專利名稱：編碼木糖醇脫氫酶的dna的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及編碼具有木糖醇脫氫酶活性的多肽的DNA、核酸構(gòu)建 體和包含所述DNA的載體、用該載體轉(zhuǎn)化以表達(dá)所述DNA的微生物 和用于生產(chǎn)木糖醇脫氫酶的方法。本發(fā)明的微生物等可用于工業(yè)上有 用的步驟，例如乙醇生產(chǎn)步驟、生物質(zhì)生產(chǎn)步驟和從NADPH再生 NADP+的步驟。
背景技術(shù)：
木糖是植物生物質(zhì)和木材中存在的最豐富的碳水化合物，其構(gòu)成 大約40%的木質(zhì)纖維素物質(zhì)。木糖在纖維素生產(chǎn)步驟中作為廢品從木 聚糖水解產(chǎn)物形成，木聚糖是半纖維素的主要成分。渴望有效利用碳
源，應(yīng)該通過(guò)發(fā)酵將木糖轉(zhuǎn)化為乙醇或生物質(zhì)。尤其是乙醇作為液體
燃料大量使用。
假絲酵母屬(Owt//^) (Gong， C.S., Chen, L.F., Fickinger， M.C,和 Tsao, G.T., Conversion of hemicellulose carbohydrate (半纖維素碳水化 合物的轉(zhuǎn)化).Adv. Biochem. Eng. 20: 93-118 (1981);和Jeffries, T.W., Utilization of xylose by bacteria, yeast and ftmgi (通過(guò)纟田菌、酵母菌和真 菌利用木糖).Adv. Biochem. Biotech. 27: 1-32 (1983》、德巴利氏酵母屬 peZ^70A^ceW 、 漢遜酵母屬(7fo似e"w/^ 、 克魯維酵母屬 (A7甲^函戸"、梅奇酵母屬(Metec/m汰o德」、管嚢酵母屬 (尸ac'/ 3Aso/ew」、4以青霉屬(尸aecz7o附y(tǒng)ces」(Wu,丄F., Lastick， S.M., Updegraff, D.M., Ethanol production from sugars derived from plantbiomass by a novel ftmgus (通過(guò)新的真菌從源自植物生物質(zhì)的糖生產(chǎn)
乙醇).Nature 321: 887-888 (1986))、畢赤酵母屬(尸/c/ /a」(Maleszka， R.
和Schneider, H.， Fermentation of D-xylose， xylitol and D-xylulose by
yeasts (由酵母菌發(fā)酵D-木糖、木糖醇和D-木酮糖).Can. J. Microbiol.
28: 360-363 (1982))等被認(rèn)為是可利用戊糖(例如木糖或D-核糖)等的酵
母菌。
一般而言，在生物體中戊糖(例如木糖)向乙醇的轉(zhuǎn)化由戊糖磷酸化 作用介導(dǎo)，所產(chǎn)生的磷酸化戊糖通過(guò)磷酸戊糖途徑轉(zhuǎn)化為乙醇。戊糖 磷酸化作用首先需要還原戊糖，同時(shí)伴隨NADPH向NADP+的轉(zhuǎn)化， 該反應(yīng)由還原酶催化。通過(guò)戊糖還原而形成的戊糖醇隨后被氧化，同 時(shí)伴隨NAD+向NADH的轉(zhuǎn)化。該反應(yīng)由脫氬酶催化。D-戊酮糖通過(guò) 上述兩步反應(yīng)形成并被激酶磷酸化以形成磷酸戊糖(Bamett, J.A., The utilization of sugars by yeasts (通過(guò)酵母菌利用糖)。屋^載于Advances in carbohydrate chemistry and biochemistry (碳水化合物化學(xué)和生物化學(xué) 進(jìn)展)；由Tipson， R,S.和Horton, D.編輯；New York: Academic Press. 1976,第125-235頁(yè))。
釀酒酵母(S. ce"v^a—是主要用于生物乙醇生產(chǎn)的酵母菌，可利用 從木糖轉(zhuǎn)化的木酮糖(戊酮糖)，但是該酵母菌不能發(fā)酵戊糖(Jeffries, T.W,, Emerging technology for fermenting D-xylose (用于發(fā)酵D-木糖的 新出現(xiàn)的技術(shù)).Trends in Biotechnology 3: 208-212 (1985))。重要的是 釀酒酵母含有編碼發(fā)酵戊糖的蛋白質(zhì)的基因，但不表達(dá)這些基因。
認(rèn)為釀酒酵母可能通過(guò)由代謝木糖的微生物提供木糖利用途徑來(lái) 實(shí)現(xiàn)通過(guò)釀酒酵母的戊糖發(fā)酵。對(duì)釀酒酵母進(jìn)行過(guò)多次嘗試以表達(dá)細(xì) 菌的木糖異構(gòu)酶基因，然而，木糖發(fā)酵均以失敗而告終，這大概是由 于外源基因的表達(dá)不充分(Sartny， A.V., McConaugh, B丄.,Lodo， Z., Sundstrom, J.A., Furlong, C,E.和 Hall, B.D., Expression of theEscherichia coli xylose isomerase gene in Saccharomyces cerevisiae (大 腸桿菌木糖異構(gòu)酶基因在釀酒酵母中的表達(dá)).Appi. Eur. Microbiol. 53: 1996-2000 (1987); Amoer， R., Wilhelm， M.和Hollenberg, C.P.， The fermentation of xylose - an analysis of the expression of Bacillus and Actinoplanes xylose isomerase genes in yeast (木并唐發(fā)酵一芽月包才干菌屬和 游動(dòng)放線菌屬的木糖異構(gòu)酶基因在酵母菌中的表達(dá)分析).Appl. Microbiol. Biotechnol. 30: 351-357 (1989); Chan, E,C., Ueng, P.P.和 Chen, L.F., D-xylose fermentation to ethanol by Schizosaccharomyces pombe cloned with xylose isomerase gene (通過(guò)經(jīng)木糖異構(gòu)酶基因克隆 的粟酒裂殖酵母(5b/n'zc^acc/wraw;;cas pcw6e)將D-木糖發(fā)酵為乙醇). Biotech. Lett. 8: 231-234 (1986);和Chan， E.畫C.， Ueng, P.P.和Chen, L.F., Environmental effects on D-xylose fermentation by Schizosaccharomyces cerevisiae (環(huán)境對(duì)釀酒酵母發(fā)酵D-木糖的影響).Appl. Biotechnol. 20: 221-232(1989))。
