專利名稱：調(diào)節(jié)配子體自交不親合性的化合物,調(diào)控植物的配子體自交不親合性的方法和用上述調(diào) ...的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種用于配子體自交不親合性的調(diào)節(jié)化合物，一種植物的配子體自交不親合性的調(diào)控方法和利用該調(diào)控方法的自花授粉植物。特別是，本發(fā)明涉及一種用于配子體自交不親合性的調(diào)節(jié)性化合物，該化合物包含有硫酸鹽，尤其是CuSO4和ZnSO4作為一種抑制劑，它能阻止一種中柱特異性的、可調(diào)節(jié)對配子體自交不親合性的RNA酶的活性；一種對植物配子體自交不親合性的調(diào)控方法，是通過應(yīng)用配子體自交不親合性的調(diào)節(jié)性化合物來實現(xiàn)的；和一種植物通過應(yīng)用上述的調(diào)控方法破壞的配子體自交不親合性，自花授粉。
背景技術(shù)：
世界上有一多半植物的花，存在配子體的自交不親合性。這種配子體的自交不親合性，則意味著它們具有不能自花授粉的特性。因此，配子體自交不親合性的植物只可能通過接受不同種的花粉進行授粉。那么，假如只有一個種類，那么這樣的植物則只能夠開花而不能結(jié)出果實。
另一方面，在屬于不同種類間的植物的自然授粉，是通過一些傳授花粉者來中介的，如蜜蜂和蜂蠅，或者通過風(fēng)。然而，傳授花粉者在近年來突然由于環(huán)境的污染而減少，這是因為農(nóng)用化學(xué)藥品的過度應(yīng)用和高速發(fā)展的工業(yè)化所造成的。盡管授粉者和授粉器有足夠的數(shù)量，但假如傳授花粉者的工作被一些天氣情況的阻礙因素所擾亂，要獲得穩(wěn)定的結(jié)果實率則是很困難的，而這些天氣情況諸如低溫寒冷、強風(fēng)和暴雨，可在每年的開花季節(jié)出現(xiàn)。
此外，在溫室內(nèi)所培育的單一一種高收益農(nóng)作物時，因為傳授花粉者的不足，自然結(jié)果實率也會進一步降低。
因此，在自然授粉的情況下，既然要獲得農(nóng)作物結(jié)實的穩(wěn)定性和果實的高質(zhì)量是很困難的，而近年來已經(jīng)通過應(yīng)用引進花粉進行人工授粉，或者應(yīng)用一種釋放傳授花粉器的方法進行人工授粉，例如使用可在開花季節(jié)人工釋放國外引進的壁蜂(Osmia ocrnifrons)。特別是，在人工授粉的方法中，來自不同傳授花粉器的花粉，被人工而不是通過傳授花粉者涂布在中柱的柱頭上。而這是不經(jīng)濟的，因為它需要許多的勞動力和高昂的花費。
在天然的果樹、開花的植物、藥用植物以及茄科蔬菜中，一種中柱特異性的RNA酶，它是由一生殖器官----雌蕊所分泌產(chǎn)生的。按照物種存在于中柱內(nèi)的RNA酶具有不同的遺傳顯性，其作用機理如下當(dāng)自身花粉管自雌蕊的中柱延長至子房時，即可分泌出中柱特異性RNA酶，并且只有自身花粉的rRNA被選擇性減少(McClure等，Nature，1991)。依照此機制，花粉管不延長至子房，簡而言之，在一個特殊的部位------雌蕊的1/3處，阻止花粉管的延長，并且最終的果實則由于不能完成自身花粉授粉的結(jié)果而不能結(jié)出。
此外，根據(jù)現(xiàn)今的研究，由中柱分泌的RNA酶，可非選擇性地進入自身或者非自身的花粉中，但在自身花粉，RNA酶可結(jié)合到一種抑制劑或者一種受體上，它們與RNA酶進行特異性反應(yīng)。并推測這種反應(yīng)與選擇性自身花粉的rRNA減少的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑相關(guān)，而且萬一自花授粉，因為自身花粉管在到達子房以前被破壞，使授粉不能完成。
另一方面，來源于傳授花粉者的、通過傳授花粉器或者風(fēng)轉(zhuǎn)移來的具有遺傳顯性的非自身花粉，則能夠正常延長花粉管。這種現(xiàn)象是根據(jù)目前的研究，推論出的假說加以闡明。本假說如下由于與來自不同顯性的花粉的雌蕊所分泌的RNA酶結(jié)合的受體結(jié)構(gòu)，與那種自我顯性的受體的結(jié)構(gòu)不同，信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑則不能繼續(xù)向下進行。結(jié)果，RNA酶就沒有作用于非自身花粉的rRNA，并且導(dǎo)致正常的花粉管的延伸，以致于最終得以授粉。
