專利名稱：粳稻木糖異構(gòu)酶基因的功能及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及粳稻木糖異構(gòu)酶基因轉(zhuǎn)化木糖為木酮糖的功能，本發(fā)明還涉及含該基因的重組質(zhì)粒及工程菌株，以及用該工程菌通過發(fā)酵含有木糖的培養(yǎng)基制備こ醇和其他發(fā)酵產(chǎn)物的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
將木質(zhì)素纖維素以產(chǎn)業(yè)化方式生產(chǎn)こ醇是既經(jīng)濟又環(huán)保的方式。因為來自植物的 木質(zhì)纖維素原料是可以大量獲得的可再生資源。但是許多能夠發(fā)酵生產(chǎn)こ醇的酵母(如釀酒酵母)并不能以木糖作為碳源。因此，需要提供能夠利用木糖作為碳源進行こ醇發(fā)酵的酵母。如果能夠?qū)⒅参锏哪举|(zhì)纖維素中的木糖異構(gòu)化，生成木酮糖，木糖就可以作為碳源進行こ醇發(fā)酵。木糖異構(gòu)化所需的木糖異構(gòu)酶(D-xylose isomerase, XI)催化五碳糖D-木糖轉(zhuǎn)化為D-木酮糖，廣泛存在于細菌、少部分真菌中。釀酒酵母具有木酮糖代謝的完整酶系，木酮糖進入磷酸戊糖途徑，發(fā)酵生成こ醇。如果發(fā)現(xiàn)新的可在釀酒酵母里高效表達的木糖異構(gòu)酶，釀酒酵母就能夠?qū)⒛咎钱悩?gòu)化成木酮糖，達到可利用木糖作為碳源進行こ醇發(fā)酵的目的?，F(xiàn)有技術(shù)的木糖異構(gòu)酶基因多來自于微生物。曾有人分別克隆表達了多種來源的木糖異構(gòu)酶 3 因，如 Escherichia coli,Baci 丄丄 us subtil is, Thormotoga species, Thermusspecies等等。但迄今為止只有少數(shù)幾種且多為嗜熱細菌的木糖異構(gòu)酶基因在こ醇生產(chǎn)傳統(tǒng)菌株釀酒酵母中得到活性表達，而且在30°C左右的こ醇發(fā)酵溫度下普遍由于活性太低而成為木糖代謝途徑的限速步驟。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是從植物中篩選出新的木糖異構(gòu)酶基因，并將該基因?qū)脶劸平湍?，使所得到的酵母遺傳工程菌獲得將木糖轉(zhuǎn)化為木酮糖的能力。本發(fā)明人通過分析數(shù)據(jù)庫粳稻基因組序列的方式，首次從粳稻基因組序列中發(fā)現(xiàn)了具有木糖異構(gòu)化功能的基因(GenBank NO. 4344231)，并將其命名為“粳稻木糖異構(gòu)酶基因”，其編碼的木糖異構(gòu)酶在宿主細胞中表達后，賦予宿主細胞將木糖轉(zhuǎn)化為木酮糖的能力?，F(xiàn)有技術(shù)的文獻僅在轉(zhuǎn)錄水平上證實了該基因的存在，但對其所具有何種功能，以及可利用該基因做何種用途的研發(fā)，尚未見到有文獻報道。本發(fā)明構(gòu)建了具有上述粳稻木糖異構(gòu)酶基因的重組質(zhì)粒，并將該質(zhì)粒導(dǎo)入了釀酒酵母中，獲得了一種新的酵母工程菌。經(jīng)實驗證實，原來不具備轉(zhuǎn)化木糖為木酮糖的能力的釀酒酵母賦予了該轉(zhuǎn)化能力。具體地說，本發(fā)明進行了如下工作I.提取粳稻mRNA，反轉(zhuǎn)錄生成cDNA，用保守引物克隆得粳稻木糖異構(gòu)酶基因，其大小為1440bp ；2.將粳稻木糖異構(gòu)酶基因片段連接到具有高效表達活性的pYES2質(zhì)粒載體中，構(gòu)建具有完整木糖異構(gòu)酶基因的重組質(zhì)粒PYES-RXI ；3.將含木糖異構(gòu)酶基因的重組質(zhì)粒pYES-RXI通過電擊轉(zhuǎn)化方法導(dǎo)入不具將木糖轉(zhuǎn)化為木酮糖的能力的釀酒酵母中，獲得能夠?qū)⒛咎寝D(zhuǎn)化為木酮糖的遺傳工程酵母菌株R (詳見實施例5)。因此本發(fā)明的木糖異 構(gòu)酶基因有益效果是粳稻木糖異構(gòu)酶基因賦予宿主細胞將木糖轉(zhuǎn)化為木酮糖的能力。且粳稻木糖異構(gòu)酶基因工程菌株的木糖利用率可達57. 39%，大大高于對照菌株。(詳見實施例6)