另一方面，嘗試了使用另一酵母菌中的酵母菌基因的方法，以從 具有利用木糖能力的樹干畢赤酵母(尸/c/n'a W/p/fo)分離編碼木糖還原 酶和木糖醇脫氫酶的基因并在釀酒酵母中表達(dá)該基因(日本專利第 3122153號(hào)和第3193917號(hào))。此外，嘗試了對(duì)木糖還原酶基因進(jìn)行分 離(Govinden, R.， Pillay, B.， van Zyl, W.H.和Pillay， D., Candida shehatae xylose reductase gene, complete cds. ("f木。合^荅WI絲酵母(Candida shehatae) 木糖還原酶基因編碼序列)，基因庫(kù)直接提交，登錄為AF278715, (2000)) 和對(duì)來(lái)自休哈塔假絲酵母的木糖醇脫氫酶進(jìn)行純化(Yang， V.W.和 Jeffries, T.W., Purification and properties of xylitol dehydrogenase from the xylose-fermenting yeast Candida shehatae (來(lái)自發(fā)酵木糖的酵母菌休 哈塔假絲酵母的糖醇脫氬酶的純化和性質(zhì)).Appl. Biochem. Biotechnol., 26: 197-206(1990))，休哈塔假絲酵母是另 一種具有利用木 糖能力的酵母菌。然而，沒(méi)有一次從休哈塔假絲酵母成功分離木糖醇 脫氫酶基因。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的是提供編碼新的木糖醇脫氫酶的DNA和使用該DNA 的方法，所述DNA可用于有效將木糖轉(zhuǎn)化為乙醇或生物質(zhì)的技術(shù)。
發(fā)明簡(jiǎn)述
本發(fā)明具有以下特征。
(1) 編碼選自以下多肽的DNA:
(a) 包含SEQ ID NO: 1的氨基酸序列并具有木糖醇脫氫酶活性的 多肽；
(b) 包含與SEQ ID NO: 1的氨基酸序列的同一性為90%以上的氨 基酸序列并具有木糖醇脫氫酶活性的多肽；和
(c) 包含在SEQIDNO: l的氨基酸序列中置換、缺失、插入或增 加一個(gè)或多個(gè)氨基酸的氨基酸序列并具有木糖醇脫氫酶活性的多肽。
(2) (l)的DNA，其中，所述DNA包含SEQ ID NO: 2的核苷酸序列。
(3) (1)的DNA,其中所述DNA包含由于遺傳密碼的簡(jiǎn)并而不同于 SEQ ID NO: 2的核苷酸序列的序列。
(4) (1)-(3)中任一項(xiàng)的DNA,其中所述DNA來(lái)自酵母菌。
(5) (4)的DNA，其中所述酵母菌為休哈塔假絲酵母。
(6) (5)的DNA,其中所述酵母菌為休哈塔假絲酵母CBS5813(NBRC1983)。
(7) 核酸構(gòu)建體，其包含(l)-(6)中任一項(xiàng)的DNA和能夠在宿主細(xì) 胞中調(diào)控所述DNA的表達(dá)的調(diào)控序列。
(8) (7)的核酸構(gòu)建體，其中，所述DNA編碼SEQIDNO: 1的氨基 酸序列。
(9) (8)的核酸構(gòu)建體，其中，所述DNA包含SEQ ID NO: 2的核香 酸序列。
(10) (7)-(9)中任一項(xiàng)的核酸構(gòu)建體，其中，所述調(diào)控序列來(lái)自宿主 細(xì)胞。
(11) (7)-(9)中任一項(xiàng)的核酸構(gòu)建體，其中，所述調(diào)控序列為啟動(dòng)子。
(12) (11)的核酸構(gòu)建體，其中，所述啟動(dòng)子為組成型啟動(dòng)子或誘導(dǎo)
型啟動(dòng)子。
(13) (11)或(12)的核酸構(gòu)建體，其中所述啟動(dòng)子選自ADH1、ADH2、 PDC、 GAL1/10、 TDH3和PGK1啟動(dòng)子。
(14) 載體，其包含(l)-(6)中任一項(xiàng)的DNA或(7)-(13)中任一項(xiàng)的核
酸構(gòu)建體。
(15) (14))的載體，其中，所述載體為質(zhì)粒。
(16) 微生物，其包含(l)-(6)中任一項(xiàng)的DNA、 (7)-(13)中任一項(xiàng)的 核酸構(gòu)建體或(14)或(15)的載體并因此而表達(dá)具有木糖醇脫氫酶活性的多肽。
(17) (16))的微生物，其中，所述微生物為酵母菌或細(xì)菌。
(18) (17))的微生物，其中所述酵母菌或細(xì)菌選自以下酵母菌屬和細(xì) 菌屬，所述酵母菌屬包括釀酒酵母屬GSaccAaraw;;ce力、裂殖酵母屬 ('Sc/2/zo5acc/^簡(jiǎn)少c^y)、許旺酵母屬(/S^而""/畫yce》、克魯維酵母屬、 畢赤酵母屬、漢遜酵母屬、假絲酵母屬、德巴利氏酵母屬、梅奇酵母
屬、管嚢酵母屬或擬青霉屬，所述細(xì)菌屬包括發(fā)酵單胞菌屬
(々附0歸""力。
(19) (18)的微生物，其中，所述微生物為釀酒酵母G^cc/ araw少c^
(20) (18)的微生物，其中，所述微生物為粟酒裂殖酵母
(21) (16)-(20)中任一項(xiàng)的微生物，其中，將所述DNA或所述核酸 構(gòu)建體摻入到宿主微生物的基因組中。
(22) 用于生產(chǎn)木糖醇脫氫酶的方法，其包括以下步驟
(a) 在培養(yǎng)基中培養(yǎng)(16)-(21)中任一項(xiàng)的微生物；和
(b) 從所述微生物或所述培養(yǎng)基收集具有木糖醇脫氫酶活性的產(chǎn)物。
