專(zhuān)利名稱(chēng)：毒害艾美耳球蟲(chóng)的配子體抗原gam22基因及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及毒害艾美耳球蟲(chóng)(Eimeria necatrix)的配子體抗原基因，由所述基因編碼的多肽，含有所述基因的載體以及所述基因的獲取方法和多肽的體外表達(dá)方法以及功能鑒定。具體地，本發(fā)明的基因來(lái)自于雞毒害艾美耳球蟲(chóng)有性生殖階段的配子體。
背景技術(shù)：
雞球蟲(chóng)病是由艾美耳屬的一種或數(shù)種球蟲(chóng)寄生在雞小腸或盲腸黏膜內(nèi)引起的嚴(yán)重危害養(yǎng)雞業(yè)的原蟲(chóng)病，估計(jì)每年全球因球蟲(chóng)病的損失為30億美元。我國(guó)每年僅抗球蟲(chóng)藥的年消費(fèi)就約6 18億元人民幣，由雞球蟲(chóng)病造成的直接和間接經(jīng)濟(jì)損失則難以估計(jì)。長(zhǎng)期以來(lái)，雞球蟲(chóng)病的防治主要依賴(lài)藥物。但由于球蟲(chóng)對(duì)藥物普遍產(chǎn)生了耐藥性，引起藥效下降。而且在雞飼養(yǎng)周期中長(zhǎng)期添加藥物還導(dǎo)致藥物殘留肉蛋，直接危害人類(lèi)健康，并污染環(huán)境。為此，雞球蟲(chóng)病的防治方法由化學(xué)預(yù)防轉(zhuǎn)向了免疫預(yù)防。目前，臨床上用于免疫預(yù)防雞球蟲(chóng)病的疫苗有活蟲(chóng)苗和由天然蛋白組成的亞單位疫苗兩大類(lèi)。雖然雞球蟲(chóng)病活疫苗有著較強(qiáng)的免疫效果，但存在著如擴(kuò)散病原的風(fēng)險(xiǎn)、球蟲(chóng)蟲(chóng)株的抗原變異、致弱蟲(chóng)株毒力易返強(qiáng)、疫苗接種劑量難以控制、疫苗影響飼料報(bào)酬、生產(chǎn)成本高、免疫程序繁瑣、操作和免疫后的監(jiān)測(cè)和管理技術(shù)要求高等一些突出的問(wèn)題。商品化的雞球蟲(chóng)病亞單位疫苗是由來(lái)源于巨型艾美耳球蟲(chóng)配子體的三種純化抗原(分子質(zhì)量分別為230、82、56kDa)配制而成，用于干擾卵囊壁的形成，即阻斷艾美耳球蟲(chóng)的有性生殖階段，從而降低卵囊的產(chǎn)生與傳播。由于該類(lèi)疫苗的抗原需從配子體蛋白中經(jīng)親和柱分離純化，配子體又需從感染雞體的腸道上皮細(xì)胞中分離純化，因此生產(chǎn)工藝復(fù)雜，成本高，難易滿(mǎn)足生產(chǎn)需求。而利用基因工程技術(shù)大量生產(chǎn)該類(lèi)抗原，可能是解決這一問(wèn)題的最佳策略。但巨型艾美耳球蟲(chóng)配子體抗原gam82和gam56基因已受到專(zhuān)利保護(hù)。毒害艾美耳球蟲(chóng)是雞球蟲(chóng)病的重要病原之一，主要發(fā)生在60日齡以上的雞。由于在雞球蟲(chóng)不同種間缺乏交叉保護(hù)性，毒害與柔嫩和巨型艾美耳球蟲(chóng)在寄生部位的競(jìng)爭(zhēng)性，以及毒害艾美耳球蟲(chóng)繁殖力低等原因，因此在育雛階段用疫苗免疫預(yù)防，往往不能控制雞飼養(yǎng)后期由毒害艾美耳球蟲(chóng)引發(fā)的球蟲(chóng)病。從毒害艾美耳球蟲(chóng)配子體克隆配子體抗原基因，構(gòu)建原核表達(dá)載體表達(dá)重組抗原。用毒害艾美耳球重組配子體抗原免疫飼養(yǎng)后期的雞，防治毒害艾美耳球蟲(chóng)引發(fā)的球蟲(chóng)病。但迄今為止，國(guó)內(nèi)外還沒(méi)有相關(guān)基因序列及其重組表達(dá)的報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明利用基因工程技術(shù)，克隆毒害艾美耳球蟲(chóng)配子體抗原基因Engam22，并將該基因轉(zhuǎn)入工程菌進(jìn)行表達(dá)，獲得大量的重組抗原，并對(duì)重組抗原的特異性、免疫原性等進(jìn)行深入研究，旨為研制雞球蟲(chóng)重組配子體抗原疫苗奠定基礎(chǔ)。本發(fā)明涉及毒害艾美耳球蟲(chóng)的 一種配子體抗原基因，其中，所述的基因全長(zhǎng)為713bp，其核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示。