然而，現(xiàn)在世界上有許多的研究者，正在對花粉的一種抑制劑或者一種受體的分子進行研究，但他們卻沒有明確的線索。僅僅有報道通過采用顯微鏡的觀察和免疫學(xué)方法，在花粉管的延伸組織中發(fā)現(xiàn)，RNA酶的分泌產(chǎn)生來自于中柱。
此外，已經(jīng)有報道象蘋果樹、梨樹、咖啡樹以及杏樹，還有一些開花性植物、藥用性植物和例如野生型西紅柿、茄子、煙草和馬鈴薯的茄科植物，這些果樹的配子體的自交不親合性，是由雌蕊(中柱)-和基因-特異性RNA酶來進行調(diào)節(jié)的(Il-Kyung，Chung 等.，PlantMolecular Biology，26757-762，1994；Il-Kyung，Chung 等.，Journal ofKorean Breeding Science，29(1)41-46，1997；Il-Kyung，Chung 等.，Journal of Plant Physiology，15463-70，1999)。
與這些報道相比，在1992年，發(fā)明者本人此前所報道的則是中柱特異性RNA酶是孤立存在于野生型西紅柿的(Il-Kyung，Chung etal.，Bioscience Biotechnology Biochemistry 57(7)1172-1176，1993；Japanese patent application No.1,262,865)。還有發(fā)明者本人認識到的，與象西紅柿和Lillop Koreana Kakai植物配子體自交不親合性相關(guān)的基因(Il-Kyung，Chung 等.，Plant Molecular Biology，26757-762，1994；Il-Kyung，Chung 等.，Plant Cell Physiology，36(8)1621-1627，1995；Japanese Patent No.7-187557)。
為解決配子體自交不親合性植物的問題，本發(fā)明人提供了一種防止中柱特異性的RNA酶的活性的抑制劑、提供了一種應(yīng)用該抑制劑對配子體自交不親合性的調(diào)控方法和自花的授粉植物，并且提出了一種新的農(nóng)業(yè)手段，即通過果樹的授粉來操縱植物，或者通過自身花粉來結(jié)出果實，這既非常經(jīng)濟，又能夠保證果實的高質(zhì)量。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種用于配子體自交不親合性的調(diào)節(jié)化合物，該化合物包含有一種抑制劑，后者能夠阻止中柱特異性RNA酶以調(diào)節(jié)配子體的自交不親合性。
本發(fā)明的另一個目的是提出一種調(diào)控方法，即通過應(yīng)用上述的調(diào)節(jié)性化合物來調(diào)控配子體自交不親合性的方法。
本發(fā)明還有一個目的是，在配子體自交不親合性遭受破壞的情況下，提供一種自花授粉形式的植物。
下面對本發(fā)明進行詳細描述。
本發(fā)明提供了一種用于配子體自交不親合性的調(diào)節(jié)化合物，該化合物包含有一種抑制劑，后者能夠抑制中柱特異性RNA酶的活性，以調(diào)節(jié)配子體的自交不親合性。
本發(fā)明人已經(jīng)試圖通過調(diào)控存在于自然界中的配子體的自交不親合性，通過發(fā)現(xiàn)與配子體的自交不親合性相關(guān)的中柱特異性RNA酶的抑制劑，來誘導(dǎo)采用自體花粉進行授粉。
首先，本發(fā)明人從富士(Fuji)蘋果的繁殖器官，中柱中分離并且提純出RNA酶，中柱在導(dǎo)致配子體自交不親合性上起著關(guān)鍵性的作用(參見表2)。隨后，本發(fā)明者分別從富士蘋果的根、葉、莖、花瓣和花萼中分離出RNA酶，并且采用從富士蘋果的中柱中分離出的RNA酶來電泳上述的RNA酶。由此，本發(fā)明者采用RNA酶的活性染色法已證實，從中柱分離出的RNA酶是一種中柱特異性的RNA酶(參見


圖1)。此外，為研究品系間的中柱特異性RNA酶的差異，本發(fā)明者又從Hongro、Hongok、富士、Gookwang和Sgaroo蘋果的中柱中分離和提純出RNA酶，然后，進行RNA酶活性染色和銀染色。結(jié)果證實，依照蘋果品種不同，中柱特異性的RNA酶是不同的(參見圖2)。
為證實富士蘋果的中柱特異性的RNA酶可調(diào)控配子體的自交不親合性，本發(fā)明人采用增加中柱特異性的RNA酶來介導(dǎo)花粉管的延伸，觀察到了富士蘋果的花粉管的延伸模式(William Jahnen 等，Plant Cell，(1)501-510，1989；Harris et al.，Plant Physiology，189360-367，1989)，這就可能以人工花粉來誘導(dǎo)花粉管的延伸(參見圖3)。