(23) (22)的方法，其進(jìn)一步包括選擇適用于木酮糖發(fā)酵的微生物的 步驟。
(24) 使用(16)-(21)中任一項(xiàng)的微生物生產(chǎn)乙醇的方法。
(25)載體，其包含含有(l)的DNA的木糖醇脫氬酶基因表達(dá)盒、 木糖還原酶基因表達(dá)盒和木酮糖激酶基因表達(dá)盒。
本發(fā)明提供編碼木糖醇脫氫酶(涉及木酮糖發(fā)酵)的DNA、重組表 達(dá)所述DNA的微生物(例如酵母菌)等。所述DNA和所述微生物可用 于生物乙醇生產(chǎn)、生物質(zhì)生產(chǎn)、食品工業(yè)等。
附圖簡(jiǎn)述


圖1顯示用于構(gòu)建包含來(lái)自休哈塔假絲酵母的木糖醇脫氫酶基因 的表達(dá)載體的程序概要。
實(shí)施發(fā)明的最佳方式
本發(fā)明提供編碼具有木糖醇脫氫酶活性的多肽的DNA。
木糖醇脫氫酶(EC1丄1.9)是催化以木糖作為原料的木酮糖發(fā)酵的 部分過(guò)程的酶。該過(guò)程的上半程是還原性地由木糖形成木糖醇的反 應(yīng)。該還原性反應(yīng)由木糖還原酶催化。該過(guò)程的后半程是氧化性地由 木糖醇形成木酮糖的反應(yīng)。該氧化性反應(yīng)由木糖醇脫氫酶催化。木糖 醇脫氫酶活性依賴于NAD(P)+。業(yè)已嘗試過(guò)將木糖還原酶和木糖醇脫 氫酶二者的基因引入酵母菌(例如釀酒酵母)細(xì)胞，藉此改進(jìn)生產(chǎn)乙醇
的能力(例如美國(guó)專利第6，582,944號(hào))。
本發(fā)明DNA為編碼選自以下的多肽的DNA:
(a) 包含SEQ ID NO: 1的氨基酸序列并具有木糖醇脫氫酶活性的 多肽；
(b) 包含與SEQ ID NO: 1的氨基酸序列的同一性為90%以上的氨基酸序列并具有木糖醇脫氫酶活性的多肽；和
(c)包含在SEQIDNO: l的氨基酸序列中置換、缺失、插入或增 加一個(gè)或多個(gè)氨基酸的氨基酸序列并具有木糖醇脫氬酶活性的多肽。
編碼SEQ ID NO: 1的多肽的DNA來(lái)自酵母菌，具體而言，來(lái)自 休哈塔假絲酵母，尤其是休哈塔假絲酵母CBS5813 (NBRC1983)。
在本發(fā)明中，多肽可僅由SEQIDNO: 1的氨基酸序列組成，或可 包含所述氨基酸序列以及例如在多肽的氨基末端或羧基末端的附加 序列。這樣的附加氨基酸序列為例如提供成熟蛋白質(zhì)的細(xì)胞外分泌的 信號(hào)肽序列。
或者，所述多肽還包含與SEQIDNO: 1的氨基酸序列的同一性為 90%以上的氨基酸序列的變體、同系物、類似物等。在本文中，術(shù)語(yǔ)"同 一性，，意指在引入或不引入缺口的氨基酸序列比對(duì)中，完全匹配的氨基 酸數(shù)量占氨基酸總數(shù)的比例(％)。這樣的多肽通常包含在SEQ ID NO: 1的氨基酸序列中置換、缺失、插入或增加一個(gè)或多個(gè)氨基酸的氨基 酸序列，該序列具有與所述氨基酸序列優(yōu)選92%以上或93%以上、更 優(yōu)選95%以上或97%以上、甚至更優(yōu)選98%以上或99%以上的序列同
一性。
具有同一性為90%以上的序列的蛋白質(zhì)可例如通過(guò)訪問(wèn)本領(lǐng)域已 知的數(shù)據(jù)庫(kù)(GenBank,EMBL等)來(lái)搜索。例如，本領(lǐng)域已知的運(yùn)算法 則例如BLAST或FASTA可用作搜索系統(tǒng)。用于這樣的搜索的具體操 4乍禾呈序闡述于例長(zhǎng)口"Introduction to GenomeNet Databases(GenomeNet 數(shù)據(jù)庫(kù)介紹"，第2版，由Toshihisa Takagi和Minoru Kanehisa編輯 (1998), KYORITSU SHUPPAN CO.， LTD (東京，日本)。
或者，多肽還包括變體，該變體包含在SEQIDNO: 1的氨基酸序列中置換、缺失、插入或增加一個(gè)或多個(gè)氨基酸的氨基酸序列。在本
文中，術(shù)語(yǔ)"多個(gè)"意指大約為IO或更小的整數(shù),例如2-10、 2-9、 2-8、
2腸7、 2-6、 2-5、 2-4或2-3的整數(shù)。
只要是新的并具有木糖醇脫氫酶活性，置換、缺失、插入或增加 了氨基酸的變體就包括在本發(fā)明范圍內(nèi)。
由本發(fā)明DNA編碼的多肽的氨基酸變異優(yōu)選在不對(duì)如下位點(diǎn)產(chǎn)生 不良影響的位點(diǎn)處的突變，即在SEQIDNO: 1的氨基酸序列中與木糖 醇脫氫酶活性相關(guān)的催化結(jié)構(gòu)域或者與輔酶起作用的輔酶結(jié)合域的 三維結(jié)構(gòu)(或構(gòu)象)。然而，除非顯著降低酶活性，否則甚至可在催化 結(jié)構(gòu)域或輔酶結(jié)合域引入突變。在SEQIDNO: 1的氨基酸序列中構(gòu)成 輔酶結(jié)合域的氨基酸的實(shí)例包括Asp2Q7、 Ile208、 Phe，、 Asn211和Lys212。 在SEQ ID NO: 1的氨基酸序列中構(gòu)成催化結(jié)構(gòu)域的氨基酸的實(shí)例包 括Cys41、 His66、 Glu67、 Ser96、 Ser99、 Tyi^和Cysn°。引入突變提供 例如活性比野生型更高的變體，例如1.5倍以上、2倍以上、2.5倍以 上、3倍以上、5倍以上、7倍以上、IO倍以上、15倍以上、20倍以 上、30倍以上、40倍以上或50倍以上?；蛘撸胪蛔冞€可改進(jìn)酶 的熱穩(wěn)定性。變異的實(shí)例包括在Watanabe, S.等，J. Biol. Chem. 280 (11): 10340-10349 (2005)中闡述的變異。
特別地，氨基酸之間的置換可為在結(jié)構(gòu)或化學(xué)性質(zhì)相似的氨基酸 之間的保守置換，或可為在上述性質(zhì)不同的氨基酸之間的非保守置 換。結(jié)構(gòu)或化學(xué)性質(zhì)相似的氨基酸可如下分類
疏水氨基酸基團(tuán)，包括丙氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、纈氨酸、曱
辟u氨酸和脯氨酸。
極性氨基酸基團(tuán)，包括絲氨酸、蘇氨酸、甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺和半胱氨酸。
