專(zhuān)利名稱(chēng)：木糖異構(gòu)酶基因及其在戊糖發(fā)酵中的用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及編碼木糖異構(gòu)酶的核酸序列在轉(zhuǎn)化真核微生物宿主細(xì)胞用以賦予該宿主細(xì)胞將木糖異構(gòu)化為木酮糖的能力中的用途。經(jīng)轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞被用于通過(guò)含戊糖培養(yǎng)基的發(fā)酵來(lái)產(chǎn)生乙醇及其它發(fā)酵產(chǎn)物的方法。
背景技術(shù)：
經(jīng)濟(jì)上可行地從植物生物質(zhì)的半纖維素部分中生產(chǎn)乙醇需要以相對(duì)等的速率并且以高產(chǎn)量同時(shí)轉(zhuǎn)化戊糖和己糖。酵母，特別是糖酵母(Saccharomyces spp.)，對(duì)于這種方法是最合適的候選，因?yàn)槠淇梢栽诩禾巧显谛柩鹾蛥捬鯒l件下均快速生長(zhǎng)。此外，其對(duì)于木質(zhì)纖維素水解產(chǎn)物的毒性環(huán)境比(遺傳修飾的)細(xì)菌更具抗性。盡管野生型啤酒糖酵母(S. cerevisiae)菌株可緩慢地代謝戊糖木酮糖，但是其不能代謝木糖。在二十世紀(jì)八十年代，已有建議用于木糖利用的酵母代謝工程應(yīng)當(dāng)基于木糖異構(gòu)酶(XI，EC 5.3. 1.5)的引入，而不是表達(dá)異源木糖還原酶和木糖醇脫氫酶以將木糖轉(zhuǎn)化為木酮糖。遺憾地是，在啤酒糖酵母中引入細(xì)菌木糖異構(gòu)酶的所有嘗試除了值得注意的嗜熱棲熱菌(T.thermophilus)異構(gòu)酶之外均未能產(chǎn)生功能性表達(dá)的木糖異構(gòu)酶。這種酶在啤酒糖酵母中功能性表達(dá)，但是在生長(zhǎng)許可溫度僅觀測(cè)到非常低的活性。當(dāng)厭氧真菌Piromyces Sp. E2中新發(fā)現(xiàn)的木糖異構(gòu)酶被引入啤酒糖酵母中時(shí)，這種情況發(fā)生了徹底的改變，并且觀測(cè)到高水平的酶活性使得這個(gè)菌株能夠厭氧生長(zhǎng)并從木糖產(chǎn)生乙醇(W0 03/062340和WO 06/009434)。此種酵母株首次提供了能與商業(yè)規(guī)模的乙醇生產(chǎn)相容的木糖消耗和乙醇形成的比速率。自從發(fā)現(xiàn)了 Piromyces木糖異構(gòu)酶在酵母中的功能性表達(dá)，出現(xiàn)了其它木糖異構(gòu)酶在酵母中功能性表達(dá)的若干報(bào)道，所有這些均與Piromyces酶具有70%以上的氨基酸序列相同性，例如來(lái)自擬桿菌(Bacteroides) (W0 04/099381, WO 06/009434, WO 09/109633) 的細(xì)菌木糖異構(gòu)酶，以及來(lái)自 Cyllamyces (W0 04/099381)和 Orpinomyces (Madhavan et al·，2008，DOI 10. 1007/s00253-008-1794_6)的真菌木糖異構(gòu)酶。然而，在2008年12月M日之前，對(duì)于與Piromyces酶具有低于70 %氨基酸序列相同性的木糖異構(gòu)酶在酵母中功能性表達(dá)沒(méi)有報(bào)道。最近，在2009年2月，Brat 等(2009, Appl. Environ. Microbiol. 75 :2304-2311)公開(kāi)了來(lái)自厭氧菌 Clostridium phytofermentans的木糖異構(gòu)酶在酵母啤酒糖酵母中的功能性表達(dá)，其與Piromyces酶的氨基酸序列僅具有52%的相同性。迄今為止，450余種木糖異構(gòu)酶序列可公開(kāi)得自Genbank及其它序列數(shù)據(jù)庫(kù)，包括 Piromyces、Cyllamyces aberensis、小立碗蘚(Physcomitrella patens)、 擬南芥(Arabidopsis thaliana)、睡眠嗜血菌(Haemophilus somnus)、玻璃海鞘 (Ciona intestinalis)、難彭爭(zhēng)梭菌(Clostridium difficile)、海棲熱袍菌(Thermatoga maritime)、月危弱擬木干菌(Bacteroides fragilis) >Burkholderia phytofirmans、金黃節(jié)木干菌(Arthrobacter aurescens)及死亡梭桿菌(Fusobacterium_mortiferum)的木糖異構(gòu)酶序列。
然而，本領(lǐng)域仍需要編碼其它木糖異構(gòu)酶的核苷酸序列，其可被用于轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞如啤酒糖酵母以賦予它們將木糖異構(gòu)化為木酮糖的能力，從而使得如此轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞能被用于通過(guò)含戊糖原料的發(fā)酵而生產(chǎn)乙醇或者其它發(fā)酵產(chǎn)物的方法。發(fā)明描述酶“木糖異構(gòu)酶”(EC 5. 3. 1. 5)在本文被定義為催化D-木糖直接異構(gòu)化為D-木酮糖以及反之的酶。所述酶也被稱(chēng)作D-木糖酮異構(gòu)酶(ketoisomerase)。一些木糖異構(gòu)酶也能催化D-葡萄糖與D-果糖之間的轉(zhuǎn)化，因此有時(shí)也被稱(chēng)作葡萄糖異構(gòu)酶。木糖異構(gòu)酶需要鎂作為輔因子。本發(fā)明的木糖異構(gòu)酶可以由其氨基酸序列來(lái)進(jìn)一步定義，如下文所述。類(lèi)似地，木糖異構(gòu)酶可以由編碼該酶的核苷酸序列以及由與編碼木糖異構(gòu)酶的參照核苷酸序列雜交的核苷酸序列來(lái)定義，如下文所述。木糖異構(gòu)酶活性的單位(U)在本文被定義為在含有50mM磷酸鹽緩沖液(pH 7. 0)、10mM木糖和IOmM MgCl2的反應(yīng)混合物中于37°C 每分鐘產(chǎn)生Inmol木酮糖的酶的量。所形成的木酮糖通過(guò)Dische和Borenfreund(1951， T. Biol. Chem. 192 583-587)所述方法或者通過(guò)實(shí)施例中所述HPLC來(lái)確定。序列相同性在本文被定義為通過(guò)對(duì)比序列所確定的兩個(gè)或更多個(gè)氨基酸序列 (多肽或蛋白)或者兩個(gè)或更多個(gè)核酸(多核苷酸)序列之間的關(guān)系。在本領(lǐng)域中，“相同性”也是指氨基酸或者核酸序列之間序列相關(guān)性的程度，該情況可以通過(guò)此種序列串的匹配來(lái)確定。兩個(gè)氨基酸序列之間的“相似性”是通過(guò)將一個(gè)多肽的氨基酸序列及其保守氨基酸取代與另一多肽的序列對(duì)比而確定的?！跋嗤浴焙汀跋嗨菩浴笨扇菀椎赝ㄟ^(guò)已知方法計(jì)算。術(shù)語(yǔ)“序列相同性”或者“序列相似性”是指，當(dāng)最佳比對(duì)時(shí)，優(yōu)選針對(duì)(至少對(duì)比中的最短序列的)全長(zhǎng)并最大化匹配數(shù)及最小化空位(gap)數(shù)(如通過(guò)程序ClUStalW(1.83)、 GAP或者BESTFIT以默認(rèn)參數(shù)進(jìn)行)，則兩個(gè)(多)肽或者兩個(gè)核苷酸序列呈現(xiàn)出至少一定百分比的序列相同性(如本文別處所定義的)。GAP使用Needleman和^msch整體比對(duì)算法以在全長(zhǎng)上比對(duì)兩個(gè)序列，使匹配數(shù)最大化及使空位數(shù)最小化。通常，使用GAP默認(rèn)參數(shù)，空位生成罰分(gap creation penalty) = 50 (核苷酸)/8 (蛋白質(zhì))以及空位延伸罰分(gap extension penalty) = 3 (核苷酸)/2 (蛋白質(zhì))。對(duì)于核苷酸，所使用的默認(rèn)得分矩陣(default scoring matrix)是nwsgapdna，而對(duì)于蛋白質(zhì)，默認(rèn)得分矩陣是 Blosum62 (Henikoff & Henikoff，1992，PNAS 89，915-919)。用于比對(duì)本發(fā)明蛋白質(zhì)序列的優(yōu)選多重比對(duì)程序是Clustaiwa. 83)，其使用blosum矩陣(blosum matrix)及默認(rèn)設(shè)置 (空位開(kāi)放罰分10 ；空位延伸罰分0. 05)。應(yīng)清楚的是當(dāng)RNA序列被稱(chēng)作與DNA序列基本相似或者其與DNA序列具有一定程度序列相同性時(shí)，DNA序列中的胸腺嘧啶(T)被認(rèn)為等同于RNA序列中的尿嘧啶(U)。百分比序列相同性的序列比對(duì)和得分可以使用計(jì)算機(jī)程序來(lái)確定，如可得自 Accelrys Inc. ,9685 Scranton Road, San Diego, CA 92121-3752 USA 的GCG Wisconsin軟件包，版本10. 3，或者用于Windows的開(kāi)源軟件Emboss (當(dāng)前版本為 2. 7. 1-07)?；蛘?，百分比相似性或百分比相同性可以通過(guò)針對(duì)數(shù)據(jù)庫(kù)如FASTA、BLAST等的檢索來(lái)確定。確定相同性的優(yōu)選方法，被設(shè)計(jì)為給出所測(cè)序列之間最大匹配。確定相同性和相似性的方法在公眾可獲得的計(jì)算機(jī)程序中編碼。確定兩個(gè)序列之間的相同性和相似性的優(yōu)選的計(jì)算機(jī)程序包括例如GCG程序包(Devereux, J.，et al.，Nucleic Acids Research12(1) :387(1984))、BestFit、BLASTP、BLASTN 以及 FASTA(Altschul，S. F. et al.，J. Mol. Biol. 215:403-410(1990)。BLAST X 程序可公開(kāi)得自 NCBI 及其它來(lái)源(BLAST Manual, Altschul，S.，et al.，NCBI NLM NIH Bethesda, MD 20894 ；Altschul，S.，et al.，J. Mol. Biol. 215 :403-410(1990)。熟知的Smith Waterman算法也可以用于確定相同性。用于多肽序列對(duì)比的優(yōu)選參數(shù)包括如下算法Needleman和mmsch，J. Mol. Biol. 48 :443-453(1970)；對(duì)比矩陣得自 Hentikoff and Hentikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 89 :10915-10919(1992)的 BL0SSUM62 ；空位罰分:12 ；以及空位長(zhǎng)度罰分4。這些參數(shù)可用的程序是可公開(kāi)獲得的“Ogap”程序，得自位于美國(guó)威斯康星州麥迪遜市的 Genetics Computer Group。前述參數(shù)是用于氨基酸對(duì)比的默認(rèn)參數(shù)(對(duì)于末端空位無(wú)罰分)。用于核酸對(duì)比的優(yōu)選參數(shù)包括如下算法Needleman和mmsch，J. Mol. Biol. 48 443-453(1970)；對(duì)比矩陣匹配=+10，錯(cuò)配=0 ；空位罰分50 ；空位長(zhǎng)度罰分3?？捎玫氖巧鲜龅米晕挥诿绹?guó)威斯康星州麥迪遜市的Genetics Computer Group的Gap程序。上面給出的是用于核酸對(duì)比的默認(rèn)參數(shù)。任選地，在確定氨基酸相似性程度時(shí)，技術(shù)人員也可慮及所謂的“保守”氨基酸取代，這是技術(shù)人員清楚的。保守氨基酸取代是指具有相似側(cè)鏈的殘基的可互換性。例如， 具有脂肪族側(cè)鏈的一組氨基酸是甘氨酸、丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸；具有脂肪族-羥基側(cè)鏈的一組氨基酸是絲氨酸和蘇氨酸；具有含酰胺側(cè)鏈的一組氨基酸是天冬酰胺和谷氨酰胺；具有芳香族側(cè)鏈的一組氨基酸是苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸；具有堿性側(cè)鏈的一組氨基酸是賴(lài)氨酸、精氨酸和組氨酸；具有含硫側(cè)鏈的一組氨基酸是半胱氨酸和甲硫氨酸。優(yōu)選的保守氨基酸取代組是纈氨酸-亮氨酸-異亮氨酸，苯丙氨酸-酪氨酸，賴(lài)氨酸-精氨酸，丙氨酸-纈氨酸，以及天冬酰胺-谷氨酰胺。本文公開(kāi)的氨基酸序列的取代變體是所公開(kāi)的序列中至少一個(gè)殘基已被除去并在其位置插入了不同的殘基。