由于這種結(jié)果，通過抑制花粉管的延伸，中柱特異性的RNA酶來調(diào)控配子體的自交不親合性，則可能被證實。
本發(fā)明人通過采用增加富士蘋果的中柱特異性RNA酶、和不同的花粉管延伸培養(yǎng)基的化學(xué)試劑，并且通過應(yīng)用本發(fā)明中所提供的獨創(chuàng)性的實驗方法，觀察到了富士蘋果的花粉管的延伸模式(參見圖4和圖5)。結(jié)果，抑制花粉管延伸的RNA酶活性，可被一種硫酸鹽有效地加以抑制，并且使得花粉管正常地延伸。出于此結(jié)果，證實了金屬離子的硫酸鹽是一種RNA酶的抑制劑。因此，作為一種調(diào)節(jié)配子體自交不親合性的化合物，硫酸鹽尤其是象CuSO4，MgSO4，ZnSO4和MnSO4，這些硫酸鹽的功能則是更適宜于是配子體自交不親合性的調(diào)節(jié)性化合物，而CuSO4和ZnSO4更是如此。
此外，本發(fā)明通過應(yīng)用配子體自交不親合性的調(diào)節(jié)性化合物，提供了一種針對配子體的自交不親合性的調(diào)控方法。
建立在通過應(yīng)用花粉管延伸培養(yǎng)基得出的實驗結(jié)果的基礎(chǔ)上，本發(fā)明者在野生型西紅柿和富士蘋果中，通過采用本發(fā)明中的、針對配子體自交不親合性的調(diào)節(jié)性化合物，實現(xiàn)了這種配子體自交不親合性的抑制性作用，它們均是生長在實際培育環(huán)境中的配子體自交不親合性農(nóng)作物。
首先，來確定本發(fā)明中針對配子體自交不親合性的調(diào)節(jié)性化合物的應(yīng)用時期，本發(fā)明者在野生型西紅柿開花前2天，以1mM(1毫摩爾濃度)的CuSO4和ZnSO4來處理它們7天；并且在富士蘋果開花前2天，應(yīng)用1毫摩爾濃度的CuSO4和ZnSO4來處理它們5天，在完全開花后研究自花授粉率。在開花的早期，即從開花前的7天到開花前的4天，當(dāng)應(yīng)用本發(fā)明中的配子體自交不親合性的調(diào)節(jié)性化合物處理野生型西紅柿?xí)r，結(jié)果實率可超過70％。并且，在開花的早期，即從開花前的5天到開花前的3天，當(dāng)應(yīng)用本發(fā)明中的配子體自交不親合性的調(diào)節(jié)性化合物處理富士蘋果時，其結(jié)果實率也可超過70％。因此，植物的配子體自交不親合性，能夠采用噴灑配子體自交不親合性調(diào)節(jié)性化合物的方法加以調(diào)控，該調(diào)節(jié)性化合物可包括一種在植物生長的一個特定時期的、中柱特異性RNA酶活性的抑制劑，并且更可取的是，配子體自交不親合性調(diào)節(jié)性化合物的應(yīng)用時期發(fā)芽形成時期----即一個植物生長的特定時期，到開花的早期----即在完全開花之前。
而且，為研究本發(fā)明中的、更適宜的、配子體自交不親合性調(diào)節(jié)性化合物的應(yīng)用濃度，我們在開花時期的早期，應(yīng)用了0或者1,500ppm的CuSO4和ZnSO4處理野生型的西紅柿和富士蘋果，并且研究了藥物的有害影響和結(jié)果實率的情況(參見圖6和圖7)。由于本發(fā)明中的配子體自交不親合性調(diào)節(jié)性化合物的可吸收率，能夠通過在培育果樹中應(yīng)用分散劑而增加，在一個特定的時期，也就是開花的早期，通過采用噴灑果樹的方法，應(yīng)用分散劑處理CuSO4和ZnSO4。
因而，在野生型西紅柿和富士蘋果中使用的CuSO4和ZnSO4的特定濃度----該藥物濃度是無害的作用濃度，顯示能夠獲得采用自身花粉授粉的水果和莊稼。出于這些結(jié)果，能夠得出這樣的結(jié)論本發(fā)明中的中柱特異性的RNA酶----一種化合物抑制劑，在抑制中柱特異性的RNA酶上是有效的，這種酶與植物的品系沒有關(guān)系，而且在開花的早期，應(yīng)用CuSO4處理的較適宜濃度在100到700ppm之間，而應(yīng)用ZnSO4處理的較適宜濃度在100到800ppm之間。此外，非常高的授粉率，藥品的無毒害作用，都可能由噴灑本發(fā)明的配子體自交不親合性的抑制劑化合物來達到，這是依照制造者的使用說明混合以合意數(shù)量的分散劑。在這些分散劑中，六十烷吡咯(hexaconazole)類、硅氧烷類和烷基芳基聚乙氧基化物類的分散劑更適宜于獲得高結(jié)果實率。
本發(fā)明中的針對配子體自交不親合性的抑制劑化合物，其更加理想的濃度如表1示。
表1.