芳香氨基酸基團(tuán)，包括苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸。
酸性氨基酸基團(tuán)，包括谷氨酸和天冬氨酸。
堿性氨基酸基團(tuán)，包括賴氨酸、精氨酸和組氨酸。
本發(fā)明DNA包含具有編碼任何上述多肽的核苷酸序列的單鏈或雙 鏈DNA。本發(fā)明DNA包括例如天然DNA、 cDNA、化學(xué)合成DNA、 通過(guò)聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)獲得的DNA和包含兩個(gè)或多個(gè)上述DNA的 組合的DNA。
具體而言，本發(fā)明DNA為包含SEQ ID NO: 2的核苷酸序列的 DNA。此外，本發(fā)明另一DNA為包含如下序列的DNA:因遺傳密碼 簡(jiǎn)并而獲得的SEQIDNO:2的核苷酸序列的變體序列。例如，與野生 型來(lái)源生物物種不同的生物物種的最適密碼子可基于遺傳密碼簡(jiǎn)并 來(lái)選擇并包括在DNA中。變體序列意指包含變異的序列，通過(guò)該變 異得到的核苦酸序列不同于原始核苷酸序列，盡管它們編碼同樣的氨 基酸序列。
可用本領(lǐng)域已知技術(shù)(例如DNA重組、PCR、雜交、克隆和定點(diǎn)突 變技術(shù))來(lái)制備本發(fā)明DNA。這樣的技術(shù)詳述于以下文獻(xiàn)中例如 Sambrook等，Molecular Cloning: A Laboratory Manual (分子克隆實(shí)驗(yàn) 手冊(cè))，Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989和A歸bel等，Current Protocols in Molecular Biology (現(xiàn)行分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)方案)，John Wiley & Sons, 1998,它們可用于制備本發(fā)明DNA。
首先，例如通過(guò)在含有蛋白胨、葡萄糖、酵母菌提取物等的培養(yǎng)基(例如YPD或YM培養(yǎng)基)中、于約25。C搖瓶培養(yǎng)來(lái)生長(zhǎng)休哈塔假 絲酵母，接著進(jìn)行基因組DNA抽提?；诶鏢EQIDNO:2的核香 酸序列設(shè)計(jì)并合成19-25個(gè)堿基長(zhǎng)的正向和反向引物。這些引物用于 在耐熱聚合酶和Mg"的存在下，以目的基因組DNA作為模板進(jìn)行 PCR擴(kuò)增。PCR條件包括例如在94。C處理1分鐘，隨后進(jìn)行大約35 個(gè)擴(kuò)增循環(huán)，每一循環(huán)包括94°C30秒(變性)、55°C30秒(退火)和72 。C3分鐘(延長(zhǎng)反應(yīng))，接著在72。C最后處理7分鐘。可通過(guò)瓊脂糖凝 膠電泳來(lái)確證目的DNA片段的成功擴(kuò)增。
將擴(kuò)增的目的DNA片段在根據(jù)需要而引入合適的限制性位點(diǎn)后， 插入到載體(例如質(zhì)粒)中，進(jìn)而將該載體引入到合適的宿主細(xì)胞以克 隆所迷DNA片段。載體可適當(dāng)?shù)睾袉?dòng)子、復(fù)制起始點(diǎn)、核糖體 結(jié)合位點(diǎn)或Shine-Dalgarno序列、終止子、多克隆位點(diǎn)、多聚腺苷酸 信號(hào)等。用于例如細(xì)菌的原核生物的載體或用于例如酵母菌或真菌的 真核生物的載體可用作所述載體。由于各種載體可市購(gòu)得到，可選擇 合適的載體來(lái)使用。此外，宿主細(xì)胞實(shí)例包括細(xì)菌(例如大腸桿菌(E co/仍和酵母菌。
定點(diǎn)突變技術(shù)包含合成含有變異位點(diǎn)的引物并使用該引物和作為 模板的含有目的DNA的載體來(lái)實(shí)施PCR。用該技術(shù)可制備包含SEQ ID NO: 2的核苦酸序列的DNA變體。
本發(fā)明進(jìn)一步提供包含上述DNA和能夠調(diào)控所述DNA的表達(dá)的 調(diào)控序列的核酸構(gòu)建體。
在本發(fā)明中，調(diào)控序列為能夠調(diào)控本發(fā)明DNA的表達(dá)的核苷酸序 列，包括例如啟動(dòng)子、增強(qiáng)子、多聚腺苷酸信號(hào)、復(fù)制起始點(diǎn)、核糖 體結(jié)合位點(diǎn)或Shine-Dalgarno序列和終止子。調(diào)控序列優(yōu)選含有啟動(dòng) 子的序列或含有終止子的序列。
根據(jù)本發(fā)明實(shí)施方案，調(diào)控序列來(lái)自宿主細(xì)胞。尤其是當(dāng)使如下 基因組序列位于與本發(fā)明異源DNA側(cè)翼以制備載體時(shí)，可通過(guò)同源 重組將本發(fā)明DNA序列摻入到該酵母菌細(xì)胞基因組中，所述基因組 序列是原本由酵母菌作為宿主攜帶的編碼木糖醇脫氫酶的基因的含 有5'_和3'-調(diào)控序列的基因組序列。
啟動(dòng)子可為組成型啟動(dòng)子或誘導(dǎo)型啟動(dòng)子。啟動(dòng)子不受特別限制， 可選自例如ADH1、 ADH2、 PDC、 GAL1/10、 TDH3和PGK1。根據(jù) 所選擇的啟動(dòng)子(例如所選擇的強(qiáng)啟動(dòng)子)，本發(fā)明DNA可在超過(guò)其起 源宿主微生物中的天然表達(dá)水平的表達(dá)水平表達(dá)。
載體的實(shí)例包括質(zhì)粒、粘粒、噬菌體、噬菌粒、BAC、 YAC和病 毒。在優(yōu)選實(shí)施方案中，所述載體為質(zhì)粒。所述載體適于在所期望的 宿主微生物中復(fù)制，因此可含有經(jīng)適當(dāng)選擇的例如啟動(dòng)子、增強(qiáng)子、 多聚腺苷酸信號(hào)、復(fù)制起始點(diǎn)、核糖體結(jié)合位點(diǎn)或Shine-Dalgarno序 列和終止子。此外，可將選擇性標(biāo)記例如藥物耐受基因(例如氨千青霉 素耐受基因)引入到所述載體中。