優(yōu)選所述氨基酸改變是保守的。對(duì)于每個(gè)天然產(chǎn)生的氨基酸的優(yōu)選保守取代如下Ala至ser，Arg至 lys, Asn 至 gin 或 his, Asp 至 glu, Cys 至 ser 或 ala, Gln 至 asn, Glu 至 asp, Gly 至 pro, His 至 asn 或 gin, Ile 至 Ieu 或 val, Leu 至 ile 或 val, Lys 至 arg, gin 或 glu, Met 至 Ieu 或 ile, Phe 至 met、Ieu 或 tyr, Ser 至 thr, Thr 至 ser, Trp 至 tyr, Tyr 至 trp 或 phe,以及 Val 至 ile 或 Ieu0編碼本發(fā)明木糖異構(gòu)酶的核苷酸序列也可以通過(guò)其在中等或者優(yōu)選在嚴(yán)格雜交條件下分別與SEQ ID N0. 2的核苷酸序列雜交的能力來(lái)進(jìn)行定義。嚴(yán)格雜交條件在本文定義為這樣的條件，即該條件使得至少大約25個(gè)、優(yōu)選大約50個(gè)核苷酸、75或者100及最優(yōu)選大約200或更多個(gè)核苷酸的核酸序列于大約65°C溫度、在包含約IM鹽、優(yōu)選6 X SSC的溶液或者具有相應(yīng)離子濃度的任何其它溶液中雜交，并于65°C在包含約0. IM或更低濃度的鹽、優(yōu)選0.2XSSC的溶液或者具有相應(yīng)離子濃度的任何其它溶液中洗滌。優(yōu)選所述雜交過(guò)夜進(jìn)行，即至少10小時(shí)，并且優(yōu)選洗滌進(jìn)行至少1小時(shí)且更換至少兩次洗滌溶液。這些條件通常允許具有大約90%或者更高序列相同性的序列特異性雜交。中等條件在本文定義為這樣的條件，即該條件使得至少50個(gè)核苷酸、優(yōu)選約200 或更多個(gè)核苷酸的核酸序列于大約45°C溫度、在包含約IM鹽、優(yōu)選6 X SSC的溶液或者具有相應(yīng)離子濃度的任何其它溶液中雜交，并于室溫在包含約IM的鹽、優(yōu)選6 X SSC的溶液或者具有相應(yīng)離子濃度的任何其它溶液中洗滌。優(yōu)選所述雜交過(guò)夜進(jìn)行，即至少10小時(shí)，并且優(yōu)選洗滌進(jìn)行至少1小時(shí)且更換至少兩次洗滌溶液。這些條件通常允許具有高至50%序列相同性的序列特異性雜交。本領(lǐng)域技術(shù)人員能修改這些雜交條件，以特異性地鑒別出相同性在50% -90%之間變化的序列。“核酸構(gòu)建體”或者“核酸載體”在本文被理解為是指使用重組DNA技術(shù)所獲得的人工核酸分子。術(shù)語(yǔ)“核酸構(gòu)建體”因此不包括天然發(fā)生的核酸分子，盡管核酸構(gòu)建體可以包含(部分的)天然發(fā)生的核酸分子。術(shù)語(yǔ)“表達(dá)載體”或者“表達(dá)構(gòu)建體”是指能影響基因在與這種序列相容的宿主細(xì)胞或者宿主生物體中表達(dá)的核苷酸序列。這些表達(dá)載體通常包括至少合適的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)序列，及任選存在的3’轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)。也可存在實(shí)現(xiàn)表達(dá)所必需的或者有幫助的另外的因子，如表達(dá)增強(qiáng)子元件。所述表達(dá)載體將被引入到合適的宿主細(xì)胞中，并能實(shí)現(xiàn)編碼序列在該宿主細(xì)胞的體外細(xì)胞培養(yǎng)物中的表達(dá)。所述表達(dá)載體將適于在本發(fā)明的宿主細(xì)胞或者生物體中復(fù)制。如本文所用，術(shù)語(yǔ)“啟動(dòng)子”或者“轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)序列”是指發(fā)揮功能以控制一或多個(gè)編碼序列轉(zhuǎn)錄的核酸片段，并且其位于所述編碼序列轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)的轉(zhuǎn)錄方向的上游，并且通過(guò)DNA依賴(lài)性RNA聚合酶結(jié)合位點(diǎn)、轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)及任何其它DNA序列的存在而在結(jié)構(gòu)上加以鑒別，所述其它DNA序列包括但不限于轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)、阻抑物和激活物蛋白結(jié)合位點(diǎn)，以及本領(lǐng)域技術(shù)人員已知直接或者間接地調(diào)節(jié)來(lái)自該啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄量的任何其它核苷酸序列?！敖M成型”啟動(dòng)子是在大多數(shù)生理和發(fā)育條件下在大多數(shù)組織中具有活性的啟動(dòng)子?！翱烧T導(dǎo)的”啟動(dòng)子是例如通過(guò)應(yīng)用化學(xué)誘導(dǎo)劑而進(jìn)行生理或者發(fā)育調(diào)節(jié)的啟動(dòng)子。術(shù)語(yǔ)“選擇性標(biāo)記”是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的術(shù)語(yǔ)，并在本文用于描述當(dāng)表達(dá)時(shí)可被用于挑選含有該選擇性標(biāo)記的細(xì)胞的任何遺傳實(shí)體。術(shù)語(yǔ)“報(bào)道子”與標(biāo)記可互換使用， 盡管其主要用來(lái)指可見(jiàn)的標(biāo)記，如綠色熒光蛋白(GFP)。選擇性標(biāo)記可以是顯性或隱性的或者是雙向性的。如本文所用，術(shù)語(yǔ)“可操縱地連接”是指多核苷酸元件以功能關(guān)系的連接。當(dāng)核酸被置于與另一核酸序列的功能關(guān)系內(nèi)時(shí)，其是“可操縱地連接”的。例如，如果轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)序列影響編碼序列的轉(zhuǎn)錄，則其與所述編碼序列是可操縱地連接的?？刹倏v地連接是指所連接的DNA序列通常是鄰接的，并且在需要連接兩個(gè)蛋白質(zhì)編碼區(qū)時(shí)其是鄰接的且符合讀框的。術(shù)語(yǔ)“蛋白質(zhì)”或者“多肽”可互換使用，是指由氨基酸鏈組成的分子，不考慮特定作用模式、大小、三維結(jié)構(gòu)或者來(lái)源?！罢婢痹诒疚氖侵府愷B(yǎng)真核微生物，其在外部消化其食物，吸收營(yíng)養(yǎng)分子進(jìn)入其細(xì)胞中。真菌是真核生物的一個(gè)單獨(dú)的界，并且包括酵母、霉菌和蘑菇。本文所用的術(shù)語(yǔ)真菌因而清楚地包括酵母以及絲狀真菌。術(shù)語(yǔ)“基因”是指包含一個(gè)區(qū)域(轉(zhuǎn)錄區(qū)域)的DNA片段，其在細(xì)胞中被轉(zhuǎn)錄為RNA 分子(例如mRNA)，與合適的調(diào)節(jié)區(qū)(例如啟動(dòng)子)可操縱地連接。基因通常包含若干可操縱地連接的片段，如啟動(dòng)子、5’前導(dǎo)序列、編碼區(qū)以及包含聚腺苷酸化位點(diǎn)的3’非翻譯序列 (3’末端)?！盎虻谋磉_(dá)”是指這樣的過(guò)程，其中與合適的調(diào)節(jié)區(qū)、特別是啟動(dòng)子可操縱地連接的DNA區(qū)被轉(zhuǎn)錄成RNA，其是有生物學(xué)活性的，即其能被翻譯成具有生物學(xué)活性的蛋白質(zhì)或者肽。
術(shù)語(yǔ)“同源”當(dāng)用于表明給定的(重組)核酸或者多肽分子與給定的宿主生物體或者宿主細(xì)胞之間的關(guān)系時(shí)，被理解為是指在自然中所述核酸或者多肽分子由相同物種、 優(yōu)選相同品種或者株系的宿主細(xì)胞或者生物體所產(chǎn)生的。如果與宿主細(xì)胞同源，則編碼多肽的核酸序列與在其天然環(huán)境中相比通常(但不是必須)與另一(異源)啟動(dòng)子序列可操縱地連接，且如果合適，可以與另一(異源)分泌信號(hào)序列和/或終止子序列可操縱地連接。應(yīng)理解調(diào)節(jié)序列、信號(hào)序列、終止子序列等也可以與該宿主細(xì)胞同源。在這種背景下， 僅使用“同源”的序列元件使得可以構(gòu)建“自身克隆的”經(jīng)遺傳修飾的生物體(GMO’ s)(自身克隆在本文中如European Directive 98/81/EC Annex II中所定義)。當(dāng)用于表明兩個(gè)核酸序列的相關(guān)性時(shí)，術(shù)語(yǔ)“同源”是指一個(gè)單鏈核酸序列可以與互補(bǔ)的單鏈核酸序列雜交。雜交的程度可依賴(lài)于數(shù)個(gè)因素包括序列之間相同性的量以及雜交條件如后文所述的溫度和鹽濃度等。術(shù)語(yǔ)“異源”當(dāng)用于核酸(DNA或者RNA)或者蛋白質(zhì)時(shí)，是指這樣的核酸或者蛋白質(zhì)，其不是作為其存在于之中的生物體、細(xì)胞、基因組或者DNA或RNA序列的一部分而天然發(fā)生，或者其被發(fā)現(xiàn)存在于與其天然存在所不同的細(xì)胞、或者位置、或者基因組或DNA或 RNA序列的位置。異源核酸或者蛋白質(zhì)對(duì)于其所被引入其中的細(xì)胞而言不是內(nèi)源的，而是得自另外的細(xì)胞或者經(jīng)合成或者重組而產(chǎn)生。通常非必須地，這種核酸編碼的蛋白質(zhì)不是由所述DNA在其中轉(zhuǎn)錄或表達(dá)的細(xì)胞所正常產(chǎn)生的。相似地，外源RNA編碼的蛋白質(zhì)在該外源RNA所存在的細(xì)胞中不是正常表達(dá)的。異源核酸和蛋白質(zhì)也可以是指外源核酸或者蛋白質(zhì)。本領(lǐng)域技術(shù)人員認(rèn)為對(duì)于表達(dá)其的細(xì)胞而言是異源或者外源的任何核酸或者蛋白質(zhì)均涵蓋在本文術(shù)語(yǔ)異源核酸或者蛋白質(zhì)的含義內(nèi)。術(shù)語(yǔ)異源也適用于描述核酸或者氨基酸序列的非天然組合，即其中至少兩個(gè)所組合的序列彼此是外源的組合。發(fā)明詳述迄今為止，450余種木糖異構(gòu)酶氨基酸序列可公開(kāi)得自Genbank或者其它序列數(shù)據(jù)庫(kù)。其中已知一些木糖異構(gòu)酶氨基酸序列具有在酵母中功能性表達(dá)的能力，包括例如來(lái)自厭氧真菌如Piromyces、Cyllamyces和Orpinomyces的木糖異構(gòu)酶，以及來(lái)自擬桿菌的細(xì)菌木糖異構(gòu)酶，所有這些均呈現(xiàn)出與Piromyces酶具有70%以上的氨基酸序列相同性。 本發(fā)明人現(xiàn)在令人驚奇地發(fā)現(xiàn)與Piromyces酶不相關(guān)的木糖異構(gòu)酶的氨基酸序列，即其與 Piromyces酶的氨基酸序列具有低于70%的氨基酸序列相同性，但是其仍然具有在酵母中功能性(即活性)表達(dá)的能力。此外，本發(fā)明人鑒別出了具有在酵母中功能性表達(dá)能力的所有木糖異構(gòu)酶中所共有的數(shù)個(gè)氨基酸序列元件。木糖異構(gòu)酶在酵母中的功能性表達(dá)在本文中被理解為是指，在啤酒糖酵母中木糖異構(gòu)酶經(jīng)密碼子優(yōu)化的編碼序列在基于2μ -的質(zhì)粒上從糖分解啟動(dòng)子表達(dá)，其使得該酵母以木糖作為唯一碳源可檢測(cè)地生長(zhǎng)，優(yōu)選在厭氧條件下生長(zhǎng)且消耗木糖產(chǎn)生乙醇，更優(yōu)選在生長(zhǎng)速率、生物質(zhì)和乙醇產(chǎn)量中至少一項(xiàng)是在用密碼子優(yōu)化的Piromyces木糖異構(gòu)酶編碼序列在其它相同條件下所獲得的結(jié)果的至少10^^20^^50%或者80%。優(yōu)選的功能性表達(dá)是這樣的表達(dá)，其使得酵母以木糖作為唯一碳源在低于35、33、30或的溫度及在高于20、22或25°C的溫度下可檢測(cè)地生長(zhǎng)。在第一方面，本發(fā)明涉及轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞，其具有將木糖異構(gòu)化為木酮糖的能力。 所述將木糖異構(gòu)化為木酮糖的能力是通過(guò)用包含編碼木糖異構(gòu)酶的核苷酸序列的核酸構(gòu)建體轉(zhuǎn)化該宿主細(xì)胞而被賦予的。所述轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞將木糖異構(gòu)化為木酮糖的能力應(yīng)理解為是指木糖在由木糖異構(gòu)酶催化的一個(gè)單一反應(yīng)中直接異構(gòu)化為木酮糖，這與通過(guò)木糖還原酶和木糖醇脫氫酶分別催化的經(jīng)木糖醇中間產(chǎn)物而使木糖轉(zhuǎn)化為木酮糖的兩步轉(zhuǎn)化法不同。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述編碼木糖異構(gòu)酶的核苷酸序列選自由如下組成的組(a)編碼具有木糖異構(gòu)酶活性多肽的核苷酸序列，所述多肽包含與SEQ ID NO. 1 (難辨梭菌)的氨基酸序列具有至少 45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、 59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、 84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、95、96、97、98 或者 99 % 的序列相同性的氨基酸序列；(b)編碼具有木糖異構(gòu)酶活性多肽的核苷酸序列，所述多肽包含與SEQ ID NO. 2 (玻璃海鞘 Ciona)的氨基酸序列具有至少 45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、 57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、 82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、95、96、97、98 或者 99% 的序列相同性的