中柱特異性RNA酶的抑制劑化合物的有效成分的合適濃度
正如表1中所顯示的，當(dāng)CuSO4作為一種中柱特異性RNA酶抑制劑的有效成分應(yīng)用時，如果CuSO4的濃度低于100ppm，而要獲得超過70％的穩(wěn)定結(jié)果實率是很困難的，因為它不能適當(dāng)抑制RNA的活性，另一方面，如果CuSO4的濃度大于700ppm，則是不經(jīng)濟的，因為這可能導(dǎo)致藥物的有害效應(yīng)。此外，當(dāng)ZnSO4作為一種中柱特異性RNA酶抑制劑的有效成分應(yīng)用時，如果ZnSO4的濃度低于100ppm，而要獲得超過70％的穩(wěn)定結(jié)果實率是很困難的，因為它不能適當(dāng)抑制RNA的活性，另一方面，如果ZnSO4的濃度大于800ppm，則是不經(jīng)濟的，因為這可能導(dǎo)致藥物的有害效應(yīng)。
而且，本發(fā)明提供了一種植物，通過應(yīng)用調(diào)控方法破壞配子體的自交不親合性而自花授粉。
正如以上提到的結(jié)果，一種配子體的自交不親合性破壞了的自花授粉植物，可能會通過應(yīng)用本發(fā)明中的配子體自交不親合性的調(diào)節(jié)性化合物加以獲取。在以下的范例中，將本發(fā)明中的配子體自交不親合性的調(diào)控方法應(yīng)用于植物，這些植物包括有果樹如蘋果、梨、咖啡和杏；開花性植物；藥用植物和茄科蔬菜如西紅柿、茄子、煙草和馬鈴薯，但富士蘋果和野生型西紅柿除外，它們被用于更適宜地體現(xiàn)本發(fā)明。
圖片的簡要說明
圖1顯示的是從富士蘋果的根、葉、莖、花瓣、花萼和中柱中分離的并且降解酵母核糖體RNA的RNA酶活性著色的結(jié)果。
→ 顯示中柱特異性RNA酶活性的一個條帶1道根 2道葉3道莖 4道花瓣5道花萼 6道中柱圖2.顯示的是從農(nóng)業(yè)蘋果品種Hongro、Hongok、富士、Gookwang和Sgaroo蘋果的中柱中分離出的總蛋白提取物的銀染色結(jié)果。
→顯示的是富士蘋果基因顯性-特異性RNA酶活性的一個條帶M標準分子量標記1道Hongro2道Hongok3道富士 4道Gookwang5道Sgaroo圖3顯示的是顯微照片的結(jié)果，即富士蘋果花粉管的延伸，在包含有中柱特異性RNA酶的花粉管延伸培養(yǎng)基中受到抑制。
A不添加RNA酶 B添加2個單位的RNA酶C添加4個單位的RNA酶D添加6個單位的RNA酶圖4顯示了一張圖表，可見抑制中柱特異性S1和S2 RNA酶活性的化學(xué)化合物的抑制程度，這是從富士蘋果的中柱中分離和提取的。
圖5顯示的顯微照片表示的是富士蘋果的花粉管在花粉管延伸培養(yǎng)基中延長的結(jié)果，該培養(yǎng)基含有一種中柱特異RNA酶和其中的抑制劑成分。
A添加1mM的ZnSO4和10個單位的RNA酶B添加2mM的ZnSO4和10個單位的RNA酶C添加5mM的ZnSO4和10個單位的RNA酶D添加1mM的CuSO4和10個單位的RNA酶E添加2mM的CuSO4和10個單位的RNA酶F添加5mM的CuSO4和10個單位的RNA酶圖6a為野生型西紅柿在開花的早期，用本發(fā)明中的中柱特異性RNA酶抑制劑化合物處理之前的情況的圖片。
圖6b為野生型西紅柿，用本發(fā)明中的中柱特異性RNA酶抑制劑化合物處理之后，破壞了配子體自交不親合性，自身花粉授粉的情況的圖片。
圖7a為開花的早期的富士蘋果，用本發(fā)明中的中柱特異性RNA酶抑制劑化合物處理之前的情況的圖片。
圖7b為富士蘋果，用本發(fā)明中的中柱特異性RNA酶抑制劑化合物處理之后，破壞了配子體自交不親合性，自身花粉授粉的情況的圖片。
實現(xiàn)本發(fā)明的最佳方式通過下面的范例，對本發(fā)明進行更明確的舉例說明。
然而，應(yīng)該理解的是，這些范例僅僅是提供了本發(fā)明的說明，而不是以各種方式對本發(fā)明有意限制。
例1中柱特異性的RNA酶的分離和純化，一種配子體自交不親合性的調(diào)控蛋白<1-1>從富士蘋果的每一種器官中進行RNA酶的分離和純化從富士蘋果的莖、根、葉、柄、花瓣和花萼中分離RNA酶，實驗步驟如下在1克富士蘋果的中柱中加入含有10mM Na2PO4(pH6.0)、10mM EDTA、1mM PMSF和1％聚乙烯吡咯烷的緩沖溶液，在研缽中將其混合均勻，提出總蛋白。利用40％的Na2PO4濃縮提出的總蛋白，然后，使用半透膜(分子分界值12,000道爾頓)將濃縮的總蛋白透析到5mM的Na2PO4緩沖溶液中。最后得到具有高度RNA酶活性的部分，總的RNA酶活性為295,000單位。