具體實施例方式以下實施例中所舉的質(zhì)粒、菌株只是用于對本發(fā)明作進ー步詳細說明，并不對本發(fā)明的實質(zhì)內(nèi)容加以限制。實際上，用本發(fā)明發(fā)現(xiàn)的基因和方法，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以得到其它多種具有將木糖轉(zhuǎn)化為木酮糖能力的遺傳工程菌株，均不能脫離本發(fā)明的精神和思路。以下實施例中未作具體說明的分子生物學(xué)實驗方法，均參照《分子克隆實驗指南》(第三版)J.薩姆布魯克ー書中所列的具體方法進行，或者按照試劑盒和產(chǎn)品說明書進行。試驗材料和試劑I、菌株及載體釀酒酵母表達載體pYES2購自Invitrogen公司，釀酒酵母菌株CEN.PK113-ro(——*:MatAura3-52)及大腸桿菌DH5 α由所在實驗室保存。2、酶類及其它生化試劑內(nèi)切酶及連接酶購自NEB公司，其它試劑如未作具體說明都為國產(chǎn)試劑(均可從普通生化試劑公司購買得到)。3、培養(yǎng)基(I)大腸桿菌培養(yǎng)基1^(1%蛋白胨、0.5%酵母提取物、1%似(1，？!17.0)。(2)酵母培養(yǎng)基YPD(1 %酵母提取物、2%蛋白胨、2%葡萄糖，平板添加2%瓊脂)(3)選擇培養(yǎng)基SC(0. 67% YNB、2%葡萄糖，平板添加2%瓊脂)實施例I獲取粳稻cDNA(一 )植物總 RNA 提取-Trizol 法I、將組織在液氮中磨成粉末后，取50_100mg組織，加入ImlTrizol液研磨，注意樣品總體積不能超過所用Trizol體積的10%。2、研磨液室溫放置5min,然后加入O. 2ml氯仿,蓋緊離心管,用手劇烈搖蕩離心管15s03、取上層水相于一新的離心管，加入O. 5ml異丙醇，室溫放置lOmin，12000g離心IOmin04、棄去上清液,加入1111175%こ醇，潤旋混勻，4°C下7500g離心5min。5、小心棄去上清液，然后室溫或真空干燥5-10min，注意不要干燥過分，否則會降低RNA的溶解度。然后將RNA溶于水中，必要時可55°C _60°C水溶IOmin。RNA可進行mRNA分離，或貯存于70 %こ醇并保存于_70°C。(ニ)mRNA 提取
由于mRNA末端含有多poly⑷+,當(dāng)總RNA流經(jīng)oligo(dT)纖維素時,在高鹽緩沖液作用下，mRNA被特異的吸附在ο I i go (dT)纖維素柱上，在低鹽濃度或蒸餾水中，mRNA可被洗下，經(jīng)過兩次oligo (dT)纖維素柱，可得到較純的mRNA。I、用 O. IMNaOH 懸浮 O. 5-1. Og oligo (dT)纖維素。2、將懸浮液裝入滅菌的一次性層析柱中或裝入填有經(jīng)DEPC處理并經(jīng)高壓滅菌的玻璃棉的巴斯德吸管中，柱床體積為O. 5-1. 0ml，用3倍柱床體積的滅菌水沖洗柱床。3、用IX柱層析加樣緩沖液沖洗柱床，直到流出液的pH值小于8. O。4、將(一)中提取的RNA液于65°C溫育5min后迅速冷卻至室溫，加入等體積2 X柱層析緩沖液,上樣,立即用滅菌試管收集洗出液,當(dāng)所有RNA溶液進入柱床后，加入I倍柱床體積的IX層析柱加樣溶液。5、測定每一管的OD26tl,當(dāng)洗出液中OD26tl為O時，加入2_3倍柱床體積的滅菌洗脫緩沖液，以1/3至1/2柱床體積分管收集洗脫液。