氨基酸序列；(c)編碼具有木糖異構(gòu)酶活性多肽的核苷酸序列，所述多肽包含與SEQ ID NO. 35 (死亡梭桿菌 F. mortiferum)的氨基酸序列具有至少 45、46、47、48、49、50、51、52、53、 54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、 79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、95、96、97、98 或者 99% 的序列
相同性的氨基酸序列；(d)其互補(bǔ)鏈與(a)、(b)或(C)的核苷酸序列雜交的核苷酸序列；以及(e)其序列由于遺傳密碼的簡(jiǎn)并性而與(d)的核苷酸序列不同的核苷酸序列。在一個(gè)實(shí)施方案中，編碼木糖異構(gòu)酶的核苷酸序列編碼包含一或多個(gè)氨基酸序列元件的氨基酸序列，所述氨基酸序列元件是具有在酵母中功能性表達(dá)能力的木糖異構(gòu)酶中所共有的。在這個(gè)實(shí)施方案中，編碼木糖異構(gòu)酶的核苷酸序列編碼包含一或多個(gè)氨基酸序列元件的氨基酸序列，所述氨基酸序列元件選自由如下組成的組(a)在第91位的甲硫氨酸殘基；(b)在第1；34-139位的氨基酸序列TGIKLL ；(c)在第230位的苯丙氨酸殘基；(d)分別在第264和265位的氨基酸苯丙氨酸和賴(lài)氨酸；(e)在第274-278位的氨基酸序列TLAGH ；(f)在第387-391位的氨基酸序列RYASF ；(g)在第394位的甘氨酸殘基；以及(h)在第431位的丙氨酸殘基。在這個(gè)實(shí)施方案中，所編碼的木糖異構(gòu)酶可以任何可能的組合包含至少1、2、3、4、 5、6、7或者所有8個(gè)元件(a) - (h)。因此，在這個(gè)實(shí)施方案中，所編碼的木糖異構(gòu)酶可包含如下元件或者元件組合(a) ； (b) ； (c) ； (d) ； (e) ； (f) ； (g) ； (h) ； (a)和(b) ； (a)和(c) ； (a) 和(d) ； (a)和(e) ； (a)和(f) ； (a)和(g) ； (a)和(h) ； (b)和(c) ； (b)和(d) ； (b)和(e)； (b)和(f) ； (b)和(g) ； (b)和(h) ； (c)和(d) ； (c)和(e) ； (c)和(f) ； (c)和(g) ； (c)和 (h) ； (d)和(e) ； (d)和(f) ； (d)和(g) ； (d)和(h) ； (e)和(f) ； (e)和(g) ； (e)和(h)；(f)和(g) ； (f)和(h) ； (g)和(h) ； (a)、(b)和(c) ； (a)、(b)和(d) ； (a)、(b)和(e) ； (a)、 (b)和(f) ； (a)、(b)和(g) ； (a)、(b)和(h) ； (a)、(c)和(d) ； (a)、(c)和(e) ； (a)、(c)和 (f) ； (a)、(c)和(g) ； (a)、(c)和(h) ； (a)、(d)和(e) ； (a)、(d)和(f) ； (a)、(d)和(g)；
(a)、(d)和(h)； (a)、(e)和(f) ； (a)、(e)和(g) ； (a)、(e)和(h) ； (a)、(f)和(g) ； (a)、
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(d)、(e)和(f)； (d)、(e)和(g) ； (d)、(e)和(h) ； (d)、(f)和(g) ； (d)、(f)和(h) ； (d)、
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(c)和(d)； (a)、(b)、(c)和(e) ； (a)、(b)、(c)和(f) ； (a)、(b)、(c)和(g) ； (a)、(b)、(c) 和(h) ； (a)、(b)、(d)和(e) ； (a)、(b)、(d)和(f) ； (a)、(b)、(d)和(g) ； (a)、(b)、(d)和
(h)； (a)、(b)、(e)和(f) ； (a)、(b)、(e)和(g) ； (a)、(b)、(e)和(h) ； (a)、(b)、(f)和(g)； (a)、(b)、(f)和(h) ； (a)、(b)、(g)和(h) ； (a)、(c)、(d)和(e) ； (a)、(c)、(d)和(f) ； (a)、 (c)、(d)和(g) ； (a)、(c)、(d)和(h) ； (a)、(c)、(e)和(f) ； (a)、(c)、(e)和(g) ； (a)、(c)、
(e)和(h)； (a)、(c)、(f)和(g) ； (a)、(c)、(f)和(h) ； (a)、(c)、(g)和(h) ； (a)、(d)、(e) 和(f) ； (a)、(d)、(e)和(g) ； (a)、(d)、(e)和(h) ； (a)、(d)、(f)和(g) ； (a)、(d)、(f)和 (h) ； (a)、(d)、(g)和(h) ； (a)、(e)、(f)和(g) ； (a)、(e)、(f)和(h) ； (a)、(e)、(g)和(h)；
(a)、(f)、(g)和(h)； (b)、(c)、(d)和(e) ； (b)、(c)、(d)和(f) ； (b)、(c)、(d)和(g) ； (b)、 (c)、(d)和(h) ； (b)、(c)、(e)和(f) ； (b)、(c)、(e)和(g) ； (b)、(c)、(e)和(h) ； (b)、(c)、
(f)和(g)； (b)、(c)、(f)和(h) ； (b)、(c)、(g)和(h) ； (b)、(d)、(e)和(f) ； (b)、(d)、(e) 和(g) ； (b)、(d)、(e)和(h) ； (b)、(d)、(f)和(g) ； (b)、(d)、(f)和(h) ； (b)、(d)、(g)和 (h) ； (b)、(e)、(f)和(g) ； (b)、(e)、(f)和(h) ； (b)、(e)、(g)和(h) ； (b)、(f)、(g)和(h)；
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(f)； (a)、(b)、(c)、(e)和(g) ； (a)、(b)、(c)、(e)和(h) ； (a)、(b)、(c)、(f)和(g) ； (a)、
(b)、(c)、(f)和(h)； (a)、(b)、(c)、(g)和(h) ； (a)、(b)、(d)、(e)和(f) ； (a)、(b)、(d)、
(e)和(g)； (a)、(b)、(d)、(e)和(h) ； (a)、(b)、(d)、(f)和(g) ； (a)、(b)、(d)、(f)和(h)； (a)、(b)、(d)、(g)和(h) ； (a)、(b)、(e)、(f)和(g) ； (a)、(b)、(e)、(f)和(h) ； (a)、(b)、 (e)、(g)和(h) ； (a)、(b)、(f)、(g)和(h) ； (a)、(c)、(d)、(e)和(f) ； (a)、(c)、(d)、(e)和
(g)； (a)、(c)、(d)、(e)和(h) ； (a)、(c)、(d)、(f)和(g) ； (a)、(c)、(d)、(f)和(h) ； (a)、
(c)、(d)、(g)和(h)； (a)、(c)、(e)、(f)和(g) ； (a)、(c)、(e)、(f)和(h) ； (a)、(c)、(e)、 (g)和(h) ； (a)、(c)、(f)、(g)和(h) ； (a)、(d)、(e)、(f)和(g) ； (a)、(d)、(e)、(f)和(h)； (a)、(d)、(e)、(g)和(h) ； (a)、(d)、(f)、(g)和(h) ； (a)、(e)、(f)、(g)和(h) ； (b)、(c)、
(d)、(e)和(f)； (b)、(c)、(d)、(e)和(g) ； (b)、(c)、(d)、(e)和(h) ； (b)、(c)、(d)、(f)和(g)； (b)、(c)、(d)、(f)和(h) ； (b)、(c)、(d)、(g)和(h) ； (b)、(c)、(e)、(f)和(g) ； (b)、
(c)、(e)、(f)和(h)； (b)、(c)、(e)、(g)和(h) ； (b)、(c)、(f)、(g)和(h) ； (b)、(d)、(e)、 (f)和(g) ； (b)、(d)、(e)、(f)和(h) ； (b)、(d)、(e)、(g)和(h) ； (b)、(d)、(f)、(g)和(h)；
(b)、(e)、(f)、(g)和(h)； (c)、(d)、(e)、(f)和(g) ； (c)、(d)、(e)、(f)和(h) ； (c)、(d)、 (e)、(g)和(h) ； (c)、(d)、(f)、(g)和(h) ； (c)、(e)、(f)、(g)和(h) ； (d)、(e)、(f)、(g) 和(h) ； (a)、(b)、(c)、(d)、(e)和(f) ； (a)、(b)、(c)、(d)、(e)和(g) ； (a)、(b)、(c)、(d)、
(e)和(h)； (a)、(b)、(c)、(d)、(f)和(g) ； (a)、(b)、(c)、(d)、(f)和(h) ； (a)、(b)、(c)、
(d)、(g)和(h)； (a)、(b)、(c)、(e)、(f)和(g) ； (a)、(b)、(c)、(e)、(f)和(h) ； (a)、(b)、
(c)、(e)、(g)和(h)； (a)、(b)、(c)、(f)、(g)和(h) ； (a)、(b)、(d)、(e)、(f)和(g) ； (a)、
(b)、(d)、(e)、(f)和(h)； (a)、(b)、(d)、(e)、(g)和(h) ； (a)、(b)、(d)、(f)、(g)和(h)；
(a)、(b)、(e)、(f)、(g)和(h)； (a)、(c)、(d)、(e)、(f)和(g) ； (a)、(c)、(d)、(e)、(f)和
(h)； (a)、(c)、(d)、(e)、(g)和(h) ； (a)、(c)、(d)、(f)、(g)和(h) ； (a)、(c)、(e)、(f)、(g) 和(h) ； (a)、(d)、(e)、(f)、(g)和(h) ； (b)、(c)、(d)、(e)、(f)和(g) ； (b)、(c)、(d)、(e)、
(f)和(h)； (b)、(c)、(d)、(e)、(g)和(h) ； (b)、(c)、(d)、(f)、(g)和(h) ； (b)、(c)、(e)、 (f)、(g)和(h) ； (b)、(d)、(e)、(f)、(g)和(h) ； (c)、(d)、(e)、(f)、(g)和(h) ； (a)、(b)、
(c)、(d)、(e)、(f)和(g)； (a)、(b)、(c)、(d)、(e)、(f)和(h) ； (a)、(b)、(c)、(d)、(e)、(g) 和(h) ； (a)、(b)、(c)、(d)、(f)、(g)和(h) ； (a)、(b)、(c)、(e)、(f)、(g)和(h) ； (a)、(b)、
(d)、(e)、(f)、(g)和(h)； (a)、(c)、(d)、(e)、(f)、(g)和(h)；和最后的、(b)、(c)、(d)、
(e)、(f)、(g)和(h)。此外，在相應(yīng)于(b)、(d)、(e)和(f)中氨基酸序列的那些位置的氨基酸序列可以?xún)?yōu)選與(b)、(d)、(e)和(f)的氨基酸序列有不超過(guò)1、2或3個(gè)氨基酸的差異。優(yōu)選地，元件(b)至少在第136位由I組成，元件(d)至少在第264位由F組成，元件
(f)至少在第391位由F或Y組成。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所編碼的木糖異構(gòu)酶包含元件(a)、(f)、(g)和(h)中的至少一個(gè)元件。更優(yōu)選地，所編碼的木糖異構(gòu)酶另外包含元件