本發(fā)明還包括不僅包含木糖醇脫氫酶基因表達(dá)盒而且任選包含木 酮糖激酶基因表達(dá)盒和/或木糖還原酶基因表達(dá)盒的載體。木糖醇脫氫 酶基因可為例如編碼SEQIDNO: 1的多肽的DNA序列或編碼上述多 肽的變體、同系物或類似物的DNA序列。木酮糖激酶基因可為例如 編碼SEQ ID NO: 26的多肽的DNA序列或編碼上述多肽的變體、同 系物或類似物的DNA序列。木糖還原酶基因可為例如編碼SEQ ID NO: 24的多肽的DNA序列或編碼上述多肽的變體、同系物或類似物的DNA序列。
在本發(fā)明中，"表達(dá)盒"為通過(guò)將目的基因序列與啟動(dòng)子和終止子以 及用于在宿主中的基因表達(dá)所需要的其它調(diào)控序列可操作地連接而 制備的核酸構(gòu)建體。將構(gòu)建體引入宿主，藉此使宿主表達(dá)目的基因。 在本發(fā)明中，術(shù)語(yǔ)"可操作地連接"意指將調(diào)控序列與目的基因以使它 們能夠按所期望的方式作用于目的基因表達(dá)的方式連接。各基因的表 達(dá)可為連續(xù)的或同時(shí)的。這樣的本發(fā)明載體的構(gòu)建實(shí)例示于圖1中。 該載體可有效地用于利用木糖等作為原料的乙醇生產(chǎn)中。
本發(fā)明進(jìn)一步提供包含任何上述DNA、任何上述核酸構(gòu)建體或任 何上述載體的微生物，因此微生物表達(dá)具有木糖醇脫氫酶活性的多 肽。
將常規(guī)方法例如轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)導(dǎo)用于將載體引入到微生物細(xì)胞中。這 樣的方法包括例如磷酸鈣法、電穿孔法、原生質(zhì)體法和球形體法。
微生物的實(shí)例包括但不限于酵母菌、真菌和細(xì)菌。優(yōu)選微生物 選自以下酵母菌屬和細(xì)菌屬，所述酵母菌屬包括釀酒酵母屬、裂殖酵 母屬、許旺酵母屬，克魯維酵母屬、畢赤酵母屬、漢遜酵母屬、假絲 酵母屬、德巴利氏酵母屬、梅奇酵母屬、管嚢酵母屬或擬青霉屬，所 述細(xì)菌屬包括發(fā)酵單胞菌屬。優(yōu)選微生物為釀酒酵母或粟酒裂殖酵
母。
對(duì)于微生物，可將DNA或核酸構(gòu)建體摻入到宿主微生物基因組中。 可通過(guò)將來(lái)自宿主微生物基因組的序列連接至所述DNA或所述核酸 構(gòu)建體的上游或下游來(lái)達(dá)成基因組的摻入。適于將核苷酸序列引入宿 主細(xì)胞基因組的方法為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知。載體也可在細(xì)胞中與 宿主細(xì)胞基因組分別存在。在這種情況下，所述載體應(yīng)該能夠自主復(fù)制。
本發(fā)明微生物可進(jìn)一步含有編碼介導(dǎo)由木糖向乙醇的轉(zhuǎn)化過(guò)程的另一種酶的DNA。所述另一種酶為例如木糖還原酶或木酮糖激酶，優(yōu)選木糖還原酶。這樣的酶可來(lái)源于與本發(fā)明木糖醇脫氫酶的來(lái)源相同的微生物，或可來(lái)源于與其來(lái)源不同的微生物。此外，為了提高酶活性或熱穩(wěn)定可對(duì)微生物進(jìn)行突變處理(例如用諸如UV射線、Y射線或電離子束的高能射線輻照微生物或用例如亞硝基胍、亞硝基脲或亞硝酸的化學(xué)誘變劑處理)。
本發(fā)明進(jìn)一步提供用于生產(chǎn)木糖醇脫氫酶的方法。該方法包括如下步驟(a)在培養(yǎng)基中培養(yǎng)任何上述微生物；和(b)從微生物或培養(yǎng)基收集具有木糖醇脫氫酶活性的產(chǎn)物。例如，可通過(guò)超聲破碎微生物細(xì)胞實(shí)施從微生物收集產(chǎn)物。從培養(yǎng)基中收集產(chǎn)物需要將多肽在微生物細(xì)胞中翻譯，然后將該多肽分泌到細(xì)胞外。為此目的，例如，所述多肽可表達(dá)為在其上連接有氨基末端分泌信號(hào)。
可從適于微生物類型的條件中任意選擇微生物培養(yǎng)條件。培養(yǎng)基通常含有碳源、氮源和無(wú)機(jī)鹽。碳源的實(shí)例包括葡萄糖、麥芽糖、蔗糖、乳糖、淀粉和其它糖。氮源的實(shí)例包括含氮無(wú)機(jī)鹽(例如硫酸銨和硝酸銨)、蛋白胨、麥芽提取物和酵母菌提取物。無(wú)機(jī)鹽的實(shí)例包括堿金屬鹽、堿土金屬鹽和鐵族金屬鹽。培養(yǎng)方式包括靜態(tài)培養(yǎng)、搖瓶培養(yǎng)、通氣培養(yǎng)、連續(xù)培養(yǎng)等。培養(yǎng)溫度為約15-60°C，通常約25-40。C,但不限于該范圍。
例如，可通過(guò)在340 nm處于35。C測(cè)量NAD(P)+還原來(lái)測(cè)量所形成的酶的活性(Rizzi, M.等，J. Ferment. Bioeng. 67: 20-24 (1989))。標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)混合物為含有溶于50 mM Tris-HCl (pH 9.0)中的50 mM MgCl2和300 mM木糖醇的溶液。通過(guò)加入100 //1 20 mM NAD(P)+以1.0 ml的終體積開始反應(yīng)。酶活性可例如用1個(gè)單位(即，每分鐘產(chǎn)生1 //mol
NAD(P)H的酶活性)來(lái)表示。
可聯(lián)合使用蛋白質(zhì)化學(xué)的通用方法來(lái)純化木糖醇脫氫酶。這樣的方法的實(shí)例包括但不限于凝膠過(guò)濾、離子交換色語(yǔ)、親合色譜、疏水作用色譜、HPLC、電泳、等電聚焦、鹽析、硫酸銨分級(jí)分離、透析和超濾。
根據(jù)本發(fā)明實(shí)施方案，所述方法可進(jìn)一步包括選擇適于有效率的木酮糖發(fā)酵的微生物的步驟。結(jié)果，可獲得更有效率地催化木酮糖發(fā)酵的多肽?？衫缤ㄟ^(guò)如下方法評(píng)估木酮糖發(fā)酵的效率將微生物在含木糖或木糖醇的培養(yǎng)基中培養(yǎng)一段時(shí)間，然后測(cè)量培養(yǎng)基中含有的木糖的濃度。
本發(fā)明進(jìn)一 步提供用于利用任何上述微生物生產(chǎn)乙醇的方法?？蓪⑽⑸锕潭ㄔ谠试S微生物生長(zhǎng)的固相上。這樣的固相的實(shí)例包括但不限于聚合物，例如聚氨基曱酸酯及其衍生物；和多糖，例如藻酸鹽和角叉膠。