6、測定0D·，合并含有RNA的洗脫組分。7、加入1/10體積的3MNaAc (pH5. 2), 2. 5倍體積的冰冷こ醇，混勻，_20°C 30min。8、4°C下12000g離心15min,小心棄去上清液,用70%こ醇洗漆沉淀,4°C下12000g離心5min。9、小心棄去上清液,沉淀空氣干燥IOmin,或真空干燥lOmin。10、用少量水溶解RNA液，即可用于cDNA合成(或保存在70 %こ醇中并貯存于-70 0C )。(三)反轉(zhuǎn)錄生成cDNAI、在冰浴的試管中加入如下反應(yīng)混合物模板RNA 1-5 μ g 總 RNA (DNase 處理后)引物oligo(dT)無RNA 酶去離子水(RNase-free ddH20):定容至 12 μ I。2、輕輕混勻后離心3_5s。反應(yīng)混合物在70°C水浴5min后，冰浴30s，然后離心3
5s03、將試管冰浴，再加入如下組分5 X Reaction Buffer 4 μ IRNasin (20U/μ I) :1 μ IdNTP mix (IOmM) :2 μ I4、輕輕混勻后離心3-5s。37°C水浴5min，加入I μ IMMLV(20U/μ I)，終體積為20 μ I。5、反應(yīng)混合物37°C水浴60min。在70°C加熱IOmin結(jié)束反應(yīng)，置冰上進行后續(xù)實
驗或冷凍保存。實施例2木糖異構(gòu)酶基因的序列用保守引物從反轉(zhuǎn)錄得到的粳稻cDNA中克隆到ー個約I. 5kb的片段，測序分析發(fā)現(xiàn)含有ー個1440bp的ORF序列，比對證實是粳稻的木糖異構(gòu)酶基因(GenBank登錄號4344231)。DNA測序由上海生エ生物公司完成，核苷酸和氨基酸分析軟件主要為DNAMAN、和美國國家生物技術(shù)信息中心(http://www. ncbi. nlm. nih. gov/, National CenterforBiotechnology Information, NCBI)的 Blast 程序。實施例3木糖異構(gòu)酶基因表達載體質(zhì)粒的構(gòu)建用編碼粳稻木糖異構(gòu)酶的基因的5’和3’端序列設(shè)計引物，包括Mfe I和Spe I位點。用Mfe I和Spe I酶切PCR產(chǎn)物。終產(chǎn)物被克隆到由pYES2產(chǎn)生的載體上。在該載體中，pYES2上的GAU啟動子用TPIl啟動子替換來確保木糖異構(gòu)酶的組成型表達，從而消除培養(yǎng)基中對半乳糖的需求。TPIl啟動子從釀酒酵母基因組克隆得到。該啟動子被酶切成Nhe I-EcoR I片段。TPIl啟動子和木糖異構(gòu)酶的編碼基因的PCR產(chǎn)物都被連接到用Spe I和Xba I剪切的pYES2上，最終得到含木糖異構(gòu)酶基因的重組質(zhì)粒pYES-RXI。大腸桿菌感受態(tài)細胞的制備及質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化I)感受態(tài)細胞的制備(氯化鈣轉(zhuǎn)化法)①從活化的大腸桿菌(E. coli)BL21平板上挑取單菌落接種到含5ml的LB液體培養(yǎng)基的試管中，37°C振蕩培養(yǎng)2. 5h至3h使菌液的0D_值達到O. 4至O. 6，冰上冷卻培養(yǎng)物至(TC②將培養(yǎng)物倒入無菌的I. 5ml的離心管中③4°C, 4000rpm 離心 IOmin④棄上清，收集菌體⑤用預(yù)冷的0. 5ml的0. IM的CaCl2重懸菌體,離心,棄上清⑥用預(yù)冷的0. 