欧美在线观看视频网站,亚洲熟妇色自偷自拍另类,啪啪伊人网,中文字幕第13亚洲另类,中文成人久久久久影院免费观看 ,精品人妻人人做人人爽,亚洲a视频

在畢赤酵母中使用甲醛脫氫酶啟動子指導人乳頭瘤病毒16型主要衣殼蛋白l1表達的方法

文檔序號:8277627閱讀:1021來源:國知局
在畢赤酵母中使用甲醛脫氫酶啟動子指導人乳頭瘤病毒16型主要衣殼蛋白l1表達的方法
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物工程技術領域,具體涉及一種在甲醇營養(yǎng)型畢赤酵母宿主細胞 中使用畢赤酵母甲醛脫氫酶(FLD)啟動子指導人乳頭瘤病毒16型主要衣殼蛋白LI(HPV 16L1)表達的方法。
【背景技術】
[0002] 畢赤酵母表達系統(tǒng)能有效地分泌異源蛋白,并進行真核翻譯后修飾,操作簡便易 于實現(xiàn)高密度發(fā)酵,且不產(chǎn)生內(nèi)毒素及哺乳動物細胞核酸成分等,因此,是一個廣泛應用的 蛋白表達系統(tǒng)。轉(zhuǎn)錄是基因表達調(diào)控最關鍵的環(huán)節(jié)之一,啟動子可顯著影響異源基因轉(zhuǎn)錄 的起始、水平及持續(xù),從而直接影響異源蛋白的表達效率。畢赤酵母中最常用、最經(jīng)典的啟 動子是醇氧化酶1型啟動子(AOX1),該啟動子具有嚴格的甲醇調(diào)控能力,使用畢赤酵母醇 氧化酶1型啟動子已成功指導了上百種重組蛋白的表達。盡管醇氧化酶1型啟動子能夠指 導異源蛋白大量表達,但由于甲醇有毒且易燃,為安全和大規(guī)模生產(chǎn)帶來問題,同時并不是 所有異源蛋白都適合這樣高水平的表達調(diào)控,如果蛋白的正確折疊和加工是蛋白分泌途徑 上的限速步驟,那么單位時間內(nèi)大量表達的異源蛋白由于來不及進行修飾折疊,最終導致 這些未成熟的蛋白進入泛素化降解途徑,相反地使蛋白產(chǎn)量降低。
[0003] 因此避免甲醇的使用尋找另一些替代的啟動子則是一個有效的策略。畢赤酵母甘 油醛3-磷酸脫氫酶啟動子(GAP)是另一個常用的畢赤酵母啟動子,該啟動子屬于組成型啟 動子,無需誘導,對于無毒性蛋白的表達具有簡便、經(jīng)濟的優(yōu)勢。
[0004] 盡管組成型啟動子簡化了生產(chǎn)步驟,但若獲得較高的蛋白產(chǎn)量,對菌體的生長狀 況要求較高,并且其調(diào)控途徑比較單一,蛋白表達的種類受限。因此一個強的具備多種調(diào)控 途徑的啟動子具有很好的開發(fā)應用價值,對于異源蛋白的表達研宄具有重要意義。
[0005] 在畢赤酵母中,谷胱甘肽依賴的甲醛脫氫酶(FLD)啟動子就是一個具備多種調(diào)控 途徑的啟動子。甲醛脫氫酶是參與酵母甲醇代謝和烷胺類物質(zhì)代謝途徑的主要酶。從畢赤 酵母中分離得到的甲醛脫氫酶基因編碼379個氨基酸,與n-烷烴-同化酵母麥芽糖假絲 酵母的甲醛脫氫酶和人類及其它真核生物的脫氫酶III類酶的甲醛脫氫酶分別具有71%和 61%?65%的核苷酸序列同源性。甲醛脫氫酶將醇氧化酶氧化甲醇產(chǎn)物甲醛氧化,甲醛氧化 產(chǎn)物經(jīng)甲酸脫氫酶后變?yōu)槎趸肌<兹┟摎涿竿瑫r參與烷胺類物質(zhì)代謝,胺類物經(jīng)胺類 氧化酶氧化形成甲醛,之后經(jīng)甲醛脫氫酶和甲酸脫氫酶87作用后,產(chǎn)生二氧化碳并同化為 生物量。甲醛脫氫酶的合成可以獨立地被以甲醇作為唯一碳源和能源,或以甲胺作為唯一 氮源調(diào)控。在葡萄糖和銨鹽離子培養(yǎng)基中,甲醛脫氫酶表達水平很低;然而在甲醇-銨離子 或葡萄糖-甲胺培養(yǎng)基中,甲醛脫氫酶表達水平卻很高。