利用充滿生物凝膠P-60的樹脂柱(Bio-Rad，Englang)，將具有高度RNA酶活性的部分進行凝膠過濾層析(Harris 等，Plant Physiology，89360-367，1989；Anuradha Singh 等，Plant Physiology，9661-68，1991；Shihshie 等，Plant Cell，61021-1028，1994)。500μl具有高度RNA酶活性的片段，在4℃條件下，以1.5cm/小時的速度被吸附到層析柱上，而在同樣的條件下，被含有0.5M NaCl和50mM Na2PO4的緩沖溶液洗提出來。凝膠過濾層析的結(jié)果是，收集到了在中柱中特異性表達、分子量為23-25千道爾頓的1,282,000單位的RNA酶。
接下來，根據(jù)上述相同的方法，可以分別從富士蘋果的根、葉、柄、花瓣和花萼中分離和提純分子量為20-30千道爾頓的RNA酶。
<1-2>從富士蘋果各個器官中分離和提純的RNA酶的活性染色為了研究富士蘋果各個器官表達的RNA酶的器官特異性，在4℃條件下，將例1-l中分離和提純的各個器官的RNA酶在15％的聚丙烯酰胺凝膠上進行電泳。電泳后的凝膠浸泡于0.1M Tris-HCl(pH7.4)的緩沖溶液中。在37℃的條件下，加入300μg/ml真菌的核糖體RNA(Sigma公司，美國)作為底物進行酶促反應(yīng)，時間為120分鐘。
根據(jù)
圖1中顯示的活性染色結(jié)果，富士蘋果的莖、根、葉、柄、花瓣和花萼中的RNA酶，由于器官的不同而具有不同的分子量，從中柱中分離到的RNA酶是一種中柱特異性的RNA酶。
<1-3>研究不同品種的蘋果的中柱特異性RNA酶為了研究不同品種蘋果的中柱特異性RNA酶是否有所不同，我們采用如例1-1中所述的方法，分離和提純了不同品種蘋果中的RNA酶，這些蘋果品種包括Hongro、Hongok、富士、Gookwang和Sgaroo蘋果。然后根據(jù)如下所述的方法，進行RNA酶的活性染色和銀染色。
從各個品種的蘋果中分離和提純的RNA酶，按照例1-2中的方法進行活性染色。另外，將RNA酶在15％的聚丙烯酰胺凝膠上電泳，然后進行銀染色(Giulian G.G. 等，Anal.Biochem.，129，1983)。實驗結(jié)果見圖2。
實驗結(jié)果證實不同品種的蘋果，它們的中柱特異性RNA酶具有不同的分子量，并且，在授粉者和接受花粉的果樹中都有遺傳顯性的特異性RNA酶的表達。
<1-4>提純、制備高純度的中柱特異性RNA酶利用例1-1中的方法可以從富士蘋果中分離和提純中柱特異性RNA酶，如何獲得更高純度的RNA酶，其實驗步驟如下首先利用Centricon10(微孔過濾器)將中柱特異性RNA酶進行濃縮，然后使用單S柱(Amersham Pharmacia)和FPLC系統(tǒng)(Bio-Rad)進行離子交換層析，將RNA酶進一步純化。使用含有0.5M NaCl和50mM Na2PO4(pH6.0)的緩沖溶液洗提吸附在層析柱上的蛋白，速度為1.0 ml/分。
最后，收集到兩種具有高度活性的S1RNA酶和S2RNA酶片段。這是由于在富士蘋果中，存在兩種中柱特異性RNA酶，從遺傳學(xué)角度而言，這是一個雜合子。因此，收集到的RNA酶具有不同的分子量，表2中顯示了RNA酶的等電點和純度梯度(S自身不相容性)。
表2中柱特異性RNA酶每一步純化步驟中的酶活性概況

a總蛋白的活性總數(shù)(總蛋白×單位)b總活性除以總蛋白的值(總活性÷總蛋白)如表2顯示，S1RNA酶和S2RNA酶的總的酶活性分別為136單位和114單位。同樣，S1RNA酶和S2RNA酶的特定活性分別為8500單位和6000單位。如果假定總蛋白提取物為100％，S1RNA酶和S2RNA酶的純化效能分別為10％和14％。從這些結(jié)果可以看出，提純后的富士蘋果的中柱特異性RNA酶具有很高的純度。
例2富士蘋果的中柱特異性RNA酶對自身花粉中花粉管延長的抑制作用為了研究例1-4中提純的、中柱特異性RNA酶對自身花粉的花粉管延長所起的作用，我們進行了如下的實驗。首先，分離富士蘋果雄性花蕊中的自身花粉。分離出的花粉在用于花粉管延長的培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)，并在其中分別加入0，2，4和6個單位(mg-1min-1ml)的，由例1-4中提純的S1RNA酶，在黑暗條件下孵化24小時。用于花粉管延長的培養(yǎng)基含有20mM Mes-KOH(pH6.0)、0.07％Ca(NO3)2·4H2O、0.02％MgSO4·7H2O、0.01％KNO3、0.01％H3BO3和2％蔗糖，能夠人為地延長花粉管。