更優(yōu)選的用于乙醇生產(chǎn)的碳水化合物為木糖。因此，能夠發(fā)酵木糖的釀酒酵母、粟酒裂殖酵母和/或發(fā)酵單胞菌屬菌抹對(duì)于乙醇生產(chǎn)非常有優(yōu)勢(shì)。本發(fā)明酵母菌菌抹具有發(fā)酵濃縮碳水化合物溶液、的能力、高水平的乙醇耐受性和產(chǎn)生高濃度乙醇的能力。這些酵母菌菌林具有用于重復(fù)循環(huán)的高細(xì)胞存活力并表現(xiàn)出pH和溫度耐受性。在木糖生產(chǎn)步驟中，木糖作為廢品從木聚糖水解產(chǎn)物形成。木聚糖是半纖維素的主要成分。因此，將木糖用于生產(chǎn)乙醇和/或生物質(zhì)非常有利。此外，在本發(fā)明微生物中引入NAD(P)H依賴性木糖還原酶基因促進(jìn)木糖向木酮糖的轉(zhuǎn)化。在這種情況下，對(duì)于還原性反應(yīng)，該木糖還原酶尤其適于例如在用于氨基酸生產(chǎn)的生物反應(yīng)器中攜帶或再循環(huán)(從NADPH到NADP+)相應(yīng)的輔酶。實(shí)施例
本發(fā)明將參照以下實(shí)施例來(lái)進(jìn)一步闡述。然而，本發(fā)明范圍不限于這些實(shí)施例。
實(shí)施例l:來(lái)自休哈塔假絲酵母木糖醇脫氫酶基因的分離和測(cè)序
染色體DNA的分離
休哈塔假絲酵母NBRC1983 (CBS5813)購(gòu)自日本產(chǎn)品評(píng)估技術(shù)基礎(chǔ)機(jī)構(gòu)生物技術(shù)部門。釀酒酵母ATCC60715購(gòu)自美國(guó)模式培養(yǎng)物保藏所(American Type Culture Collection)。這些酵母菌通過(guò)在YPD培養(yǎng)基(2%蛋白胨、1%酵母菌提取物和2%葡萄糖)中、于25。C搖瓶培養(yǎng)來(lái)分別生長(zhǎng)直到靜止期。采用Dr. GenTLE (Takara Bio Inc., Otsu-shi,Shiga,日本)并按照其中隨附的方案從所得培養(yǎng)物分離染色體DNA。
休哈塔假絲酵母木糖醇脫氫酶基因核苷酸序列的測(cè)定
從核酸序列數(shù)據(jù)庫(kù)GenBank獲得樹干畢赤酵母和熱帶假絲酵母(0 "Ac/a /ra/ Zc"fc)木糖醇脫氫酶的DNA序列(登記號(hào)分別為DD278642和DQ201637)，用基因分析軟件Genetyx (Genetyx Corp.,東京，日本)對(duì)其進(jìn)行序列比較以獲得來(lái)自高度相似域的SEQ ID NO: 3和4的序列。將這兩個(gè)序列用作引物來(lái)實(shí)施PCR,其使用休哈塔假絲酵母NBRC983染色體DNA作為模板、使用TaKaRa Ex Taq (TakaraBio Inc.)并使用基因Amp PCR系統(tǒng)9700 (Applied Biosystems,日本)。反應(yīng)程序如下94。Cl分鐘、(94。C30秒、55°C30秒和72°C3分鐘)x35個(gè)循環(huán)和72°C7分鐘。在1%瓊脂糖凝膠上對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳。結(jié)果，觀察到擴(kuò)增的DNA片段為大約900 bp。
用TOPO TA克隆試劑盒(Invitrogen Corp.,東京，日本)將由此獲得的片段進(jìn)行克隆。從所獲得的轉(zhuǎn)化抹收集質(zhì)粒，用BigDye Terminatorv3.1循環(huán)測(cè)序試劑盒(Applied Biosystems Japan,東京，日本)對(duì)其進(jìn)行測(cè)序反應(yīng)。使用DNA遺傳分析儀3100 (Applied Biosystems Japan,東京，日本)測(cè)定核苦酸序列。從所得到的核苷酸序列獲得SEQ ID NO: 5和6的序列。
用各種限制酶切割休哈塔假絲酵母NBRC1983染色體DNA并自我連接，通過(guò)乙醇沉淀收集自我連接產(chǎn)物。實(shí)施使用該產(chǎn)物作為模板、使用SEQ ID NO: 5和6的序列作為引物并使用TaKaRa LA Taq(Takara Bio Inc.)的PCR。反應(yīng)程序如下94。Cl分鐘、(98°C20秒和68°C 10分鐘)x30個(gè)循環(huán)和72°C7分鐘。在1%瓊脂糖凝膠上對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳。結(jié)果，觀察到擴(kuò)增的DNA片段的大小為約2300 bp。
將由此獲得的片段用TOPO TA克隆試劑盒(Invitrogen Corp.,東京，日本)進(jìn)行克隆。從所獲得的轉(zhuǎn)化抹收集質(zhì)粒，用BigDye Terminatorv3.1循環(huán)測(cè)序試劑盒(Applied Biosystems Japan,東京，日本)進(jìn)行測(cè)序反應(yīng)。用DNA遺傳分析儀3100 (Applied Biosystems Japan,東京，曰本)測(cè)定核苷酸序列。
將獲得的核苷酸序列與先前獲得的對(duì)應(yīng)于木糖醇脫氫酶基因的部分序列的約900bp的核苷酸序列裝配，以獲得休哈塔假絲酵母木糖醇脫氫酶基因編碼區(qū)的核苷酸序列。結(jié)果示于SEQ ID NO: 2中。
實(shí)施例2:構(gòu)建木糖醇脫氫酶表達(dá)載體并將其引入酵母菌
按圖1所示程序構(gòu)建木糖醇脫氫酶表達(dá)載體。下文中將詳述該構(gòu)建。在該背景中，PCR條件如下所述94。Cl分鐘、(94。C30秒、55°C30秒和72°C3分鐘)x35個(gè)循環(huán)和72°C7分鐘。
用Kpnl和Sacl消4匕pBluescript II KS+ (Stratagene)，用Chroma SpinTE100 (Invitrogen Corp.)除去較短的片段。另一方面，通過(guò)在95。C加熱5分鐘使SEQIDNO:7和8的寡聚DNA變性，然后室溫中靜置以自動(dòng)退火。將該退火產(chǎn)物克隆到pBluescript II KS+的Kpnl-Sacl位點(diǎn)，以構(gòu)建包含被插入到pBluescript II KS+的Kpnl和Sacl位點(diǎn)之間的Nhel和Spel位點(diǎn)的載體pBSNS。