(b)和(c)中至少一個(gè)元件，以及最優(yōu)選地，所編碼的木糖異構(gòu)酶另外包含元件⑷和(e) 中至少一個(gè)元件。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所編碼的木糖異構(gòu)酶至少包含元件(a)，更優(yōu)選所述異構(gòu)酶另外至少包含元件(b)、(c)和/或(g)，更優(yōu)選所述異構(gòu)酶另外至少包含元件(d)、(f)和/或(h)，最優(yōu)選所述異構(gòu)酶另外包含元件(e)。上述序列元件(a) - (h)的氨基酸位置是指參照SEQ ID NO 3的Piromyces木糖異構(gòu)酶的氨基酸序列的位置。在本發(fā)明中SEQ ID NO :3之外的氨基酸序列中，優(yōu)選序列元件 (a)-(h)的氨基酸位置出現(xiàn)在相應(yīng)于SEQ ID NO :3中序列元件(a)-(h)的位置的氨基酸位置，優(yōu)選在使用默認(rèn)設(shè)置的ClustalWa. 8 序列比對(duì)中。技術(shù)人員知道怎樣使用上述氨基酸序列比對(duì)算法來(lái)鑒別SEQ ID NO :3之外的木糖異構(gòu)酶氨基酸序列中的相應(yīng)氨基酸位置。 這種比對(duì)的例子在表4中示出，其顯示出來(lái)自左側(cè)所標(biāo)示的生物體的木糖異構(gòu)酶氨基酸序列的Clustal ff(l. 83)多重序列比對(duì)。表4中Piromyces序列(SEQ ID NO 3)中有陰影的氨基酸標(biāo)示的是具有在酵母中功能性表達(dá)能力的木糖異構(gòu)酶所共有的氨基酸。在一個(gè)實(shí)施方案中，編碼木糖異構(gòu)酶的核苷酸序列編碼不是SEQ ID NO :3_7之一或多個(gè)的氨基酸序列。優(yōu)選地，編碼木糖異構(gòu)酶的核苷酸序列不具有與選自SEQ ID NO 3-7 的至少一個(gè)氨基酸序列有超過(guò)(或者具有與選自SEQ ID NO :3-7的至少一個(gè)氨基酸序列有低于)99、98、97、96、95、94、93、92、91、90、89、88、87、86、85、84、83、82、81、80、79、78、77、76、75、74、73、72、71或者70%的序列相同性的氨基酸序列。在一個(gè)實(shí)施方案中，編碼木糖異構(gòu)酶的核苷酸序列編碼不是SEQ ID NO :35之一或多個(gè)的氨基酸序列。優(yōu)選地，編碼木糖異構(gòu)酶的核苷酸序列不具有與選自SEQ ID N0:35 的至少一個(gè)氨基酸序列有超過(guò)(或者具有與選自SEQ ID NO 35的至少一個(gè)氨基酸序列有低于)99、98、97、96、95、94、93、92、91、90、89、88、87、86、85、84、83、82、81、80、79、78、77、76、 75、74、73、72、71或者70%以上序列相同性的氨基酸序列。在一個(gè)實(shí)施方案中，編碼木糖異構(gòu)酶的核苷酸序列編碼不是選自如下氨基酸序列的氨基酸序列(a) WO 03/062340 所公開(kāi)的 Piromyces 木糖異構(gòu)酶；(b)W0 04/099381 和 WO 06/009434 所公開(kāi)的多形擬桿菌(Bacteroides thetaiotaomicron) 7KH胃豐勾Bl ；(c)W0 04/099381所公開(kāi)的Cyllamyces木糖異構(gòu)酶；以及(d)Madhavan et al. Q008，上述)所公開(kāi)的 Orpinomyces 木糖異構(gòu)酶。優(yōu)選地，編碼木糖異構(gòu)酶的核苷酸序列不具有與選自由如下組成的組的至少一個(gè)氨基酸序列有超過(guò)(或者具有與選自如下的至少一個(gè)氨基酸序列有低于)99、98、97、96、 95、94、93、92、91、90、89、88、87、86、85、84、83、82、81、80、79、78、77、76、75、74、73、72、71 或者70%的序列相同性的氨基酸序列(a) WO 03/062340 所公開(kāi)的 Piromyces 木糖異構(gòu)酶；(b)W0 04/099381和WO 06/009434所公開(kāi)的多形擬桿菌木糖異構(gòu)酶；(c)W0 04/099381所公開(kāi)的Cyllamyces木糖異構(gòu)酶；以及(d)Madhavan et al. Q008，上述)所公開(kāi)的 Orpinomyces 木糖異構(gòu)酶。在一個(gè)實(shí)施方案中，編碼木糖異構(gòu)酶的核苷酸序列編碼不是來(lái)自厭氧真菌 Neocallimastigaceae科的木糖異構(gòu)酶氨基酸的氨基酸序列，如選自Anaeromyces、 Caecomyces、Cyllamyces、Neocallimastix、Orpinomyces、Piromyces 禾口 Ruminomyces 屬的真菌。在一個(gè)實(shí)施方案中，編碼木糖異構(gòu)酶的核苷酸序列編碼不是來(lái)自擬桿菌或副擬桿菌(Parabacteroides)屬細(xì)菌的木糖異構(gòu)酶的氨基酸的氨基酸序列。本發(fā)明的核苷酸序列編碼新類(lèi)別的木糖異構(gòu)酶，其在本發(fā)明下文所述的真核宿主細(xì)胞中被功能性表達(dá)。本發(fā)明的核苷酸序列優(yōu)選編碼在某些真菌、細(xì)菌和被囊動(dòng)物 (tunicate)中天然發(fā)生的木糖異構(gòu)酶。本發(fā)明優(yōu)選的核苷酸序列因此編碼這樣的木糖異構(gòu)酶，其具有與可得自(或者天然發(fā)生于)梭菌(Clostridiaceae)科細(xì)菌、優(yōu)選梭菌(Clostridium)屬細(xì)菌、最優(yōu)選難辨梭菌的木糖異構(gòu)酶相同的氨基酸序列。本發(fā)明優(yōu)選的核苷酸序列因此編碼這樣的木糖異構(gòu)酶，其具有與可得自(或者天然發(fā)生于)梭桿菌(Fusobacteriaceae)科細(xì)菌、優(yōu)選梭桿菌(Fusobacterium)屬細(xì)菌、最優(yōu)選死亡梭桿菌的木糖異構(gòu)酶相同的氨基酸序列。本發(fā)明優(yōu)選的核苷酸序列因此編碼這樣的木糖異構(gòu)酶，其具有與可得自(或者天然發(fā)生于)被囊動(dòng)物、優(yōu)選玻璃海鞘(Cionidae)科的被囊動(dòng)物、更優(yōu)選玻璃海鞘(Ciona) 屬的被囊動(dòng)物、最優(yōu)選玻璃海鞘(C. intestinales)的木糖異構(gòu)酶相同的氨基酸序列。
在另一實(shí)施方案中，編碼木糖異構(gòu)酶的核苷酸序列選自由以下組成的組(a)編碼具有木糖異構(gòu)酶活性的多肽的核苷酸序列，所述多肽包含與SEQ ID NO. 8、9、11或者13中至少之一的氨基酸序列具有至少45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、 55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、 80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、95、96、97、98 或者 99 % 的序列相同性的氨基酸序列；(b)其互補(bǔ)鏈與(a)或(b)的核苷酸序列雜交的核苷酸序列；以及(c)其序列由于遺傳密碼的簡(jiǎn)并性而與(d)的核苷酸序列不同的核苷酸序列。然而應(yīng)理解編碼任何上述木糖異構(gòu)酶的改造形式的核苷酸序列以及與相應(yīng)天然發(fā)生的木糖異構(gòu)酶相比包含一或多個(gè)氨基酸取代、插入和/或缺失、但是在本文限定的相同性或相似性范圍內(nèi)的核苷酸序列均清楚地涵蓋在本發(fā)明中。因此，在一個(gè)實(shí)施方案中， 本發(fā)明的核苷酸序列編碼這樣的木糖異構(gòu)酶氨基酸序列，其包含如Meaden et al. (1994， Gene, 141 =97-101)所定義的木糖異構(gòu)酶標(biāo)簽序列VXW[GP]GREG[YSTA](出現(xiàn)在第187-195 位)和[LIVM]EPKPX[EG!]P(出現(xiàn)在第232-239位)，其中“X”可以是任何氨基酸，而其中括號(hào)內(nèi)的氨基酸表示其中所括起的氨基酸之一可以出現(xiàn)在標(biāo)簽序列中的該位置。本發(fā)明的木糖異構(gòu)酶氨基酸序列進(jìn)一步優(yōu)選包含保守的氨基酸殘基His-102、Asp-105和Asp-340，其組成直接參與催化的三聯(lián)體，Lys-235起結(jié)構(gòu)性及功能性的催化作用，以及參與鎂的結(jié)合的 Glu-233 (Vangrysperre et al. ,1990, Biochem. J. 265 :699-705 ；Henrick et al. , J. Mol. Biol. 208 :129-157 ；Bhosale et al.，1996 Microbiol. Rev. M :280-300) 上述標(biāo)簽序列和保守殘基的氨基酸位置是指參照SEQ ID NO :3的Piromyces木糖異構(gòu)酶氨基酸序列中的位置。在本發(fā)明SEQ ID NO :3之外的氨基酸序列中，優(yōu)選上述標(biāo)簽序列和保守殘基的氨基酸位置出現(xiàn)在相應(yīng)于SEQ ID NO :3的序列中標(biāo)簽序列和保守殘基的位置的氨基酸位置，優(yōu)選是在使用默認(rèn)設(shè)置的Clustaiwa. 83或1.81)序列比對(duì)中。技術(shù)人員會(huì)知道怎樣使用上述的氨基酸序列比對(duì)算法來(lái)鑒別SEQ ID NO :3之外的木糖異構(gòu)酶氨基酸序列中的相應(yīng)氨基酸位置。這種對(duì)比的一個(gè)實(shí)例在表4中描述。此外，迄今為止，本領(lǐng)域已知450余種木糖異構(gòu)酶氨基酸序列，且不斷有新成員加入。本發(fā)明的SEQ ID NO :3和木糖異構(gòu)酶序列與這些已知和新的木糖異構(gòu)酶氨基酸序列的序列比對(duì)將標(biāo)示出進(jìn)一步的保守區(qū)域和氨基酸位置， 其保守性對(duì)于結(jié)構(gòu)和酶活性非常重要。這些區(qū)域和位置將不接受或者僅接受保守氨基酸取代。這些區(qū)域和位置之外的氨基酸取代不太可能很明顯地影響木糖異構(gòu)酶活性。所述核苷酸序列編碼優(yōu)選以活性形式在經(jīng)轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞中表達(dá)的木糖異構(gòu)酶。 因此，所述核苷酸序列在宿主細(xì)胞中的表達(dá)產(chǎn)生的木糖異構(gòu)酶所具有的比活性是，在25°C 每mg蛋白質(zhì)至少10U木糖異構(gòu)酶活性，優(yōu)選在25°C每mg至少20、25、30、50、100、200或者 300U。在經(jīng)轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞中表達(dá)的木糖異構(gòu)酶的比活性在本文定義為宿主細(xì)胞的無(wú)細(xì)胞裂解物(例如酵母無(wú)細(xì)胞裂解物)的每mg蛋白質(zhì)的木糖異構(gòu)酶活性單位的量。木糖異構(gòu)酶活性、無(wú)細(xì)胞裂解物的蛋白質(zhì)和制備物的量如實(shí)施例中所述來(lái)確定。優(yōu)選地，所述核苷酸序列在宿主細(xì)胞中的表達(dá)產(chǎn)生的木糖異構(gòu)酶，具有對(duì)于木糖的Km低于50、40、30或者25mM， 更優(yōu)選具有對(duì)于木糖的Km為大約20mM或更低。編碼具有木糖異構(gòu)酶活性的多肽的本發(fā)明的核苷酸序列，可使用本領(lǐng)域本身熟知的用于分離核苷酸序列的方法(見(jiàn)例如Sambrook and Russell (2001) " MolecularCloning :A Laboratory Manual(3rd edition), Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New ^rk)，而得自屬于上述門(mén)、綱或者屬的真菌、酵母或者細(xì)菌的基因組和/或cDNA。本發(fā)明的核苷酸序列例如可得自這樣的方法，其中a)將簡(jiǎn)并的PCR引物(如SEQ ID NO. 14和15中那些)用于合適生物體(例如上述真菌、細(xì)菌或者被囊動(dòng)物)的基因組和/或cDNA，以產(chǎn)生包含編碼具有木糖異構(gòu)酶活性的多肽的核苷酸序列的一部分的PCR片段；b)在a)中獲得的PCR片段被用作探針以篩選該生物體的cDNA和 /或基因組文庫(kù)；以及c)產(chǎn)生包含編碼具有木糖異構(gòu)酶活性的多肽的核苷酸序列的cDNA 或者基因組DNA。為了增加木糖異構(gòu)酶在本發(fā)明的轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞中以足夠水平并且以活性形式表達(dá)的可能性，優(yōu)選將編碼這些酶以及本發(fā)明其他酶(見(jiàn)下文)的核苷酸序列針對(duì)所述宿主細(xì)胞的密碼子選擇調(diào)適以?xún)?yōu)化其密碼子選擇。