花粉管延長模式的實驗室結(jié)果見圖3。如圖3中所示，與不含有中柱特異性S1 RNA酶的對照組(A)相比，當(dāng)2，4，6個單位(B、C和D)的中柱特異性S1RNA酶加入之后，自身花粉的花粉管延長作用受到抑制。由這一結(jié)果可以證實，誘導(dǎo)配子體的自交不相容性的決定性因素是中柱特異性的RNA酶。
例3中柱特異性RNA酶抑制劑的研究通過加入作用為蛋白降解酶抑制劑的化學(xué)物質(zhì)，可以研究例1-4中提純的中柱特異性S1 RNA酶和S2 RNA酶的活性差異。通過加入普通的RNA酶活性激動劑、加入市場有售的RNA酶活性抑制劑和加入目前剛發(fā)明的中柱特異性RNA酶的抑制劑，可以檢測RNA酶的活性(Singh A.等，Plant Physiology，9661-68，1991)。具體而言，分別加入1mM EDTA，蛋白降解酶的一種代表性抑制劑；加入1mM氯化鈣，一種RNA酶活性激活劑；加入1mM DEPC(Sigma)，一種市場有售的具有致死毒性的RNA酶活性的抑制劑；以及1mM ZnSO4和1mM CuSO4，即中柱特異性RNA酶抑制劑，以檢測RNA酶的活性。實驗結(jié)果見圖4。
結(jié)果是與在磷酸緩沖液中具有100％RNA酶活性的對照組相比，當(dāng)分別加入1mM(大約是288ppm)ZnSO4和1mM(大約是250ppm)CuSO4時，中柱特異性RNA酶的活性被明顯抑制到15％以下。RNA酶活性抑制劑，例如DEPC，也可以抑制中柱特異性RNA酶的活性，但是僅限用于植物中，因為這些屬于具有致死毒性的物質(zhì)。這些結(jié)果證明ZnSO4和CuSO4是中柱特異性RNA酶活性的有效的抑制劑。
例4經(jīng)中柱特異性RNA酶抑制劑處理后的自身花粉的花粉管延長作用在例3中證明了ZnSO4和CuSO4是一種中柱特異性RNA酶抑制劑，為了研究它們對自身花粉的花粉管延長作用，我們進行了如下的實驗。在用于花粉管延長的培養(yǎng)基中加入10個單位(mg-1min-1ml-1)的中柱特異性S1 RNA酶，并分別加入1mM、2mM和5mM的ZnSO4和CuSO4。然后根據(jù)例2中所述的方法，進行花粉管培養(yǎng)。
圖5中顯示了花粉管延長的各種形式。從這一結(jié)果中我們發(fā)現(xiàn)通過加入1mM的ZnSO4、2mM的ZnSO4和1mM的CuSO4，可以克服RNA酶對花粉管延長的抑制作用，花粉管又重新延長了。這一實驗結(jié)果證實ZnSO4和CuSO4是針對中柱特異性RNA酶的有效的抑制劑。
例5在野生型西紅柿中決定中柱特異性RNA酶抑制劑的使用時期和研究藥物的果實形成率及其毒害作用<5-1>決定使用中柱特異性RNA酶抑制劑的時期為了檢測中柱特異性RNA酶抑制劑在實際培養(yǎng)環(huán)境中的作用，用本發(fā)明的中柱特異性RNA酶處理在溫室中培養(yǎng)的、以供研究的野生型西紅柿(位于Taegu天主教大學(xué)，Kyungsan市，Kyungsangpukdo，大韓民國)。在本發(fā)明中，實驗的環(huán)境條件能夠保持野生型西紅柿的遺傳上的單一品種，而野生型西紅柿是一種具有配子體自交不相容性的代表性植物。
為了決定使用中柱特異性RNA酶抑制劑的時期，分別在開花早期(萌芽形成期～完全開花前期)、開花中期(完全開花期)和開花晚期(完全開花后1天～花瓣凋落期)使用這些抑制劑。作為抑制劑，在上午9～11時加入1mM(大約是288ppm)的ZnSO4和1mM(大約是250ppm)的CuSO4，這是植物授粉最活躍的時間。我們還調(diào)查了果實形成率，每個實驗包括25個開花的時期(生殖器官包括雄性花蕊、柱頭和花瓣等等)，一共進行了4次重復(fù)性實驗，實驗結(jié)果及統(tǒng)計學(xué)數(shù)值如表3所示。
表3根據(jù)每一個開花期，中柱特異性RNA酶抑制劑處理后的野生型西紅柿的果實形成率

如表3所示，當(dāng)在開花的早期(完全開花前的4～7天)，用中柱特異性RNA酶抑制劑處理植物，可以達到超過70％的果實形成率。
<5-2>依照中柱特異性的RNA酶抑制劑的濃度來研究藥物對果實形成率的影響和不良影響本發(fā)明中的中柱特異性RNA酶抑制劑為ZnSO4和CuSO4，用它們的不同濃度對全部開花之前4天內(nèi)的野生型西紅柿進行治療，依照它們的濃度來研究一種藥物對果實形成率的影響和不良影響。
此外，為使本發(fā)明中的中柱特異性RNA酶抑制劑作為果實控制劑的功效達到最大，按照制造商提供的最適宜的用量，用六十烷吡咯(hexaconazole)、硅氧烷和烷基芳香聚乙氧基化物類分散劑混合ZnSO4或CuSO4，并進行處理。
表4.