基于SEQ ID NO: 2的序列制備用于擴(kuò)增休哈塔假絲酵母木糖醇脫氫酶基因的引物(SEQ ID NO: 17和18)?；跇涓僧叧嘟湍傅幕蚪M序列制備SEQ ID NO: 6-16， 19和20的寡聚DNA。
如下獲得TDH3啟動(dòng)子片段(PsTDH3p):將SEQ ID NO: 9和IO的寡聚DNA組合和SEQ ID NO: 11和12的寡聚DNA組合分別用作引物，以實(shí)施使用樹干畢赤酵母染色體DNA作為模板PCR。用凝膠過(guò)濾柱從分別獲得的產(chǎn)物除去引物。將這兩個(gè)產(chǎn)物混合并在使用SEQ IDNO: 9和12的寡聚DNA作為引物的PCR中用作模板，以獲得TDH3啟動(dòng)子片^:。獲得的啟動(dòng)子片段在5'端具有Nhel位點(diǎn)，在該序列的3'端按照BamHI和Apal的順序具有所述位點(diǎn)，而且，在啟動(dòng)子序列內(nèi)沒(méi)有Nhel。
通過(guò)使用SEQ ID NO: 13和14的寡聚DNA的組合作為引物并使用樹干畢赤酵母染色體DNA作為模板的PCR獲得TDH3終止子片段(PsTDH3t)。所獲得的終止子片段在該序列的5'端具有按照BamHI和Apal的順序具有所述位點(diǎn)，并且在3'端具有Spel位點(diǎn)。
將這些片段設(shè)計(jì)為使TDH3啟動(dòng)子片段的3'端與TDH3終止子的5'端匹配。將這兩個(gè)片段混合并在使用SEQ ID NO: 9和14的寡聚DNA作為引物的PCR中用作模板，以制備包含經(jīng)由BamHI和Apal位點(diǎn)連接的TDH3啟動(dòng)子和TDH3終止子的片段。經(jīng)由5'端的Nhel位點(diǎn)和3'端的SpeI位點(diǎn)將所獲得的片段插入pBSNS的Nhel-Spel位點(diǎn)，以構(gòu)建pPsExpBS。
如下獲得不含原本存在于序列中的Xbal位點(diǎn)的樹干畢赤酵母木酮糖激酶基因片段(PsXYL3; SEQ ID NO: 25):將SEQ ID NO: 19和20的寡聚DNA組合和SEQ ID NO: 21和22的寡聚DNA組合分別用作引物，以實(shí)施使用樹干畢赤酵母染色體DNA作為模板的PCR。用凝膠過(guò)濾柱從分別獲得的產(chǎn)物除去引物。將這兩個(gè)產(chǎn)物混合并在使用SEQ ID NO: 19和22的寡聚DNA作為引物的PCR中用作模板，以獲得樹干畢赤酵母木酮糖激酶基因片段(PsXYL3; SEQ ID NO: 25)。從所獲得的DNA片段的核苷酸序列翻譯的木酮糖激酶蛋白的氨基酸序列示于SEQ ID NO: 26。
所獲得的各基因片段CsXYL2、 PsXYLl和PsXYL3在5'端具有BamHI位點(diǎn)，而在3'端具有Apal位點(diǎn)。將各個(gè)基因片段經(jīng)由這些限制性位點(diǎn)插入到載體pPsExpBS的BamHI-ApaI位點(diǎn)。將所獲得的載體分別命名為CsXYL2ExpBS、 PsXYLlExpBS和PsXYL3ExpBS。
將CsXYL2ExpBS用Spel消化，并隨后進(jìn)行去磷酸化反應(yīng)。將從PsXYL3ExpBS制備的Nhel-Spel片段(含有PsXYL3表達(dá)盒)連接至經(jīng)消化的CsXYL2ExpBS的Spel位點(diǎn)，以獲得包含以相同方向插入到CsXYL2表達(dá)盒3'端的PsXYL3表達(dá)盒的質(zhì)粒CPxBS。然后，將CPxBS用SpeI消化，并隨后進(jìn)行去磷酸化反應(yīng)。將從PsXYLlExpBS制備的 Nhel-Spel片段(含有PsXYLl表達(dá)盒)連接至經(jīng)消化的CPxBS的Spel 位點(diǎn)，以獲得包含按如下順序以相同方向插入的CsXYL2表達(dá)盒、 PsXYL3表達(dá)盒和PsXYLl表達(dá)盒的質(zhì)粒CPPxBS。
用Nhel和Spel消化CPPxBS，純化含有CsXYL2表達(dá)盒、PsXYL3 表達(dá)盒和PsXYLl表達(dá)盒的Nhel-Spel片段，將其插入到pYES2的Spel 位點(diǎn)(Invitrogen Corp.)，以獲得CPPxYES。
按標(biāo)準(zhǔn)方法用葡萄酒酵母Kyokai No, 3 (日本釀造協(xié)會(huì))獲得ura3 變體菌林KY1094。通過(guò)鋰法將CPPxYES或pYES2引入KY1094。結(jié) 果，獲得包含載體(CPPxYES)的釀酒酵母轉(zhuǎn)化抹，以及包含載體pYES2 的釀酒酵母轉(zhuǎn)化抹(對(duì)照)，所述載體(CPPxYES)包含按如下順序以相 同方向插入的CsXYL2表達(dá)盒、PsXYL3表達(dá)盒和PsXYLl表達(dá)盒， 所述載體pYES2未插入上述表達(dá)盒。
實(shí)施例3:木糖醇脫氬酶活性的測(cè)量
如下所示對(duì)獲得的釀酒酵母轉(zhuǎn)化林進(jìn)行木糖醇脫氫酶活性測(cè)量。
為了預(yù)培養(yǎng)，將菌林接種到含2 mL SD-ura (2%葡萄糖)的各測(cè)試管 中，并于25。C搖瓶培養(yǎng)24小時(shí)。將含菌抹的200 預(yù)培養(yǎng)液接種到 含5 mL SD-ura (2%葡萄糖)的各測(cè)試管中，并于25°C以120 rpm進(jìn)行 主培養(yǎng)24小時(shí)。培養(yǎng)后，將酵母菌離心收集，用lOOmM磷酸鈉緩沖 液(pH7.0)、1 mM EDTA和5mM巰基乙醇洗滌，然后重新懸浮于1 mL 同樣的緩沖液中。向該酵母菌混懸液中加入1 g212-300微米的玻璃珠 (SIGMA)，并用MIX-TOWER A14 (TAIYO)于4。C破碎酵母菌15分鐘。 在4。C以120 rpm離心5分鐘后，收集上清液，用作粗酶溶液。通過(guò) Bradford法測(cè)量該粗酶溶液的蛋白質(zhì)濃度。用牛血清白蛋白作為標(biāo)準(zhǔn) 蛋白。