5ml的0. IM的CaCl2重懸菌體，冰浴15min，離心，棄上清⑦加入200 μ I的預(yù)冷的0. IM的CaCl2重懸菌體，冰浴放置2)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞①取0. 5ul質(zhì)粒加于一管感受態(tài)細胞中，輕輕旋轉(zhuǎn)以混勻內(nèi)容物，冰上放置30min②將離心管置于42°C水浴中熱激90s，不要晃動離心管③迅速將離心管置于冰上，冷卻2min④加入800ul的LB液體培養(yǎng)基，37°C，200rpm搖床培養(yǎng)45min⑤取50ul的培養(yǎng)液涂布于含氨芐青霉素(50 μ g/ml)的LB固體平板上，37°C培養(yǎng)12至16小時，檢查轉(zhuǎn)化菌落 ⑥挑選單菌落，接種到含5ml的LB液體培養(yǎng)基的試管中，37°C振蕩培養(yǎng)提取質(zhì)粒酶切驗證為正確的轉(zhuǎn)化子，然后測序證明含有木糖異構(gòu)酶基因。實施例4工程菌株的構(gòu)建將含木糖異構(gòu)酶基因的重組質(zhì)粒pYES-RXI經(jīng)電擊轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)入不具將木糖轉(zhuǎn)化為木酮糖能力的釀酒酵母CEN. PK113-5D中，在以2%葡萄糖作為碳源的SC培養(yǎng)基平板上篩選轉(zhuǎn)化子。未被轉(zhuǎn)化的細胞不能在這些平板上生長。PCR鑒定證明R轉(zhuǎn)化子含有帶粳稻木糖異構(gòu)酶基因的質(zhì)粒。釀酒酵母感受態(tài)細胞的制備及質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化I)酵母感受態(tài)細胞的制備(電擊轉(zhuǎn)化法)①在含5mlYPD的50ml離心管中，培養(yǎng)釀酒酵母，30°C過夜②取0. 1-0. 5ml過夜培養(yǎng)物，接種含500ml新鮮培養(yǎng)基的2L搖瓶，過夜生長至OD600 = I- 3-1. 5
③在4°C，1500g離心5min收集細胞，用500ml預(yù)冷的滅菌水懸浮細胞④如上離心，用250ml預(yù)冷的滅菌水懸浮細胞⑤如上離心，用20ml預(yù)冷的IM山梨醇懸浮細胞⑥如上離心，用Iml預(yù)冷的IM山梨醇懸浮細胞，至終體積約I. 5ml注意可凍存80ul等量的電感受態(tài)細胞，但轉(zhuǎn)化效率會下降很多2)質(zhì)粒電擊轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞①取80ul上述細胞與5-20ug線性化DNA (溶于5-10ulTE)混合，轉(zhuǎn)入預(yù)冷的O. 2cm電轉(zhuǎn)杯中。②在冰上放置5min③根據(jù)所使用裝置推薦的釀酒酵母參數(shù)進行電擊④立即加入Iml預(yù)冷的IM山梨醇至杯中，將內(nèi)容物轉(zhuǎn)移至滅菌離心管中⑤分成200-600ul等份，涂于SC平板上⑥在30度孵育平板至克隆產(chǎn)生，PCR鑒定證明轉(zhuǎn)化子R含有帶粳稻木糖異構(gòu)酶基因的質(zhì)粒pYES-RXI。實施例5工程菌株木糖異構(gòu)酶酶活的測定I、實驗對象實驗菌株含pYES-RXI釀酒酵母重組菌株R ；對照菌株含pYES2空載體的釀酒酵母菌株。2、實驗方法在以葡萄糖/木糖的混合物為唯一碳源的衡化培養(yǎng)生長，分別測定對照菌株和含pYES-RXI釀酒酵母重組株R的木糖異構(gòu)酶酶活。酶活的測定按如下方法進行適當(dāng)釀酒酵母細胞破碎后的上清液(通過OD595測定調(diào)整為總蛋白量一致)IOOmMTris-HCl ρΗ7· O 緩沖液，IOmMMgCl2, 2U SDH (山梨醇脫氫酶，Roche 公司)和