依照一種中柱特異性RNA酶抑制劑的不同濃度，研究其對野生型西紅柿的果實形成率和不良影響。


用硅氧烷類(商品名silhouette，Dongbu精密化學(xué)公司，韓國)的分散劑將合成物混合到0.0335％，并用這種合成物處理野生型西紅柿。然后，調(diào)查通過自花授粉的果實形成率，如表4中所示。25個開花時期重復(fù)試驗4次的實驗結(jié)果表明具有統(tǒng)計學(xué)意義。
在ZnSO4的情況下，如果在所有開花時期，應(yīng)用100-800ppm范圍的濃度進行授粉時，果實形成率以100％做為標準，那么通過自花授粉的果實形成率則可達到70％以上。在濃度超過900ppm時，發(fā)生的藥物有害影響可能為花瓣顏色變黃或花瓣早期落下。在CuSO4的情況下，如果在所有開花時期，應(yīng)用100-700ppm范圍的濃度進行授粉時，果實形成率以100％做為標準，那么通過自花授粉的果實形成率則可達到70％以上。在濃度超過800ppm時，發(fā)生藥物的有害影響。
例6確定中柱特異性RNA酶抑制劑的處理時期和調(diào)查在富士蘋果中的果實形成率<6-1>確定中柱特異性RNA酶抑制劑的治療時期在一種實際的耕作環(huán)境中，測試本發(fā)明中的一種中柱特異性RNA酶抑制劑的有效性，用此種中柱特異性RNA酶處理在溫室中栽植的用于研究的富士蘋果(位于Cheongsong-gun，Kyungsangpukdo，大韓民國)。在本發(fā)明中，在能儲藏富士蘋果的環(huán)境條件下，進行這種試驗，而富士蘋果則是一種有代表性的具有配子體自交不親合性的植物，而從種屬上來講則是一單一的品種。
為確定中柱特異性RNA酶抑制劑的應(yīng)用時期，在開花的早期(萌芽形成時期～完全開花之前)、開花的中期(完全開花)和開花的晚期(在完全開花后1天～花瓣凋落時期)，分別應(yīng)用以抑制劑。由混合以硅氧烷類(商標名稱silhouette，Dongbu精密化學(xué)公司，韓國)的分散劑制成的一種合成物，將帶有抑制劑的合成物調(diào)至濃度為0.0335％，在與例證5-1相同的情況下應(yīng)用，并且應(yīng)用后的結(jié)果顯示在表5中。
表5.
依照每一個開花的時期，在應(yīng)用以中柱特異性的RNA酶抑制劑后，富士蘋果的果實形成率

正如表5中所顯示的，當(dāng)應(yīng)用化合物時，象野生型西紅柿一樣，富士蘋果的果實形成率超過了70％，該化合物混合以本發(fā)明中的中柱特異性的RNA酶和一種分散劑，而應(yīng)用化合物的時期為開花的早期(完全開花之前的3天～5天)。
<6-2>依照中柱特異性RNA酶抑制劑的濃度變化，對果實形成率和藥物的毒副作用的研究根據(jù)中柱特異性RNA酶抑制劑即本發(fā)明中的中柱特異性的RNA酶抑制劑--ZnSO4和CuSO4的濃度，在完全開花之前4天，以各種不同的濃度應(yīng)用于富士蘋果，來研究果實形成率和藥物的毒副作用。
此外，為了使本發(fā)明中的中柱特異性RNA酶抑制劑，作為結(jié)果實的調(diào)控劑的效益達到最佳，其中的ZnSO4或者CuSO4，則混合以硅氧烷類(商標名稱silhouette，Dongbu精密化學(xué)公司，韓國)的分散劑，濃度為0.0335％，應(yīng)用于富士蘋果。
表6.