于30。C在含有100 mM Tris-HCl (pH 8.0)、 5 mM氯化鎂、3 mM NAD+、 100 mM木糖醇和5Q/。 (v/v)粗酶溶液的反應(yīng)系統(tǒng)中反應(yīng)10分 鐘。在340 nm波長(zhǎng)處測(cè)量吸光率。用NADH制備校準(zhǔn)曲線，1單位 酶活性計(jì)算為每mg蛋白1分鐘產(chǎn)生1 //molNADH的酶水平(比活)。 結(jié)果如下所示。在本文中，數(shù)值以9份結(jié)果的平均數(shù)土標(biāo)準(zhǔn)偏差來(lái)表 示。 [表l〗
菌抹比活 (戶ol/min'mg蛋白質(zhì))
CPP x YES1.878 ±0.166
pYES0.000 ± 0扁
僅在如下菌抹中檢測(cè)到酶活性，所述菌抹經(jīng)攜帶包含休哈塔假絲 酵母木糖醇脫氬酶基因的表達(dá)盒的載體轉(zhuǎn)化。這證明由休哈塔假絲酵 母木糖醇脫氬酶基因表達(dá)的蛋白質(zhì)具有所期望的活性。
工業(yè)上的可應(yīng)用性
本發(fā)明DNA和微生物可用于生物乙醇生產(chǎn)、生物質(zhì)生產(chǎn)、食品工業(yè)等。
序列表的自由文本
SEQIDNO:3、 4和7-22:引物
權(quán)利要求
1.編碼選自以下多肽的DNA(a)包含SEQ ID NO1的氨基酸序列并具有木糖醇脫氫酶活性的多肽；(b)包含與SEQ ID NO1的氨基酸序列的同一性為90％以上的氨基酸序列并具有木糖醇脫氫酶活性的多肽；和(c)包含在SEQ ID NO1的氨基酸序列中置換、缺失、插入或增加一個(gè)或多個(gè)氨基酸的氨基酸序列并具有木糖醇脫氫酶活性的多肽。
2. 權(quán)利要求1的DNA,其中，所述DNA包含SEQ ID NO: 2的 核苦酸序列。
3. 權(quán)利要求1的DNA,其中，所述DNA包含由于遺傳密碼的 簡(jiǎn)并而不同于SEQ ID NO: 2的核苷酸序列的序列。
4. 權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)的DNA，其中，所述DNA來(lái)自酵母菌。
5. 權(quán)利要求4的DNA,其中，所述酵母菌為休哈塔假絲酵母
6. 權(quán)利要求5的DNA，其中，所述酵母菌為休哈塔假絲酵母 CBS5813(NBRC1983)。
7. 核酸構(gòu)建體，其包含權(quán)利要求l-6任一項(xiàng)的DNA和能夠在宿 主細(xì)胞中調(diào)控所述DNA的表達(dá)的調(diào)控序列。
8. 權(quán)利要求7的核酸構(gòu)建體，其中，所述DNA編碼SEQ ID NO: 1的氨基酸序列。
9. 權(quán)利要求8的核酸構(gòu)建體，其中，所述DNA包含SEQ ID NO: 2的核苷酸序列。
10. 權(quán)利要求7-9中任一項(xiàng)的核酸構(gòu)建體，其中，所述調(diào)控序列 來(lái)自宿主細(xì)胞。
11. 權(quán)利要求7-9中任一項(xiàng)的核酸構(gòu)建體，其中，所述調(diào)控序列 為啟動(dòng)子。
12. 權(quán)利要求11的核酸構(gòu)建體，其中，所述啟動(dòng)子為組成型啟 動(dòng)子或誘導(dǎo)型啟動(dòng)子。
13. 權(quán)利要求11或12的核酸構(gòu)建體，其中，所述啟動(dòng)子選自 ADH1、 ADH2、 PDC、 GAL1/10、 TDH3和PGK1啟動(dòng)子。
14. 載體，其包含權(quán)利要求1-6中任一項(xiàng)的DNA或權(quán)利要求7-13 中任一項(xiàng)的核酸構(gòu)建體。
15. 權(quán)利要求14的載體，其中，所述載體為質(zhì)粒。
16. 微生物，其包含權(quán)利要求1-6中任一項(xiàng)的DNA、權(quán)利要求 7-13中任一項(xiàng)的核酸構(gòu)建體或權(quán)利要求14或15的載體，因此所述微 生物表達(dá)具有木糖醇脫氫酶活性的多肽。
17. 權(quán)利要求16的微生物，其中，所述微生物為酵母菌或細(xì)菌。
18. 權(quán)利要求17的微生物，其中，所述酵母菌或細(xì)菌選自以下 酵母菌屬和細(xì)菌屬，所述酵母菌屬包括釀酒酵母屬(SaccAaromFM)、 裂殖酵母屬(Sc/n'zc^acc/wrawycas)、許旺酵母屬OSc/zwa""z'o附少cas)、克 魯維酵母屬(幻w"eraw^yce力、畢赤酵母屬(尸z'c/n'a)、漢遜酵母屬 (//a/we"w/fl)、假絲酵母屬(Caw/Wa)、德巴利氏酵母屬(Z)eZ o^ow;/c")、 梅奇酵母屬(Metec/z"汰ovWa)、管嚢酵母屬(尸ac/^o/e")或擬青霉屬 (尸ae"7omyce力，所述細(xì)菌屬包括發(fā)酵單胞菌屬(Z少momo"w)。
19. 權(quán)利要求18的微生物，其中，所述微生物為釀酒酵母
20.權(quán)利要求18的微生物，其中，所述微生物為粟酒裂殖酵母
21. 權(quán)利要求16-20中任一項(xiàng)的微生物，其中，將所述DNA或 所述核酸構(gòu)建體摻入到所述宿主微生物的基因組中。
22. 用于生產(chǎn)木糖.醇脫氫酶的方法，其包括以下步驟(a) 在培養(yǎng)基中培養(yǎng)權(quán)利要求16-21中任一項(xiàng)的微生物；和(b) 從所述微生物或所述培養(yǎng)基收集具有木糖醇脫氫酶活性的產(chǎn)
23. 權(quán)利要求22的方法，其進(jìn)一步包括選擇適于木酮糖發(fā)酵的 微生物的步驟。
24. 使用權(quán)利要求16-21中任一項(xiàng)的微生物生產(chǎn)乙醇的方法。
25. 載體，其包含含有權(quán)利要求1的DNA的木糖醇脫氫酶基因 表達(dá)盒、木糖還原酶基因表達(dá)盒和木酮糖激酶基因表達(dá)盒。
全文摘要
本發(fā)明涉及編碼新的木糖醇脫氫酶的DNA和該DNA的應(yīng)用。具體而言，本發(fā)明獲得了來(lái)自休哈塔假絲酵母(Candida shehatae)的木糖醇脫氫酶基因的核酸序列，并將該基因引入到宿主細(xì)胞，藉此生產(chǎn)能夠利用木糖的微生物。
文檔編號(hào)C12N15/09GK101652477SQ20088001130
公開日2010年2月17日 申請(qǐng)日期2008年2月1日 優(yōu)先權(quán)日2007年2月2日
發(fā)明者小林統(tǒng), 玉川英幸 申請(qǐng)人:麒麟控股株式會(huì)社