編碼酶的核苷酸序列針對(duì)宿主細(xì)胞的密碼子選擇的適應(yīng)性可以表示為密碼子適應(yīng)指數(shù)(CAI)。所述密碼子適應(yīng)指數(shù)在本文定義為基因的密碼子選擇對(duì)于在特定宿主細(xì)胞或者生物體中高度表達(dá)的基因的密碼子選擇的相對(duì)適應(yīng)性量度。每個(gè)密碼子的相對(duì)適應(yīng)性(w)是對(duì)于相同氨基酸的每個(gè)密碼子選擇與最富集密碼子選擇的比值。CAI指數(shù)被定義為這些相對(duì)適應(yīng)性值的幾何平均值。不包括非同義密碼子和終止密碼子(取決于遺傳密碼)。CAI值的范圍從0到1，較高的值表示較高的最富集的密碼子比例(見(jiàn) Sharp and Li，1987，Nucleic Acids Research 邊U81-1295 ；也見(jiàn) Jansen et al.，2003，Nucleic Acids Res. 31 (8) :2242-51)。經(jīng)調(diào)適的核苷酸序列優(yōu)選具有至少 0. 2、0. 3、0. 4、0. 5、0. 6、0. 7、0. 8 或者 0. 9 的 CAI。最優(yōu)選的是 SEQ ID N0:16、17 和 38中所列的序列，其已經(jīng)為了在啤酒糖酵母細(xì)胞中表達(dá)而進(jìn)行過(guò)密碼子優(yōu)化。用包含編碼本發(fā)明木糖異構(gòu)酶的核苷酸序列的核酸構(gòu)建體轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞優(yōu)選是真核微生物宿主，更優(yōu)選是真菌宿主細(xì)胞，如酵母或者絲狀真菌宿主細(xì)胞。優(yōu)選所述宿主細(xì)胞是培養(yǎng)的細(xì)胞。本發(fā)明的宿主細(xì)胞，優(yōu)選是能主動(dòng)或者被動(dòng)地將戊糖(木糖以及優(yōu)選的阿拉伯糖)轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)細(xì)胞中的宿主。所述宿主細(xì)胞優(yōu)選含有主動(dòng)(active)糖酵解。所述宿主細(xì)胞可進(jìn)一步優(yōu)選含有內(nèi)源戊糖磷酸途徑，并且可含有內(nèi)源木酮糖激酶活性，從而由木糖所異構(gòu)化的木酮糖可以被代謝為丙酮酸鹽/酯(pyruvate)。所述宿主進(jìn)一步優(yōu)選含有這樣的酶，其用于將戊糖(優(yōu)選通過(guò)丙酮酸鹽/酯)轉(zhuǎn)化為希望的發(fā)酵產(chǎn)物如乙醇、乳酸、3-羥基-丙酸、丙烯酸、乙酸、琥珀酸、檸檬酸、氨基酸、1，3-丙二醇、乙烯、甘油、β -內(nèi)酰胺抗生素和頭孢菌素類(lèi)。特別優(yōu)選的宿主細(xì)胞是天然能進(jìn)行醇發(fā)酵、優(yōu)選厭氧醇發(fā)酵的宿主細(xì)胞。所述宿主細(xì)胞進(jìn)一步優(yōu)選具有對(duì)于乙醇的高耐受性，對(duì)于低PH的高耐受性(即能在低于5、4或者3的ρΗ值生長(zhǎng))，和對(duì)于有機(jī)酸如乳酸、乙酸或者甲酸以及糖降解產(chǎn)物如糠醛和羥基-甲基糠醛的高耐受性，以及對(duì)于升高的溫度的高耐受性。所述宿主細(xì)胞的任何這些特性或者活性均可以是天然存在于該宿主細(xì)胞中，或者可以通過(guò)遺傳修飾引入或者修飾，優(yōu)選通過(guò)自身克隆或者通過(guò)下文描述的本發(fā)明方法進(jìn)行。合適的細(xì)胞是培養(yǎng)的細(xì)胞， 可以在發(fā)酵過(guò)程中如在深層發(fā)酵或者固態(tài)發(fā)酵中培養(yǎng)的細(xì)胞。特別合適的細(xì)胞是真核微生物，例如真菌，而最適用于本發(fā)明的是酵母或者絲狀真菌。酵母在本文被定義為真核的微生物，并且包括主要以單細(xì)胞形式生長(zhǎng)真菌(Eumycotina)亞門(mén)的所有禾中(Yeasts !characteristics and identification， J.A.Barnett，R.W.Payne , D. Yarrow,2000，3rd ed. , Cambridge UniversityPress, Cambridge UK ；and, The yeasts, a taxonomic study, C. P. Kurtzman and J. W. Fell (eds) 1998,4th ed. , Elsevier Science Publ. B. V. , Amsterdam, The Netherlands) 0酵母可以通過(guò)單細(xì)胞菌體的出芽而生長(zhǎng)，或者通過(guò)生物體的裂體生殖而生長(zhǎng)。作為宿主細(xì)胞優(yōu)選的酵母屬于糖酵母、克魯維氏酵母(Kluyveromyces)、假絲酵母(Candida)、畢赤氏酵母(Pichia)、裂殖糖酵母(Schizosaccharomyces)、漢遜氏酵母(Hansenula)、克勒克氏酵母(Kloeckera)、許旺氏酵母(Schwanniomyces)和耶氏酵母(Yarrowia)屬。優(yōu)選地，所述酵母能厭氧發(fā)酵，更優(yōu)選能厭氧成醇發(fā)酵。在過(guò)去幾年有很多建議引入各種生物體用于從谷物糖產(chǎn)生生物乙醇。然而，實(shí)際上所有主要的生物乙醇生產(chǎn)方法均持續(xù)使用糖酵母屬的酵母作為乙醇生產(chǎn)者。這是由于糖酵母菌種對(duì)工業(yè)生產(chǎn)的許多有吸引力的特征所致，即高酸、乙醇和滲透耐受性，厭氧生長(zhǎng)的能力，以及當(dāng)然的其高成醇發(fā)酵能力。作為真菌宿主細(xì)胞的優(yōu)選酵母種包括啤酒糖酵母、微小糖酵母 (S. exiguus)、巴揚(yáng)氏糖酵母(S.bayanus)、乳克魯維氏酵母(K. Iactis)、馬克斯克魯維氏酵母(K. marxianus)禾口粟酒裂殖糖酵母(Schizosaccharomyces pombe)。絲狀真菌在本文定義為真核微生物，其包括真菌亞門(mén)的所有絲狀的形式。這些真菌特征在于由殼多糖、纖維素及其它復(fù)合多糖組成的營(yíng)養(yǎng)菌絲體。本發(fā)明的絲狀真菌與酵母在形態(tài)學(xué)、生理學(xué)和遺傳學(xué)方面不同。絲狀真菌的營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)是通過(guò)菌絲延長(zhǎng)，并且大多數(shù)絲狀真菌的碳代謝是專(zhuān)性需氧的。作為宿主細(xì)胞的優(yōu)選的絲狀真菌屬于曲霉菌 (Aspergillus)、木霉菌(Trichoderma)、腐質(zhì)霉菌(Humicola)、支丁頁(yè)抱(Acremonium)、,廉刀菌(Fusarium)禾口青霉菌(Penicillium)屬。在本發(fā)明的經(jīng)轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞中，編碼上述木糖異構(gòu)酶的核苷酸序列優(yōu)選與啟動(dòng)子可操縱地連接，所述啟動(dòng)子引起所述核苷酸序列在細(xì)胞中充分表達(dá)，以賦予該細(xì)胞將木糖轉(zhuǎn)化為木酮糖的能力。更優(yōu)選所述啟動(dòng)子引起所述核苷酸序列充分表達(dá)，以賦予該細(xì)胞在木糖作為唯一碳源和/或能量來(lái)源、最優(yōu)選在厭氧條件下生長(zhǎng)的能力。用于表達(dá)上述核苷酸序列的合適啟動(dòng)子包括對(duì)于分解代謝產(chǎn)物(葡萄糖)阻抑不敏感和/或需要木糖以誘導(dǎo)的啟動(dòng)子。具有這些特性的啟動(dòng)子廣泛可得并且為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知。這種啟動(dòng)子的合適實(shí)例包括例如來(lái)自糖酵解基因的啟動(dòng)子，如磷酸果糖激酶(PI3K)，磷酸丙糖異構(gòu)酶 (TPI)，甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GPD、TDH3或者GAPDH)，丙酮酸激酶(PI)，磷酸甘油酸激酶 (PGK)，葡萄糖-6-磷酸異構(gòu)酶啟動(dòng)子(PGIl)來(lái)自酵母或絲狀真菌的啟動(dòng)子；關(guān)于來(lái)自酵母的此類(lèi)啟動(dòng)子的更詳細(xì)描述可見(jiàn)WO 93/03159所述。其它有用的啟動(dòng)子是核糖體蛋白編碼基因啟動(dòng)子、乳糖酶基因啟動(dòng)子(LAC4)、醇脫氫酶啟動(dòng)子(ADH1、ADH4等)、烯醇化酶啟動(dòng)子 (ENO)、己糖(葡萄糖)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白啟動(dòng)子(HXT7)，以及細(xì)胞色素cl啟動(dòng)子(CYCl)。其它啟動(dòng)子(組成型和可誘導(dǎo)型的)及增強(qiáng)子或者上游活化序列為本領(lǐng)域技術(shù)人員已知。與上述核苷酸序列可操縱地連接的啟動(dòng)子優(yōu)選與宿主細(xì)胞同源。本發(fā)明經(jīng)轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞進(jìn)一步優(yōu)選包含木酮糖激酶活性，從而由木糖異構(gòu)化的木酮糖可以被代謝為丙酮酸鹽/酯。優(yōu)選地，所述細(xì)胞含有內(nèi)源的木酮糖激酶活性。更優(yōu)選地，本發(fā)明的細(xì)胞包含增加特異性木酮糖激酶活性的遺傳修飾。優(yōu)選所述遺傳修飾引起木酮糖激酶的過(guò)表達(dá)，例如通過(guò)編碼木酮糖激酶的核苷酸序列的過(guò)表達(dá)。編碼木酮糖激酶的基因?qū)τ谒黾?xì)胞可以是內(nèi)源的，或者可以是與所述細(xì)胞異源的木酮糖激酶?？捎糜谠诒景l(fā)明細(xì)胞中過(guò)表達(dá)木酮糖激酶的核苷酸序列是例如來(lái)自啤酒糖酵母的木酮糖激酶基因(XKSl)，如 Deng and Ho (1990，Appl. Biochem. Biotechnol. 24-25 193-199)所述。 另一優(yōu)選的木酮糖激酶是與來(lái)自Piromyces的木酮糖激酶相關(guān)的木糖激酶(xylB ；見(jiàn)WO 03/0624430)。這種Piromyces木酮糖激酶實(shí)際上與原核細(xì)胞激酶更相關(guān)(相對(duì)于所有已知真核細(xì)胞激酶如酵母激酶)。真核細(xì)胞木酮糖激酶已被標(biāo)明為非特異性糖激酶，其具有廣泛的底物范圍，包括木酮糖。相反，Piromyces激酶與之最密切相關(guān)的原核細(xì)胞木酮糖激酶已被標(biāo)明是木酮糖的更特異性的激酶，即具有較窄的底物范圍。在本發(fā)明的細(xì)胞中，過(guò)表達(dá)的木酮糖激酶與在遺傳學(xué)上相同的菌株(除了導(dǎo)致過(guò)表達(dá)的遺傳修飾之外)相比過(guò)表達(dá)至少1. 1,1. 2,1. 5、2、5、10或者20倍。應(yīng)理解這些水平的過(guò)表達(dá)可用于酶活性的穩(wěn)態(tài)水平、 酶蛋白質(zhì)的穩(wěn)態(tài)水平以及編碼所述酶的轉(zhuǎn)錄物的穩(wěn)態(tài)水平。本發(fā)明的細(xì)胞進(jìn)一步優(yōu)選包含增加戊糖磷酸途徑通量的遺傳修飾，如WO 06/009434所述。具體而言，所述遺傳修飾引起非氧化部分戊糖磷酸途徑的通量增加。引起非氧化部分戊糖磷酸途徑的通量增加的遺傳修飾在本文被理解為是指這樣的修飾，其使所述通量與遺傳學(xué)上相同的菌株(除了導(dǎo)致通量增加的遺傳修飾之外)所致通量相比增加至少1. 1、1.2、1.5、2、5、10或者20倍。非氧化部分戊糖磷酸途徑的通量可以如WO 06/009434 所述來(lái)測(cè)量。增加戊糖磷酸途徑通量的遺傳修飾可以通過(guò)各種方式而引入本發(fā)明的細(xì)胞中。這些方式包括例如實(shí)現(xiàn)木酮糖激酶和/或非氧化部分戊糖磷酸途徑的一或多種酶的較高的穩(wěn)態(tài)活性水平，和/或非特異性醛糖還原酶活性的降低的穩(wěn)態(tài)水平。穩(wěn)態(tài)活性水平的這些改變的實(shí)現(xiàn)可以通過(guò)挑選突變體(自發(fā)突變或者通過(guò)化學(xué)物或者輻射誘導(dǎo))和/或通過(guò)重組DNA技術(shù)，例如通過(guò)編碼所述酶的基因或者調(diào)節(jié)這些基因的因子的分別過(guò)表達(dá)或者失活而進(jìn)行。在本發(fā)明優(yōu)選的細(xì)胞中，所述遺傳修飾包含(非氧化部分)戊糖磷酸途徑的至少一種酶的過(guò)表達(dá)。