[0006] 甲醛脫氫酶啟動子已成功用于一些蛋白在畢赤酵母中的表達。使用甲醛脫氫酶啟 動子可以使成熟形式的米根霉脂肪酶獲得高水平的表達量,最大產(chǎn)量達386AU/ml,克服了 醇氧化酶1型啟動子指導的米根霉脂肪酶的過表達對細胞生長帶來的負效應,突破了米根 霉脂肪酶的分泌瓶頸。使用甲醇作為碳源和甲胺作為氮源的組合對蛋白產(chǎn)量具有協(xié)同增強 效應,而甲醇和硫酸銨碳氮源組合培養(yǎng)基則顯示出最好的表達能力,在發(fā)酵培養(yǎng)基中表達 米根霉脂肪酶可達到300WT1的產(chǎn)量。然而甲胺作為氮源,當同作為碳源的山梨醇組合使用 時也能很好地誘導米根霉脂肪酶的表達。研宄表明,無論是以甲醇或是甲胺進行誘導,甲醛 脫氫酶啟動子的強度均不弱于畢赤酵母醇氧化酶1型啟動子。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明的目的是為了解決現(xiàn)有技術的不足,提供一種在甲醇營養(yǎng)型畢赤酵母中使 用甲醛脫氫酶啟動子調(diào)控人乳頭瘤病毒16型主要衣殼蛋白L1表達的方法,其中人乳頭瘤 病毒16型主要衣殼蛋白L1的表達受畢赤酵母甲醛脫氫酶啟動子的控制。
[0008] 本發(fā)明采用的技術方案如下: 畢赤酵母甲醛脫氫酶啟動子指導的畢赤酵母表達載體的構建方法,包括如下步驟: 步驟(1),將甲醛脫氫酶啟動子基因片段進行PCR擴增,擴增后的基因片段純化后,亞 克隆進TA克隆載體pMD?18-T,得到Z^m-pMDTmIS-T載體; 所述的PCR擴增引物為:上游引物(5'端)為gtagatctgcatgcaggaatctctggca,下游引 物(3> 端)為gtgaattcgagacctgtgaatatcaagaattgtatga; 步驟(2 ),將步驟(1)得到的Z^m-pMDTmIS-T載體和畢赤酵母質(zhì)粒pPink-HC進行雙酶切, 連接酶連接過夜,得到質(zhì)粒pPinkFLD-HC; 步驟(3),將步驟(2)得到的質(zhì)粒pPinkFLD-HC和畢赤酵母質(zhì)粒pPinkAOXl-HPV16Ll進 行雙酶切,連接酶連接過夜,得到連接產(chǎn)物質(zhì)粒pPinkFLD-HPV16Ll; 步驟(4),步驟(3)得到的連接產(chǎn)物質(zhì)粒pPinkFLD-HPV16Ll轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a擴增 后,用限制性內(nèi)切酶I酶切,純化回收酶切線性化質(zhì)粒; 步驟(5 ),將步驟(4 )得到的純化回收的酶切線性化質(zhì)粒電轉(zhuǎn)化畢赤酵母PichiaPink^^trai/? /感受態(tài)細胞,經(jīng)過畢赤酵母腺嘌呤缺陷平板篩選得到質(zhì)粒 pPinkFLD-HPV16Ll表達克隆子。
[0009] 進一步,優(yōu)選的是所述的PCR擴增的反應體系包括2微升lOXExtaq酶緩沖液, 1. 6微升dNTP混合物,50微摩爾濃度的上、下游引物各0. 25微升,0. 5微升Extaq酶,2微 升畢赤酵母細胞系GS115菌液,雙蒸水13. 4微升; 所述的PCR擴增反應條件為95 °C,預變性3分鐘;72 °C,熱啟動2分鐘,同時,向反應體 系中加入高保真taq酶;之后95°C,變性30秒;52°C,退火40秒;72°C,延伸1分鐘;最后 72 °C,再延伸10分鐘,共34個循環(huán)。
[0010] 進一步,優(yōu)選的是步驟(2)的具體操作如下:用限制性內(nèi)切酶ifejn和 ifeal(+fe〇RI)雙酶切步驟(1)得到的/^-pMDTM18-T載體后所得甲醛脫氫酶啟動子片 段PFU),與限制性內(nèi)切酶你711和feoRI雙酶切質(zhì)粒pPink-HC所得載體以T4連接酶16°C 連接過夜,轉(zhuǎn)化,涂板,得到質(zhì)粒pPinkFLD-HC; 酶切質(zhì)粒/^-pMD?18-T反應體系為:質(zhì)粒i%-pMD?18-T0. 56yg/y1 10微升, 你/IIl微升,feaI(+^boRI)l微升,10XTbuffer3微升,0?l%BSA0?3微升,雙蒸水 14. 7微升; 酶切質(zhì)粒pPink-HC反應體系為:質(zhì)粒pPink-HC0. 73yg/y1 10微升,MI1. 5微 升,feoRI1. 5微升,10XHbuffer3微升,雙蒸水14微升; 連接反應體系為:片段PFU)1微升,載體1微升,10XT4buffer1微升,T4連接酶1微 升,雙蒸水6微升;其中,片段PFU)和載體的連接摩爾濃度比為1:3。