根據(jù)中柱特異性的RNA酶抑制劑的濃度變化，來研究富士蘋果的果實形成率和藥物對富士蘋果的毒副作用

正如表6中所顯示的，如果ZnSO4的濃度在100～800ppm范圍內(nèi)時，通過自身花粉的果實形成率則超過70％，而當(dāng)藥物濃度超過900ppm時，藥物的毒副作用隨之發(fā)生，象花瓣的顏色變成黃色，或者花瓣在開花的早期脫落。如果CuSO4的濃度在100～700ppm范圍內(nèi)時，通過自身花粉的果實形成率則超過70％，而當(dāng)藥物濃度超過800ppm時，藥物的毒副作用也隨之發(fā)生。
針對25個開花時期的4次重復(fù)實驗的實驗結(jié)果顯示，具有統(tǒng)計學(xué)意義。
從例證5和例證6的結(jié)果上證實本發(fā)明中的中柱特異性RNA酶的抑制劑，能夠破壞配子體自交不親合性植物的配子體的自交不親合性，這與植物的品種無關(guān)。
產(chǎn)業(yè)上的適用性正如上述結(jié)果中所顯示的，配子體的自交不親合性，可以在開花期的早期(萌芽形成時期～完全開花之前)，通過應(yīng)用本發(fā)明中的中柱特異性RNA酶的抑制劑------硫酸鹽，尤其是CuSO4和ZnSO4加以破壞，并且應(yīng)用自身花粉，能夠穩(wěn)定地誘導(dǎo)授粉和結(jié)果實。因此，通過對例如蘋果樹、梨樹、咖啡樹和杏樹等配子體自交不親合性的果樹應(yīng)用這種合成物，而不用培育另一授粉者，就能夠獲得采用自身花粉授粉的水果和農(nóng)作物，該合成物包含有本發(fā)明中的中柱特異性RNA酶的抑制劑作為其有效成分。同樣，本發(fā)明還提供了一種創(chuàng)新性的培育方法，它能夠使每單位面積的產(chǎn)量達到最大，這是因為沒有授粉器的幫助就能獲得高果實形成率。
權(quán)利要求
1.一種用于配子體自交不親合性的調(diào)節(jié)性化合物，包含有一種調(diào)控配子體的自交不親合性的中柱特異性RNA酶活性的抑制劑。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的調(diào)節(jié)性化合物，其中的中柱特異性RNA酶活性的抑制劑是帶有金屬離子的硫酸鹽。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的調(diào)節(jié)性化合物，其中的帶有金屬離子的硫酸鹽，是從包括CuSO4，MgSO4，ZnSO4和MnSO4的組中選擇出來的至少一種。
4.一種植物的配子體自交不親合性的調(diào)控方法，它包含有對配子體自交不親合性的調(diào)節(jié)性化合物的處理，該化合物中包含有一種中柱特異性RNA酶活性的抑制劑，通過在植物的一個特定時期噴灑這種化合物可調(diào)控配子體的自交不親合性。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的調(diào)控方法，其中的中柱特異性RNA酶活性的抑制劑，是帶有金屬離子的硫酸鹽。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的調(diào)控方法，其中的帶有金屬離子的硫酸鹽，是從包括CuSO4，MgSO4，ZnSO4和MnSO4的組中選擇出來的至少一種。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的調(diào)控方法，其中CuSO4的適當(dāng)濃度為100～700ppm。
8.根據(jù)權(quán)利要求6所述的調(diào)控方法，其中的ZnSO4的適當(dāng)濃度為100～700ppm。
9.根據(jù)權(quán)利要求4所述的調(diào)控方法，其中的特定時期是在萌芽形成時期和完全開花之前之間的一段時期。
10.根據(jù)權(quán)利要求4所述的調(diào)控方法，其中將配子體自交不親合性調(diào)節(jié)性化合物在一個特定時期對植物的噴灑方法，是以分散劑將化合物混合，噴灑到果樹上。
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的調(diào)控方法，其中的上述分散劑，是選自包含有六十烷吡咯(hexaconazole)、硅氧烷和烷基芳基聚乙氧基化物類的組。
12.一種植物，采用權(quán)利要求4中的方法破壞配子體自交不親合性，經(jīng)自身花粉授粉。
13.根據(jù)權(quán)利要求12所述的植物，其中的上述植物是選自一組包含有包括蘋果樹、梨樹、咖啡樹和杏樹的果樹、開花性樹木、藥用植物和茄科蔬菜，茄科蔬菜包括有西紅柿、茄子、煙草和馬鈴薯。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種配子體自交不親合性的調(diào)節(jié)性化合物,它包含硫酸鹽,尤其是CuSO
文檔編號A01N59/06GK1364054SQ01800462
公開日2002年8月14日 申請日期2001年2月28日 優(yōu)先權(quán)日2000年3月8日
發(fā)明者鄭鎰炅, 柳宗相, 金明姬, 許炳柱, 鄭鎰仙 申請人:伊思技術(shù)有限公司