優(yōu)選所述酶選自編碼核酮糖-5-磷酸異構(gòu)酶、核酮糖-5-磷酸3-差向異構(gòu)酶、轉(zhuǎn)酮醇酶和轉(zhuǎn)醛醇酶的酶。(非氧化部分)戊糖磷酸途徑的酶的各種組合可以被過(guò)表達(dá)。例如被過(guò)表達(dá)的酶可以至少是核酮糖-5-磷酸異構(gòu)酶和核酮糖-5-磷酸3-差向異構(gòu)酶；或者至少是核酮糖-5-磷酸異構(gòu)酶和轉(zhuǎn)酮醇酶；或者至少是核酮糖-5-磷酸異構(gòu)酶和轉(zhuǎn)醛醇酶；或者至少是核酮糖-5-磷酸3-差向異構(gòu)酶和轉(zhuǎn)酮醇酶；或者至少是核酮糖-5-磷酸3-差向異構(gòu)酶和轉(zhuǎn)醛醇酶；或者至少是轉(zhuǎn)酮醇酶和轉(zhuǎn)醛醇酶；或者至少是核酮糖-5-磷酸3-差向異構(gòu)酶、轉(zhuǎn)酮醇酶和轉(zhuǎn)醛醇酶；或者至少是核酮糖-5-磷酸異構(gòu)酶、轉(zhuǎn)酮醇酶和轉(zhuǎn)醛醇酶；或者至少是核酮糖-5-磷酸異構(gòu)酶、核酮糖-5-磷酸3-差向異構(gòu)酶和轉(zhuǎn)醛醇酶；或者至少是核酮糖-5-磷酸異構(gòu)酶、核酮糖-5-磷酸3-差向異構(gòu)酶和轉(zhuǎn)酮醇酶。 在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，核酮糖-5-磷酸異構(gòu)酶、核酮糖-5-磷酸3-差向異構(gòu)酶、轉(zhuǎn)酮醇酶和轉(zhuǎn)醛醇酶每個(gè)在本發(fā)明的細(xì)胞中均過(guò)表達(dá)。優(yōu)選的是其中所述遺傳修飾包含至少轉(zhuǎn)醛醇酶過(guò)表達(dá)的細(xì)胞。更優(yōu)選的是其中所述遺傳修飾包含至少轉(zhuǎn)酮醇酶和轉(zhuǎn)醛醇酶均過(guò)表達(dá)的細(xì)胞，因?yàn)檫@種宿主細(xì)胞已經(jīng)能夠在木糖上厭氧生長(zhǎng)。事實(shí)上，在一些條件下，我們發(fā)現(xiàn)僅過(guò)表達(dá)轉(zhuǎn)酮醇酶和轉(zhuǎn)醛醇酶的細(xì)胞在木糖上與過(guò)表達(dá)所述所有四種酶的細(xì)胞具有相同的厭氧生長(zhǎng)速度，所述四種酶即核酮糖-5-磷酸異構(gòu)酶、核酮糖-5-磷酸3-差向異構(gòu)酶、 轉(zhuǎn)酮醇酶和轉(zhuǎn)醛醇酶。此外，本發(fā)明過(guò)表達(dá)核酮糖-5-磷酸異構(gòu)酶和核酮糖-5-磷酸3-差向異構(gòu)酶的細(xì)胞與僅過(guò)表達(dá)所述異構(gòu)酶或者僅過(guò)表達(dá)所述3-差向異構(gòu)酶的細(xì)胞相比是優(yōu)選的，因?yàn)閮H過(guò)表達(dá)這些酶之一可產(chǎn)生代謝失衡。本領(lǐng)域有各種可利用的方式用于在本發(fā)明細(xì)胞中過(guò)表達(dá)酶。具體而言，可以通過(guò)增加細(xì)胞中編碼所述酶的基因的拷貝數(shù)而過(guò)表達(dá)所述酶，例如通過(guò)將額外的該基因的拷貝整合至細(xì)胞基因組中、通過(guò)從游離型多拷貝表達(dá)載體中表達(dá)所述基因，或者通過(guò)引入包含所述基因多個(gè)拷貝的游離型表達(dá)載體。用于所述酶的過(guò)表達(dá)的編碼序列優(yōu)選與本發(fā)明宿主細(xì)胞同源。然而，也同樣可以使用與本發(fā)明的宿主細(xì)胞異源的編碼序列?；蛘?，在本發(fā)明細(xì)胞中酶的過(guò)表達(dá)可以通過(guò)使用啟動(dòng)子實(shí)現(xiàn)，所述啟動(dòng)子對(duì)于編碼要過(guò)表達(dá)的酶的序列而言不是天然的，即對(duì)于與其可操縱地連接的編碼序列是異源的啟動(dòng)子。盡管所述啟動(dòng)子優(yōu)選與其可操縱地連接的編碼序列是異源的，但是也優(yōu)選所述啟動(dòng)子是同源的，即對(duì)于本發(fā)明的細(xì)胞是內(nèi)源的。優(yōu)選地，所述異源啟動(dòng)子與所述編碼序列天然的啟動(dòng)子相比，優(yōu)選在木糖或者木糖與葡萄糖可用作碳源、更優(yōu)選用作主要碳源(即超過(guò) 50%的可利用的碳源由木糖或者由木糖與葡萄糖組成)、最優(yōu)選用作唯一碳源的條件下，能產(chǎn)生較高的穩(wěn)態(tài)水平的包含所述編碼序列的轉(zhuǎn)錄物(或者能夠在單位時(shí)間產(chǎn)生更多轉(zhuǎn)錄分子，即mRNA分子)。在這種情況中合適的啟動(dòng)子包括上述啟動(dòng)子用于表達(dá)編碼上述木糖異構(gòu)酶的核苷酸序列。進(jìn)一步優(yōu)選的本發(fā)明細(xì)胞包含降低該細(xì)胞中非特異性醛糖還原酶活性的遺傳修飾。優(yōu)選地，在宿主細(xì)胞中非特異性醛糖還原酶活性是通過(guò)降低編碼非特異性醛糖還原酶的基因表達(dá)或使其失活的一或多個(gè)遺傳修飾而降低的。優(yōu)選地，所述遺傳修飾降低細(xì)胞基因組中編碼非特異性醛糖還原酶的基因的每個(gè)內(nèi)源拷貝的表達(dá)或者使其失活，所述醛糖還原酶能還原戊醛糖，包括木糖、木酮糖和阿拉伯糖。給定的細(xì)胞由于是二倍體、多倍體或者非整倍體而可以包含多個(gè)拷貝的編碼非特異性醛糖還原酶的基因，和/或細(xì)胞可含有具有醛糖還原酶活性的若干不同的(同工)酶，其氨基酸序列不同且每個(gè)均由不同基因編碼。在這種情況中，也優(yōu)選使編碼非特異性醛糖還原酶的每個(gè)基因的表達(dá)降低或者失活。優(yōu)選地， 所述基因通過(guò)所述基因至少一部分的缺失或者通過(guò)所述基因的斷裂而失活，由此在這種情況中術(shù)語(yǔ)基因還包括編碼序列上游或下游的任何非編碼序列，其(部分)缺失或者失活導(dǎo)致宿主細(xì)胞中非特異性醛糖還原酶活性表達(dá)的降低。編碼其活性要在本發(fā)明細(xì)胞中被降低的醛糖還原酶的核苷酸序列以及這種醛糖還原酶的氨基酸序列在WO 06/009434中有描
述，并且包括例如啤酒糖酵母GRE3基因的(非特異性)醛糖還原酶基因(TrSffet al., 2001, Appl. Environm. Microbiol. 67 :5668-5674)及其在其它物種中的直系同源物。在進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方案中，具有如上所述的將木糖異構(gòu)化為木酮糖能力的本發(fā)明經(jīng)轉(zhuǎn)化的細(xì)胞另外具有將L-阿拉伯糖轉(zhuǎn)化為D-木酮糖5-磷酸(酯)的能力，如例如 Wisselink et al. (2007, AEM Accepts, published online ahead of print on 1 June 2007 ;Appl. Environ. Microbiol, doi :10. 1128/AEM. 00177-07)及 EP 1 499 708 中所述。將 L-阿拉伯糖轉(zhuǎn)化為D-木酮糖5-磷酸(酯)的能力優(yōu)選是通過(guò)用包含核苷酸序列的核酸構(gòu)建體轉(zhuǎn)化而賦予所述細(xì)胞，所述核苷酸序列編碼a)阿拉伯糖異構(gòu)酶；b)核酮糖激酶，優(yōu)選 L-核酮糖激酶木糖異構(gòu)酶；以及c)核酮糖-5-P-4-差向異構(gòu)酶，優(yōu)選L-核酮糖-5-P-4-差向異構(gòu)酶。優(yōu)選地，在本發(fā)明細(xì)胞中，將L-阿拉伯糖轉(zhuǎn)化為D-木酮糖5-磷酸(酯)的能力是通過(guò)下列的反應(yīng)將L-阿拉伯糖轉(zhuǎn)化為D-木酮糖5-磷酸(酯)的能力，所述下列反應(yīng)為1)阿拉伯糖異構(gòu)化成核酮糖；幻核酮糖磷酸化成核酮糖5-磷酸(酯)；以及幻核酮糖5-磷酸(酯)差向異構(gòu)化為D-木酮糖5-磷酸(酯)。編碼阿拉伯糖異構(gòu)酶、核酮糖激酶和核酮糖-5-P-4-差向異構(gòu)酶的合適的核苷酸序列可得自枯草桿菌(Bacillus subtilis), 大腸桿菌(Escherichia coli)(見(jiàn)例如 EP 1 499 708)，乳桿菌(Lactobacilli)、例如植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum)(見(jiàn)例如Wisselink et al.上述)，或者棍狀桿菌(Clavikicter)，節(jié)桿菌(Arthrobacter)和革蘭菌(Gramella)種，優(yōu)選密執(zhí)安棍狀桿菌(Clavibacter michiganensis)、金黃節(jié)桿菌(Arthrobacter aurescens)禾口 Gramella forsetii ο進(jìn)一步優(yōu)選的本發(fā)明經(jīng)轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞可包含進(jìn)一步的遺傳修飾，其引起選自由如下組成的組的一或多種特性(a)增加木糖和/或阿拉伯糖向所述細(xì)胞中轉(zhuǎn)運(yùn)；(b)降低對(duì)分解代謝產(chǎn)物阻抑的敏感性；(c)提高對(duì)乙醇、摩爾滲透壓濃度(osmolarity)或者有機(jī)酸的耐受性；以及(d)減少副產(chǎn)物的產(chǎn)生。副產(chǎn)物被理解為是指除了希望的發(fā)酵產(chǎn)物之外的含碳分子，包括例如木糖醇、阿拉伯糖醇、甘油和/或乙酸。本文所述的任何遺傳修飾的引入可以通過(guò)傳統(tǒng)的誘變和篩選和/或選擇希望的突變體，或者簡(jiǎn)單地通過(guò)篩選和/ 或選擇具有希望特性的自發(fā)突變體?；蛘撸鲞z傳修飾可由內(nèi)源基因的過(guò)表達(dá)和/或內(nèi)源基因的失活所組成。增加阿拉伯糖和/或木糖轉(zhuǎn)向細(xì)胞中轉(zhuǎn)運(yùn)所需要過(guò)表達(dá)的基因優(yōu)選選自編碼己糖或者戊糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的基因。在啤酒糖酵母及其它酵母中，這些基因包括 HXT1、HXT2、HXT4、HXT5、HXT7 和 GAL2，其中最優(yōu)選 HXT7、HXT5 和 GAL2 (見(jiàn) kdlack and Ho,Yeast 2004;21:671-684)。用于在酵母中表達(dá)的另一優(yōu)選轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白是由樹(shù)干畢赤酵母 (P. stipitis)SUTl 基因編碼的葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(Katahira et al. ,2008, Enzyme Microb. Technol. M =115-119)。這些轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因在其它物種中的直系同源物可類(lèi)似地被過(guò)表達(dá)。 可以在本發(fā)明細(xì)胞中過(guò)表達(dá)的其它基因包括編碼糖酵解酶和/或產(chǎn)醇(ethanologenic) 酶如醇脫氫酶的基因。用于失活的優(yōu)選內(nèi)源基因包括己糖激酶基因，例如啤酒糖酵母HXK2 基因(見(jiàn) Diderich et al. ,2001, Appl. Environ. Microbiol. 67 :1587-1593)；啤酒糖酵母 MIGl或者M(jìn)IG2基因；編碼參與甘油代謝的酶的基因，如啤酒糖酵母磷酸甘油脫氫酶1和/ 或2基因；或者這些基因在其它物種中的(雜交)直系同源物。用于木糖發(fā)酵的宿主細(xì)胞的其它優(yōu)選的進(jìn)一步修飾在 Maris et al. (2006, Antonie van Leeuwenhoek 90:391-418)、 W02006/009434、W02005/023998、W02005/111214 和 W02005/091733 中有描述。如本文所述的本發(fā)明細(xì)胞的任何遺傳修飾盡可能地優(yōu)選通過(guò)自身克隆遺傳修飾來(lái)引入或者修飾。在優(yōu)選的本發(fā)明經(jīng)轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞中，所述核酸構(gòu)建體賦予宿主細(xì)胞以木糖作為碳源/能量源、優(yōu)選作為唯一碳源/能量源以及優(yōu)選在厭氧條件下生長(zhǎng)的能力，即如下文用于厭氧發(fā)酵方法的條件。優(yōu)選地，當(dāng)以木糖作為碳源/能量源生長(zhǎng)時(shí)，所述經(jīng)轉(zhuǎn)化的宿主基本上不產(chǎn)生木糖醇，例如所產(chǎn)生的木糖醇低于檢測(cè)極限，或者例如低于在摩爾基礎(chǔ)上消耗的碳的5%、2 %、1 %、0. 5 %或者0. 3 %。優(yōu)選地，如果碳源/能量源也包括阿拉伯糖，則所述細(xì)胞基本上不產(chǎn)生阿拉伯糖醇，例如所產(chǎn)生的阿拉伯糖醇低于檢測(cè)極限，或者例如低于在摩爾基礎(chǔ)上消耗的碳的5%、2%、1%、0. 5%或者0. 3%。本發(fā)明轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞以木糖作為唯一碳源/能量源具有在需氧條件下以至少 0. 01,0. 02,0. 05,0. 1,0. 2,0. 25或者0. 31Γ1的速率生長(zhǎng)的能力、或者更優(yōu)選地具有在厭氧條件下以至少0. 005,0. 01,0. 02,0. 05,0. 08,0. 1,0. 12,0. 15或者0. 21Γ1的速率生長(zhǎng)的能力。本發(fā)明的細(xì)胞優(yōu)選以葡萄糖與木糖的混合物(1 1重量比)作為唯一碳源/能量源具有在需氧條件下以至少0. 01,0. 02,0. 05,0. 1,0. 2,0. 25或者0. 31Γ1的速率生長(zhǎng)的能力、 或者更優(yōu)選地具有在厭氧條件下以至少0. 005,0. 01,0. 02,0. 05,0. 08,0. 1,0. 12,0. 15或