[0011] 進一步,優(yōu)選的是步驟(3)的具體操作如下: 步驟(2)得到的質(zhì)粒pPinkFLD-HC用限制性內(nèi)切酶I和fcaI(+feoRI) 雙酶切消化后所得核苷酸片段與用限制性內(nèi)切酶I和I雙酶切的質(zhì)粒 pPinkA0Xl-HPV16Ll所得載體,以T4連接酶16 °C連接過夜,轉(zhuǎn)化,涂板,得到質(zhì)粒 pPinkFLD-HPV16Ll; 酶切質(zhì)粒pPinkFLD-HC:質(zhì)粒pPinkFLD-HC0? 65yg/y1 10 微升,I1 微升,也31(+及^1)1微升,10\冊8131^€6143微升,100\85六0.3微升,雙蒸水14.7微升 ; 酶切質(zhì)粒pPinkA0Xl-HPV16Ll:質(zhì)粒pPinkA0Xl-HPV16Ll0? 65yg/y1 15 微升, I1微升,feoRI1微升,10XTbuffer3微升,0? 1%BSA0? 3微升,雙蒸水9. 7微升; 連接反應體系為:核苷酸片段1微升,載體2微升,10XT4buffer1微升,T4連接酶1 微升,雙蒸水5微升;其中,核苷酸片段和載體的連接摩爾濃度比為1:3。
[0012] 進一步,優(yōu)選的是步驟(4)的質(zhì)粒pPinkFLD-HPV16Ll酶切反應體系為:質(zhì)粒 pPinkFLD-HPV16Ll0.373yg/yl15 微升,1.2 微升,lOXMbuffer3 微升,雙蒸水 10. 8微升。
[0013] 本發(fā)明還體佛那個一種在畢赤酵母中使用甲醛脫氫酶啟動子指導HPV16L1表達 的方法,該方法是使用上述得到的質(zhì)粒pPinkFLD-HPV16Ll表達克隆子進行表達,具體步驟 如下: 步驟(1 ),將質(zhì)粒pPinkFLD-HPV16Ll表達克隆子接種甘油復合物緩沖液培養(yǎng)基培養(yǎng)過 夜至菌液600納米波長處吸光值為2~6之間,然后使用甲醇復合物緩沖液培養(yǎng)基進行誘導 表達,將有表達的菌落保存作為種子甘油菌; 步驟(2),將步驟(1)得到的種子甘油菌接種至酵母浸出粉胨葡萄糖培養(yǎng)基中培養(yǎng),所 得一級種子液再接種至甘油復合物緩沖液培養(yǎng)基獲得二級種子液,將二級種子液分為等量 8份后使用8種不同誘導培養(yǎng)基培養(yǎng),其中8種誘導培養(yǎng)基分別為葡萄糖-硫酸銨混合培 養(yǎng)基、葡萄糖-甲胺混合培養(yǎng)基、甘油-硫酸銨混合培養(yǎng)基、甘油-甲胺混合培養(yǎng)基、山梨 醇-硫酸銨混合培養(yǎng)基、山梨醇-甲胺混合培養(yǎng)基、甲醇-硫酸銨混合培養(yǎng)基和甲醇-甲胺 混合培養(yǎng)基; 步驟(3),取步驟(2)中8種不同培養(yǎng)基誘導后24小時、48小時和72小時的酵母
當前第1頁1 2 3 4 
網(wǎng)友詢問留言 已有0條留言
  • 還沒有人留言評論。精彩留言會獲得點贊!
1
静乐县| 龙里县| 临夏县| 通渭县| 镇原县| 长治市| 富顺县| 麻栗坡县| 任丘市| 沙河市| 和林格尔县| 九台市| 桂平市| 商丘市| 赫章县| 沙坪坝区| 商城县| 资中县| 富川| 即墨市| 中山市| 博兴县| 安庆市| 博客| 蒙城县| 宜丰县| 田东县| 交口县| 新密市| 霸州市| 鹤庆县| 珲春市| 滦平县| 宿迁市| 乌恰县| 台安县| 张家港市| 翼城县| 景泰县| 南和县| 崇文区|