O.15mMNADH(還原型煙胺酸腺嘌呤二核苷酸，Roche公司)，混勻，500mM的木糖啟動反應(yīng)，30°C、340nm下檢測NADH被氧化的量(即在340nm做時間掃描)。木糖異構(gòu)酶(XI)的ー個酶活單位(U)定義為每分鐘轉(zhuǎn)化I μ mo I底物。
3、具體操作過程①分別挑取單菌落接種在20ml的SC培養(yǎng)液中，30°C 200rpm搖培48h ；②1600g 離心 5min,棄上清，沉淀用 IOmM pH7. 5 的 potassium-phosphatebuffer(含 2mM EDTA)洗兩次；③重懸于IOOmM pH 7. 5 的 potassium-phosphate buffer(2mM MgCl2 和ImMdithiothreitoI)；④超聲破碎，4度36000g離心20min，上清用做酶活分析和總蛋白測定。4、測定結(jié)果對照菌株未測出木糖異構(gòu)酶酶活；含pYES-RXI釀酒酵母重組株木糖異構(gòu)酶酶活測定為0. 64U/mg總蛋白。5、結(jié)論粳稻木糖異構(gòu)酶基因編碼的木糖異構(gòu)酶在釀酒酵母中表達后，賦予宿主細胞將木糖轉(zhuǎn)化為木酮糖的能力。
實施例6工程菌株木糖利用的測定I、實驗對象實驗菌株含PYES-RXI釀酒酵母重組菌株R ；對照菌株含pYES2空載體的釀酒酵母菌株。2、實驗方法在以葡萄糖/木糖的混合物(初始濃度分別為5. Og/L和7. 5g/L)為卩隹一碳源的衡化培養(yǎng)生長，30°C 200rpm搖培48h，高效液相色譜法(HPLC)測定上清葡萄糖和木糖含量， 推算糖利用效率。3、結(jié)果測試結(jié)果顯示經(jīng)過48h培養(yǎng)，重組菌株R培養(yǎng)基的葡萄糖幾乎完全利用完，木糖利用率達到57. 39% ;對照菌株培養(yǎng)基的葡萄糖幾乎完全利用完，木糖利用率僅達到
3.02%。4、結(jié)論粳稻木糖異構(gòu)酶基因工程菌株的木糖利用率大大高于對照菌株。
權(quán)利要求
1.粳稻木糖異構(gòu)酶基因(GenBankNO. 4344231)的用途，其編碼的木糖異構(gòu)酶在宿主細胞中表達后，賦予宿主細胞將木糖轉(zhuǎn)化為木酮糖的能力。
2.權(quán)利要求I所述的用途，所述宿主細胞是釀酒酵母。
3.含粳稻木糖異構(gòu)酶基因的重組質(zhì)粒，是粳稻木糖異構(gòu)酶基因(GenBankNO. 4344231)連接到在釀酒酵母中具有表達特性的質(zhì)粒中。
4.權(quán)利要求3所述的重組質(zhì)粒，所述具有表達特性的質(zhì)粒是釀酒酵母表達載體PYES2。
5.ー種酵母工程菌，含有權(quán)利要求3或4所述的重組質(zhì)粒。
6.權(quán)利要求5所述酵母工程菌的用途，是轉(zhuǎn)化木糖生成木酮糖。
7.權(quán)利要求5所述酵母工程菌的用途，是通過發(fā)酵含有木糖的物質(zhì)制備こ醇和其他發(fā)酵產(chǎn)物。
全文摘要
本發(fā)明發(fā)現(xiàn)了粳稻的木糖異構(gòu)酶基因具有轉(zhuǎn)化木糖為木酮糖的功能。本發(fā)明構(gòu)建了包含該基因的重組質(zhì)粒，并將該質(zhì)粒導(dǎo)入了釀酒酵母中，獲得了一種新的酵母工程菌。經(jīng)實驗證實，將木糖異構(gòu)酶基因在宿主細胞及中表達后，原來不具備轉(zhuǎn)化木糖為木酮糖的能力的釀酒酵母獲得了該轉(zhuǎn)化能力。
文檔編號C12R1/865GK102643844SQ201110041928
公開日2012年8月22日 申請日期2011年2月21日 優(yōu)先權(quán)日2011年2月21日
發(fā)明者李佳英, 王智, 路明, 頓寶慶 申請人:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所