者0. ar1的速率生長(zhǎng)的能力。因此，在優(yōu)選的本發(fā)明經(jīng)轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞中，所述核酸構(gòu)建體賦予宿主細(xì)胞厭氧發(fā)酵木糖作為唯一碳源的的能力，其中在該過(guò)程中最后丙酮酸鹽/酯被用作電子(及氫受體)并被還原成發(fā)酵產(chǎn)物，如乙醇、乳酸、3-羥基-丙酸、丙烯酸、乙酸、琥珀酸、檸檬酸、氨基酸、1，3_丙二醇、乙烯、甘油、β -內(nèi)酰胺抗生素以及頭孢菌素類(lèi)。優(yōu)選地，本發(fā)明的細(xì)胞具有至少200、300、400、600、700、800、900或者IOOOmg h-l(g干重)_1的木糖消耗比速率。優(yōu)選地，本發(fā)明的細(xì)胞在木糖上的發(fā)酵產(chǎn)物(如乙醇) 產(chǎn)量是在葡萄糖上發(fā)酵產(chǎn)物(如乙醇)產(chǎn)量的至少20^^40^^50^^60,80,90,95或者 98%。更優(yōu)選地，經(jīng)修飾的宿主細(xì)胞在木糖上的發(fā)酵產(chǎn)物(如乙醇)產(chǎn)量等于該宿主細(xì)胞在葡萄糖上的發(fā)酵產(chǎn)物產(chǎn)量。同樣地，經(jīng)修飾的宿主細(xì)胞在木糖上的生物質(zhì)優(yōu)選為宿主細(xì)胞在葡萄糖上生物質(zhì)的至少55、60、70、80、85、90、95或者98%。更優(yōu)選地，經(jīng)修飾的宿主細(xì)胞在木糖上的生物質(zhì)產(chǎn)量等于該宿主細(xì)胞在葡萄糖上的生物質(zhì)產(chǎn)量。應(yīng)理解在葡萄糖和木糖上的產(chǎn)量對(duì)比中，均在需氧條件下或者均在厭氧條件下進(jìn)行對(duì)比。另一方面，本發(fā)明涉及用于產(chǎn)生發(fā)酵產(chǎn)物的方法，所述發(fā)酵產(chǎn)物選自由以下組成的組乙醇、乳酸、3-羥基-丙酸、丙烯酸、乙酸、琥珀酸、檸檬酸、氨基酸、1，3_丙二醇、乙烯、 甘油、β -內(nèi)酰胺抗生素和頭孢菌素類(lèi)。所述方法優(yōu)選包括如下步驟a)將含有木糖及任選存在的阿拉伯糖來(lái)源的培養(yǎng)基與上文所述的細(xì)胞發(fā)酵，其中所述細(xì)胞將木糖及任選存在的阿拉伯糖發(fā)酵成所述發(fā)酵產(chǎn)物，及任選地b)回收所述發(fā)酵產(chǎn)物。在木糖來(lái)源之外，所述發(fā)酵培養(yǎng)基中的碳源也可以包含葡萄糖來(lái)源。技術(shù)人員會(huì)進(jìn)一步了解到所述發(fā)酵培養(yǎng)基也可進(jìn)一步包含其它類(lèi)型碳水化合物，如例如特別是阿拉伯糖來(lái)源。所述木糖、葡萄糖和阿拉伯糖的來(lái)源可以是木糖、葡萄糖和阿拉伯糖(即單體糖)， 或者其可以是包含木糖、葡萄糖和/或阿拉伯糖單位的任何碳水化合物寡聚體或者多聚體形式，如例如木質(zhì)纖維素、阿拉伯多糖、木聚糖、纖維素、淀粉等。為了從這種碳水化合物中釋放木糖、葡萄糖和/或阿拉伯糖單位，可以在發(fā)酵培養(yǎng)基中加入合適的糖酶(如阿拉伯糖酶、木聚糖酶、葡聚糖酶、淀粉酶、纖維素酶、葡聚糖酶等)，或者這些糖酶可以由經(jīng)修飾的宿主細(xì)胞產(chǎn)生。在后者的情況中，經(jīng)修飾的宿主細(xì)胞可以經(jīng)遺傳改造以產(chǎn)生及分泌此類(lèi)糖酶。 使用寡聚體或者多聚體來(lái)源的葡萄糖的另一優(yōu)勢(shì)是其使得可以在發(fā)酵期間維持較低濃度的游離葡萄糖，例如優(yōu)選在發(fā)酵期間使用限速量的糖酶。這將隨之防止用于非葡萄糖糖如木糖和阿拉伯糖的代謝和轉(zhuǎn)運(yùn)所需的系統(tǒng)的阻抑。在優(yōu)選的方法中，經(jīng)修飾的宿主細(xì)胞發(fā)酵木糖和葡萄糖及任選存在的阿拉伯糖，優(yōu)選同時(shí)發(fā)酵，在這種情況中優(yōu)選使用對(duì)于葡萄糖阻抑不敏感的修飾的宿主細(xì)胞，以防止雙峰生長(zhǎng)。在木糖(和葡萄糖)來(lái)源作為碳源之外，所述發(fā)酵培養(yǎng)基將進(jìn)一步包含用于經(jīng)修飾的宿主細(xì)胞生長(zhǎng)所需的適當(dāng)成分。用于真核微生物如酵母和絲狀真菌生長(zhǎng)的發(fā)酵培養(yǎng)基的成分為本領(lǐng)域熟知。所述發(fā)酵方法可以是需氧或者厭氧發(fā)酵方法。厭氧發(fā)酵方法在本文定義為這樣的發(fā)酵方法，所述方法在沒(méi)有氧或者其中基本上沒(méi)有氧被消耗的條件下運(yùn)行，優(yōu)選消耗的氧低于5、2. 5或者lmmol/L/h，更優(yōu)選Ommol/L/h (即氧消耗不可檢測(cè))，且其中有機(jī)分子作為電子供體和電子受體。在沒(méi)有氧的條件下，糖酵解和生物質(zhì)形成中產(chǎn)生的NADH不能通過(guò)氧化磷酸化作用而被氧化。為了解決這個(gè)問(wèn)題，許多微生物使用丙酮酸鹽/酯或者其衍生物之一作為電子和氫受體，從而再生NAD+。因此，在優(yōu)選的厭氧發(fā)酵方法中，丙酮酸鹽/酯被用作電子(和氫受體)，并被還原成發(fā)酵產(chǎn)物如乙醇，以及非乙醇發(fā)酵產(chǎn)物如乳酸、3-羥基-丙酸、丙烯酸、乙酸、琥珀酸、檸檬酸、氨基酸、1，3-丙二醇、乙烯、甘油、丁酸、己酸鹽/ 酯(caproate)、丁醇、乙醛酸(glyoxylate)、β -內(nèi)酰胺抗生素以及頭孢菌素類(lèi)。本發(fā)明的厭氧方法相對(duì)于需氧方法是優(yōu)選的，因?yàn)閰捬醴椒ú恍枰糜谕獾耐度?investments) 和能量，并且此外厭氧方法產(chǎn)生比需氧方法更高的產(chǎn)物產(chǎn)量。或者，本發(fā)明的發(fā)酵方法可以在需氧的限氧條件下進(jìn)行。優(yōu)選地，在限氧條件下的需氧方法中，氧消耗速率為至少5. 5、更優(yōu)選至少6、甚至更優(yōu)選至少7mmol/L/h。所述發(fā)酵方法優(yōu)選在對(duì)于本發(fā)明經(jīng)修飾的細(xì)胞最佳的溫度下進(jìn)行。因此，對(duì)于大多數(shù)酵母或者真菌細(xì)胞而言，所述發(fā)酵方法在低于42°C的溫度進(jìn)行，優(yōu)選低于38°C。對(duì)于酵母或者絲狀真菌細(xì)胞，所述發(fā)酵方法優(yōu)選在低于35、33、30或并高于20、22或25°C 的溫度進(jìn)行。優(yōu)選地，在本發(fā)明的發(fā)酵方法中，所述細(xì)胞穩(wěn)定保持著賦予細(xì)胞將木糖異構(gòu)化為木酮糖、及任選地將阿拉伯糖異構(gòu)化為D-木酮糖5-磷酸酯能力的所述核酸構(gòu)建體。優(yōu)選地，在所述方法中，至少10、20、50或者75%的細(xì)胞(優(yōu)選在工業(yè)化發(fā)酵條件下)生長(zhǎng)50世代之后保持將木糖異構(gòu)化為木酮糖及任選地將阿拉伯糖異構(gòu)化為D-木酮糖5-磷酸酯的能力。優(yōu)選的本發(fā)明發(fā)酵方法是用于產(chǎn)生乙醇的方法，其中所述包括如下步驟a)將含有木糖及任選存在的阿拉伯糖來(lái)源的培養(yǎng)基與如上所述細(xì)胞發(fā)酵，其中所述細(xì)胞將木糖及任選存在的阿拉伯糖發(fā)酵成為乙醇，及任選地b)回收所述乙醇。所述發(fā)酵培養(yǎng)基可如上所述進(jìn)一步進(jìn)行。在所述方法中，乙醇體積產(chǎn)率優(yōu)選為每升每小時(shí)至少0. 5,1. 0,1. 5,2. 0、 2. 5,3. 0,5. 0或者10. Og乙醇。在所述方法中，在木糖和/或葡萄糖和/或阿拉伯糖上的乙醇產(chǎn)量為至少50、60、70、80、90、95或者98%。乙醇產(chǎn)量在本文定義為理論最大產(chǎn)量的百分比，對(duì)于木糖、葡萄糖和阿拉伯糖為每g木糖、葡萄糖或阿拉伯糖0. 51g乙醇。進(jìn)一步優(yōu)選的本發(fā)明發(fā)酵方法是這樣的方法，其包括發(fā)酵含有木糖來(lái)源和阿拉伯糖來(lái)源的培養(yǎng)基，然而其中使用兩種單獨(dú)的菌株的細(xì)胞，第一種菌株細(xì)胞如上文所定義，除了該第一種菌株細(xì)胞不具有將阿拉伯糖轉(zhuǎn)化為D-木酮糖5-磷酸酯的能力，該第一種菌株細(xì)胞將木糖發(fā)酵為發(fā)酵產(chǎn)物；第二種菌株細(xì)胞如上文定義，除了該第二種菌株細(xì)胞不具有將木糖(直接)異構(gòu)化為木酮糖的能力，該第二種菌株細(xì)胞將阿拉伯糖發(fā)酵為發(fā)酵產(chǎn)物。所述方法任選包括回收發(fā)酵產(chǎn)物的步驟。所述第一種和第二種細(xì)胞其它方面進(jìn)一步如上文所述。在本說(shuō)明書(shū)及其權(quán)利要求書(shū)中，動(dòng)詞“包含”及其變化以其非限制性含義應(yīng)用，是指在該動(dòng)詞后面的項(xiàng)目被包括在內(nèi)，但是不除外未特別提及的項(xiàng)目。此外，在以不定冠詞 “一個(gè)(a)”提及元件時(shí)，并不排除存在一個(gè)以上該元件，除非明確要求一個(gè)(one)及只是這些元件之一的情況。不定冠詞“一個(gè)”因此通常是指“至少一個(gè)”。本說(shuō)明書(shū)中引用的所有專(zhuān)利和文獻(xiàn)均以其全部?jī)?nèi)容援引加入本文。提供如下實(shí)施例只是舉例說(shuō)明本發(fā)明，不以任何方式限制本發(fā)明的范圍。附圖
描述Sl 經(jīng)測(cè)試在酵母中表達(dá)的木糖異構(gòu)酶的系統(tǒng)樹(shù)。實(shí)施例1.育汰1. 1宿主牛物體宿主酵母株是RN1000。這個(gè)酵母株是酵母株RWB 218的衍生物(Kuyper et al.，F(xiàn)EMS Yeast Research 5，2005，399-409)。編碼 Piromyces XylA 的質(zhì)粒 PAKX002在RN1000中丟失。所述宿主株的基因型是.MatA，ura3_52，leu2_112， gre3::hphMX, IoxP-Ptpi::TAL1, IoxP-Ptpi::RKI1, pUGPtpi-TKLl， pUGPtpi-RPEl, {p415 PadhlXKSlTcycl-LEU2}。1. 2具有合成的XI基因的表汰構(gòu)津體將合成的密碼子優(yōu)化的(針對(duì)啤酒糖酵母)XI基因用^CbaI (在所述合成的基因的5’末端)和BamHI(在所述合成的基因的3’末端)限制位點(diǎn)克隆進(jìn)pRS306的衍生物(Sikorski R. S. , Hieter P. , 1989, “ A system of shuttle vectors and yeast host strains designed for efficient manipulation of DNA in Saccharomyces cerevisiae " Genetics 122 :19-27)中，所述衍生物包含啤酒糖酵母的TPIl啟動(dòng)子 (899bp)和CYCl終止子Q88bp)序列，。在ATG之前的頭三個(gè)核苷酸被修飾為AAA，以?xún)?yōu)化表達(dá)。表1提供了經(jīng)測(cè)試的XI序列的列表以及表示所述合成的序列的相應(yīng)SEQ ID N0.。 基因由GeMcript公司(zie www. genscript. com)合成并克隆于pUC57中運(yùn)送http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/viewer.fcgi ？ db = nuccore&id = 2440162.