫酶突變體的蛋白序列為SEQ ID NO. 2。
[0023] 根據(jù)本發(fā)明一個(gè)實(shí)施例的重組載體，包括本發(fā)明實(shí)施例的重組甲酸脫氫酶突變體 基因，載體為PETDuet-I，采用乳糖啟動(dòng)子，誘導(dǎo)劑為IPTG。
[0024] 根據(jù)本發(fā)明一個(gè)實(shí)施例的生產(chǎn)甲酸脫氫酶突變體的基因工程菌具有包括甲酸脫 氫酶多肽基因突變體的重組載體。
[0025] 具體地，本發(fā)明的基因工程菌為保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心（CCTCC)的保藏 編號(hào)為CCTCC NO :M 2014304的基因工程菌。
[0026] 實(shí)施例1基因工程菌的建立
[0027] 通過(guò)NCBI查閱甲酸脫氫酶基因（Genbank: DQ458777)，人工合成甲酸脫氫酶基因 片段，以該基因片段為模版，通過(guò)PCR擴(kuò)增擴(kuò)展該片段（片段兩側(cè)加 BamH I和EcoR I內(nèi)切 酶片段）其核苷酸序列如SEQ ID NO. 3所示。并利用BamH I和EcoR I內(nèi)切酶位點(diǎn)將基因 插入pETDuet-Ι質(zhì)粒中，將連接后的載體轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21(DE3)中建立甲酸脫氫酶基因 工程菌。其中PCR擴(kuò)增甲酸脫氫酶基因的引物為：正向引物TATGGTGCTGGTAAACACGC (SEQ ID NO. 4)，反向引物 CTTTGGTAACGTATTCACCG (SEQ ID NO. 5)。
[0028] 實(shí)施例2甲酸脫氫酶突變體基因的獲得
[0029] 本研宄利用易錯(cuò)PCR和定點(diǎn)突變的方法，對(duì)甲酸脫氫酶進(jìn)行了蛋白質(zhì)工程改造。 易錯(cuò)PCR是在采用DNA聚合酶進(jìn)行目的基因擴(kuò)增時(shí)，通過(guò)調(diào)整反應(yīng)條件，如提高鎂離子濃 度、加入錳離子、改變體系中四種的dNTPs濃度或運(yùn)用低保真度DNA聚合酶等，來(lái)改變擴(kuò)增 過(guò)程中的突變頻率，從而以一定的頻率向目的基因中隨機(jī)引入突變，獲得蛋白質(zhì)分子的隨 機(jī)突變體。
[0030] 本研宄采用較低的Taq聚合酶在特定措施下很容易向擴(kuò)增產(chǎn)物中摻入隨機(jī)突變 的原理，同時(shí)利用Mn 2+替代天然輔助因子Mg 2+增加易錯(cuò)概率。
[0031] 50 μ 1易錯(cuò)PCR反應(yīng)體系為：10X擴(kuò)增緩沖液5 μ 1，4種dNTP混合物（2. 5mmol/ L)各 4μ1，正、反向引物各 40pmol，模板DNA 0.5yg，Taq DNA 聚合酶 0.4yL(5U/yL)， Mn2+O. 5 μ L(10 mmol/L)，加雙蒸水至50 μ 1。其中擴(kuò)增甲酸脫氫酶突變體基因?yàn)椋赫蛞?TATGGTGCTGGTAAACACGC(SEQ ID NO. 4)，反向引物 CTTTGGTAACGTATTCACCG (SEQ ID NO. 5)。
[0032] 易錯(cuò)？0?反應(yīng)條件為：94°0預(yù)變性61^11，94°0變性3〇8,54°0變性3〇8,72°0變性 120s，進(jìn)行30個(gè)循環(huán)；于72°C下繼續(xù)延伸10min，冷卻至4°C。
[0033] 實(shí)驗(yàn)流程
[0034] 按照實(shí)施例1的方法PCR擴(kuò)增甲酸脫氫酶基因并利用BamH I和EcoR I內(nèi)切酶位 點(diǎn)將基因插入至pETDuet-Ι質(zhì)粒中，作為基因突變模板；
[0035] 按照上述方法，易錯(cuò)PCR擴(kuò)增甲酸脫氫酶的基因，擴(kuò)增后基因片段鏈接至 pETDuet-Ι載體，將連接后的載體轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21(DE3)中建立甲酸脫氫酶基因突變文 庫(kù)；利用大腸桿菌BL21(DE3)為宿主，pETDuet-Ι質(zhì)粒為載體，表達(dá)擴(kuò)展甲酸脫氫酶，高通量 篩選高活性突變株；突變后對(duì)高活性甲酸脫氫酶基因進(jìn)行鑒定。篩選出的高活性甲酸脫氫 酶突變體基因的核酸序列如SEQ ID NO. 1所示。
[0036] 按實(shí)施例1所述方法構(gòu)建表達(dá)該甲酸脫氫酶多肽突變體的基因工程菌，并將其命 名為 E.Coli BL21(DE3)ST