以酵母基因組DNA作為模板，在使用如下引物進(jìn)行的PCR中獲得TPI啟動(dòng)子正向引物AAACCGGTTTCTTCTTCAGATTCCCTC反向引物TTAGATCTCTAGATTTATGTATGTGTTTTTTGTAGT以酵母基因組DNA作為模板，在使用如下引物進(jìn)行的PCR中獲得CYCl終止子正向引物AAGAATTCGGATCCCCTTTTCCTTTGTCGA反向引物AACTCGAGCCTAGGAAGCCTTCGAGCGTC1. 3宿主生物體的轉(zhuǎn)化及轉(zhuǎn)化體的選擇使用“Gietz 方法”(Gietz et al.，1992，Nucleic Acids Res. 1992 Mar 25; 20(6) :1425.),用質(zhì)粒轉(zhuǎn)化RN1000。在礦物質(zhì)培養(yǎng)基(YNB+2%葡萄糖)上經(jīng)尿嘧啶互補(bǔ)初步選擇轉(zhuǎn)化體。1.4酶測(cè)定木糖異構(gòu)酶活性在37°C于反應(yīng)混合物中測(cè)定，所述反應(yīng)混合物含有50mM磷酸鹽緩沖液(pH 7.0)、10mM木糖、IOmM MgCl2及適量無(wú)細(xì)胞提取物。一單位的活性定義為在測(cè)定條件下每分鐘產(chǎn)生Inmol木酮糖的所述酶的量。所形成的木酮糖通過(guò)Dische和 Borenfreund (Dische and Borenfreund, 1951, J. Biol. Chem. 192 :583-587)所述的方法來(lái)確定，或者通過(guò)HPLC確定(使用在80°C運(yùn)行的Biorad HPX-87N柱，并使用0. OlM Na2HPO4 作為洗脫液以0.6ml/min洗脫)。木糖和木酮糖通過(guò)反射指數(shù)檢測(cè)器(Refractive Index detector)在60°C的內(nèi)部溫度檢測(cè)。比活性以“活性單位每mg蛋白質(zhì)”表示。使用Bio-Rad蛋白質(zhì)試劑 (Bio-RadLaboratories, Richmond, CA, USA)確定蛋白質(zhì)，用牛Y-球蛋白作為標(biāo)準(zhǔn)。1. 5經(jīng)轉(zhuǎn)化的細(xì)胞的牛理特件將經(jīng)轉(zhuǎn)化的細(xì)胞在葡萄糖為唯一碳源的基本培養(yǎng)基上進(jìn)行若干次菌落純化。隨后，使經(jīng)過(guò)菌落純化的轉(zhuǎn)化細(xì)胞在搖瓶中在存在氧的條件下于具有2% (w/v)木糖作為碳源/能量源的合成培養(yǎng)基上生長(zhǎng)。結(jié)果在表2中示出，其中“ + ”表示細(xì)胞顯示出顯著的生長(zhǎng)。符號(hào)“_”表示未出現(xiàn)顯著的生長(zhǎng)。隨后測(cè)試消耗木糖而生長(zhǎng)的菌株在木糖消耗伴隨乙醇形成條件下的厭氧生長(zhǎng)的能力。用Cyllamyces aberensis、玻璃海鞘、難辨梭菌、脆弱梭桿菌和死亡梭桿菌的木糖異構(gòu)酶轉(zhuǎn)化的菌株能在木糖上厭氧生長(zhǎng)，且具有比得上現(xiàn)有技術(shù)中Piromyces酶轉(zhuǎn)化的菌株的生長(zhǎng)速度、生物質(zhì)和乙醇產(chǎn)量，例如比得上先前Kuyper et al. (2005,FEMS Yeast Res. 5 925-934)所描述的RWB218。而用難辨梭菌XI轉(zhuǎn)化的細(xì)胞在木糖發(fā)酵中在生長(zhǎng)速度方面示出最佳性能。類(lèi)似地，本發(fā)明經(jīng)轉(zhuǎn)化的細(xì)胞也能利用混合底物。當(dāng)經(jīng)轉(zhuǎn)化的細(xì)胞在葡萄糖與木糖的混合物(每種糖均為20g/l)中生長(zhǎng)時(shí)，這兩種糖均被完全消耗，但是葡萄糖是優(yōu)選的底物。木糖消耗僅在大約80%葡萄糖被消耗之后才開(kāi)始。所產(chǎn)生的乙醇解釋了在用 Cyllamyces aberensis、玻璃海鞘、難辨梭菌、脆弱梭桿菌和死亡梭桿菌的木糖異構(gòu)酶轉(zhuǎn)化的菌株的每種情況中葡萄糖和木糖的總消耗。表1
CAICAI核苷酸氨基酸名稱(chēng)長(zhǎng)度初始優(yōu)化SEQIDSEQ基因基因NOID NOPiromyces_sp_E213140.5470.996183Cyllamyces_aberensis13140.5690.989194Clostridium_difficile13380.1070.987161Bacteroides^Jragilis13200.1040.976207CionaJntestinalis13710.1190.993172Thermotoga_maritima13350.0970.9832310Haemophilus一somnus13200.1451.0002411Pkyscomitrella_patens14400.0900.9882613Arabidopsis一thaliana14340.1541.0002512Arthrobacterjiurescens11880.0820.988229Burkholderia _phytofirmans13230.0650.982218Orpinomyces_sp._\J\sk\13140.515未測(cè)試未測(cè)試5Fusobacteriumjnortiferurn13110.1060.9893835表權(quán)利要求
1.一種包含核苷酸序列的真核微生物細(xì)胞，所述核苷酸序列的表達(dá)在細(xì)胞中賦予了或者增加了直接將木糖異構(gòu)化為木酮糖的能力，其中所述核苷酸序列編碼具有木糖異構(gòu)酶活性的多肽，所述多肽包含氨基酸序列，該氨基酸序列含有選自由如下組成的組的一或多個(gè)氨基酸序列元件(a)在第91位的甲硫氨酸殘基，(b)在第134-139位的氨基酸序列TGIKLL，(c)在第230位的苯丙氨酸殘基，(d)分別在第264和265位的氨基酸苯丙氨酸和賴(lài)氨酸，(e)在第274-278位的氨基酸序列TLAGH，(f)在第387-391位的氨基酸序列RYASF，(g)在第394位的甘氨酸殘基，以及(h)在第431位的丙氨酸殘基，其中所述多肽不包含與SEQ ID NO :3-7之一具有95%以上序列相同性的氨基酸序列。
2.權(quán)利要求1的真核微生物細(xì)胞，其中編碼木糖異構(gòu)酶的核苷酸序列選自由如下組成的組(a)編碼具有木糖異構(gòu)酶活性的多肽的核苷酸序列，所述多肽包含與SEQID NO. 1的氨基酸序列具有至少45%序列相同性的氨基酸序列，(b)編碼具有木糖異構(gòu)酶活性的多肽的核苷酸序列，所述多肽包含與SEQID NO. 2的氨基酸序列具有至少45%序列相同性的氨基酸序列，(c)編碼具有木糖異構(gòu)酶活性的多肽的核苷酸序列，所述多肽包含與SEQID NO. 35的氨基酸序列具有至少45%序列相同性的氨基酸序列，(d)核苷酸序列，其互補(bǔ)鏈與(a)、(b)或(c)的核苷酸序列雜交，以及(e)核苷酸序列，其序列由于遺傳密碼的簡(jiǎn)并性而與(d)的核苷酸序列的序列不同。
3.權(quán)利要求2的細(xì)胞，其中所述核苷酸序列編碼可得自梭菌(Clostridium)和梭桿菌 (Fusobacterium)菌屬的細(xì)菌或者玻璃海鞘(Conia)屬的被囊動(dòng)物的氨基酸序列。
4.前述任一項(xiàng)權(quán)利要求的細(xì)胞，其中所述細(xì)胞是選自由如下組成的組的屬的酵母或者絲狀真菌糖酵母(Saccharomyces)、克魯維氏酵母(Kluyveromyces)、假絲酵母(Candida)、畢赤氏酵母(Pichia)、裂殖糖酵母(Schizosaccharomyces)、漢遜氏酵母(Hansenula)、克勒克氏酵母(Kloeckera)、許旺氏酵母(ktiwanniomyces)、耶氏酵母 (Yarrowia)、曲霉菌(Aspergillus)、木霉菌(Trichoderma)、腐質(zhì)霉菌(Humicola)、支頂孢 (Acremonium)、鍵刀菌(Fusarium)以及青霉菌(Penicillium)0
5.權(quán)利要求4的細(xì)胞，其中所述細(xì)胞是能夠厭氧成醇發(fā)酵的酵母。
6.權(quán)利要求5的細(xì)胞，其中所述酵母屬于選自由以下組成的組的種啤酒糖酵母(S. cerevisiae)、微小糖酵母(S. exiguus)、巴揚(yáng)氏糖酵母(S. bayanus)、乳克魯維氏酵母(K. lactis)、馬克斯克魯維氏酵母(K. marxianus)和粟酒裂殖糖酵母 (Schizosaccharomyces pombe)0
7.前述任一項(xiàng)權(quán)利要求的細(xì)胞，其中編碼具有木糖異構(gòu)酶活性的多肽的核苷酸序列與啟動(dòng)子可操縱地連接，所述啟動(dòng)子引起所述核苷酸序列在細(xì)胞中的充分表達(dá)以賦予該細(xì)胞將木糖異構(gòu)化為木酮糖的能力。
8.前述任一項(xiàng)權(quán)利要求的細(xì)胞，其中所述細(xì)胞進(jìn)一步包含增加特異性木酮糖激酶活性的遺傳修飾。
9.前述任一項(xiàng)權(quán)利要求的細(xì)胞，其中所述細(xì)胞包含增加戊糖磷酸途徑通量的遺傳修飾。
10.前述任一項(xiàng)權(quán)利要求的細(xì)胞，其中所述宿主細(xì)胞包含降低細(xì)胞中非特異性醛糖還原酶活性的遺傳修飾。
11.前述任一項(xiàng)權(quán)利要求的細(xì)胞，其中所述細(xì)胞展現(xiàn)出將L-阿拉伯糖轉(zhuǎn)化為D-木酮糖 5-磷酸酯的能力。
12.前述任一項(xiàng)權(quán)利要求的細(xì)胞，其中所述細(xì)胞包含至少一種進(jìn)一步的遺傳修飾，其導(dǎo)致選自由以下組成的組的特性(a)增加木糖和阿拉伯糖中至少一種向宿主細(xì)胞中的轉(zhuǎn)運(yùn)，(b)降低對(duì)分解代謝產(chǎn)物阻抑的敏感性，(c)提高對(duì)乙醇、摩爾滲透壓濃度或者有機(jī)酸的耐受性，和(d)減少副產(chǎn)物的產(chǎn)生。
13.前述任一項(xiàng)權(quán)利要求的細(xì)胞，其中所述細(xì)胞具有產(chǎn)生至少一種選自由以下組成的組的發(fā)酵產(chǎn)物的能力乙醇、乳酸、3-羥基丙酸、丙烯酸、乙酸、琥珀酸、檸檬酸、氨基酸、1， 3-丙二醇、乙烯、甘油、丁酸、己酸鹽/酯、丁醇、乙醛酸、β -內(nèi)酰胺抗生素和頭孢菌素類(lèi)。
14.產(chǎn)生選自由如下組成的組的發(fā)酵產(chǎn)物的方法乙醇、乳酸、3-羥基丙酸、丙烯酸、 乙酸、琥珀酸、檸檬酸、氨基酸、1，3_丙二醇、乙烯、甘油、丁酸、己酸鹽/酯、丁醇、乙醛酸、 β -內(nèi)酰胺抗生素和頭孢菌素類(lèi)，其中所述方法包括如下步驟；(a)將含有木糖來(lái)源及任選存在的阿拉伯糖來(lái)源的培養(yǎng)基與權(quán)利要求1-13任一項(xiàng)的細(xì)胞發(fā)酵，其中細(xì)胞將木糖發(fā)酵成所述發(fā)酵產(chǎn)物，及任選地(b)回收所述發(fā)酵產(chǎn)物。
15.權(quán)利要求14的方法，其中所述培養(yǎng)基還含有葡萄糖來(lái)源。
全文摘要
本發(fā)明涉及具有將木糖直接異構(gòu)化為木酮糖的能力的真核細(xì)胞。所述細(xì)胞通過(guò)轉(zhuǎn)化了編碼木糖異構(gòu)酶的核苷酸序列而獲得這個(gè)能力，所述木糖異構(gòu)酶具有異構(gòu)酶典型的一或多個(gè)特異性序列元件，具有在酵母中功能性表達(dá)的能力，例如可得自梭菌(Clostridium)和梭桿菌(Fusobacterium)屬細(xì)菌或者玻璃海鞘(Ciona)屬的被囊動(dòng)物(tunicate)的木糖異構(gòu)酶。所述細(xì)胞優(yōu)選是酵母或者絲狀真菌，更優(yōu)選是能厭氧成醇發(fā)酵的酵母?？蛇M(jìn)一步包含一或多種遺傳修飾，其增加戊糖磷酸途徑的通量、降低非特異性醛糖還原酶活性、賦予細(xì)胞增加特異性木酮糖激酶活性的能力、將L-阿拉伯糖轉(zhuǎn)化為D-木酮糖5-磷酸酯、增加木糖和阿拉伯糖至少之一向宿主細(xì)胞中轉(zhuǎn)運(yùn)、降低分解代謝產(chǎn)物阻抑的敏感性、增加乙醇、摩爾滲透壓濃度或者有機(jī)酸耐受性；和/或降低副產(chǎn)物的產(chǎn)生。所述細(xì)胞優(yōu)選是具有產(chǎn)生發(fā)酵產(chǎn)物的能力的細(xì)胞，所述發(fā)酵產(chǎn)物如乙醇、乳酸、3-羥基-丙酸、丙烯酸、乙酸、琥珀酸、檸檬酸、氨基酸、1，3-丙二醇、乙烯、甘油、β-內(nèi)酰胺抗生素以及頭孢菌素類(lèi)。本發(fā)明進(jìn)一步涉及生產(chǎn)這些發(fā)酵產(chǎn)物的方法，其中本發(fā)明的細(xì)胞用于將木糖發(fā)酵成為所述發(fā)酵產(chǎn)物。
文檔編號(hào)C12N1/19GK102307987SQ200980152674
公開(kāi)日2012年1月4日 申請(qǐng)日期2009年12月24日 優(yōu)先權(quán)日2008年12月24日
發(fā)明者A·W·R·H·特尼桑, J·A·M·德邦塔 申請(qǐng)人:C5酵母有限責(zé)任公司