其中包含的開(kāi)放閱讀框大小為561bp (79-639bp)，其編碼的氨基酸序列如SEQ IDN0.2所示。去除信號(hào)肽(前19個(gè)氨基酸)以后的序列如SEQ ID N0.3所示。:本發(fā)明涉及到一種表達(dá)載體pET28a，其含有所述配子體抗原基因。將分離得到的配子體抗原基因插入酶切位點(diǎn)，連接到原核表達(dá)載體pET28a中，常規(guī)轉(zhuǎn)化腸桿菌BL21(DE3 )，構(gòu)建基因工程菌，并誘導(dǎo)表達(dá)，對(duì)表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行分離、純化和復(fù)性。另外，本發(fā)明涉及到一種真核表達(dá)載體PCDNA3.1，其含有所述配子體抗原基因。將分離得到的配子體抗原基因插入酶切位點(diǎn)，連接到PCDNA3.1中，構(gòu)建成核酸疫苗，并用淋巴細(xì)胞增殖試驗(yàn)和ELISA方法來(lái)評(píng)價(jià)免疫后雞體的細(xì)胞免疫和體液免疫水平。作為優(yōu)選的方案，具體操作是:I)從毒害艾美耳球蟲(chóng)配子體基因中分離gam22基因:常規(guī)方法分離純化毒害艾美耳球蟲(chóng)配子體，用RNA提取試劑盒提取總RNA。設(shè)計(jì)特異性引物:上游引物:5，-ACCCCAAAATAAAATCAAAGGC-3，(SEQID N0.4)；下游引物:5，-CCATGAAGATCTCAGACGTAGC-3，(SEQID N0.5)。以配子體總RNA反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA為模板，經(jīng)過(guò)PCR條件的反復(fù)優(yōu)化后，成功擴(kuò)增出與預(yù)期結(jié)果相符且大小為713bp左右的特異性片段(圖1)，命名為Engam22。將含有目的片段PCR產(chǎn)物經(jīng)試劑盒純化回收后，克隆到pGEM-T-easy載體中，得到pGEM-T-easy-Engam22。 2)原核表達(dá)載體的構(gòu)建根據(jù)毒害艾美耳球蟲(chóng)gam22基因的ORF序列和質(zhì)粒pET_28a酶切位點(diǎn)，去除gam22基因的信號(hào)肽后，設(shè)計(jì)I對(duì)特異性引物:上游引物F:5’-TCGGAATTCGACGGAGCACCTGAG-3’ (SEQ ID N0.6)，含 EcoR I 酶切位點(diǎn)和3個(gè)保護(hù)性堿基，下游引物R:5’-GCGAAGCTTTTAGTTGATGTCGGT-3’ (SEQ ID N0.7)，含 Hind III酶切位點(diǎn)和3個(gè)保護(hù)性堿基。以構(gòu)建的pGEM-T-eaSy-Engam22載體為模板，成功擴(kuò)增出與預(yù)期結(jié)果相符且大小為522bp左右的特異性片段(圖2)，并將此片段連接到原核表達(dá)載體pET28a中，得到pET28a_Engam22。3)毒害艾美耳球蟲(chóng)gam22基因的高效表達(dá)，純化，復(fù)性將構(gòu)建好的原核表達(dá)載體pET28a_Engam22轉(zhuǎn)化BL21宿主菌，IPTG誘導(dǎo)表達(dá)后，經(jīng)過(guò)可溶性分析，發(fā)現(xiàn)此體外重組表達(dá)的蛋白以包涵體形式存在(圖3)。重組蛋白的大量表達(dá)時(shí)，超生裂解釋放包涵體后，尿素變性。變性蛋白通過(guò)含有HIS標(biāo)簽的N1-NTA親和層析純化后，分別在含有6M、4M、2M、IM尿素的透析液和OM尿素的PBS中各復(fù)性8h，最終通過(guò)PEG8000濃縮，收集蛋白，12%SDS-PAGE分析(圖4)，4°C保存。4)體外重組表達(dá)蛋白的特異性和免疫原性檢測(cè)將重組表達(dá)的蛋白經(jīng)過(guò)western-blot分析,分別以抗HIS的單克隆抗體(圖5)、鼠抗gam22的多克隆抗體(圖6)和毒害艾美耳球蟲(chóng)卵囊三次免疫后雞的康復(fù)血清(圖7)為一抗，以檢測(cè)重組蛋白的特異性和免疫原性。
本發(fā)明還公開(kāi)了所述Engam22基因在構(gòu)建核酸疫苗中的應(yīng)用。所述核酸疫苗的構(gòu)建如下:根據(jù)Engam22基因的ORF序列和質(zhì)粒pcDNA3.1的特性，設(shè)計(jì)I對(duì)特異性引物:上游引物Fl:5’-CCCAAGCTTATGAGGGCTATCCTAACCAC-3’(SEQ ID N0.8)，含 Hind III酶切位點(diǎn)和3個(gè)保護(hù)性堿基，下游引物Rl:5’-GCGGAATTCTTAGTTGATGTCGGTAAGCT-3’ (SEQ ID N0.9)，含 EcoRI酶切位點(diǎn)和3個(gè)保護(hù)性堿基。以構(gòu)建的pGEM-T-eaSy-Engam22載體為模板，成功擴(kuò)增出與預(yù)期結(jié)果相符且大小為579bp左右的特異性片段(圖8)，并將此片段連接到質(zhì)粒pcDNA3.1中，得到pcDNA3.1-Engam22。將構(gòu)建好的重組質(zhì)粒pcDNA3.1-Engam22進(jìn)行Hind III和EcoR I雙酶切鑒定(圖9)，選取陽(yáng)性克隆 測(cè)序，確定閱讀框架正確后大量克隆重組質(zhì)粒用于后續(xù)試驗(yàn)。對(duì)構(gòu)建的核酸疫苗進(jìn)行免疫原性分析，評(píng)價(jià)核酸疫苗免疫后雞的細(xì)胞免疫與體液免疫水平，結(jié)果表明:免疫后pcDNA3.l_Engam22組的抗體水平顯著高于未免疫組對(duì)照組和空質(zhì)粒組；pcDNA3.1-Engam22組的T淋巴細(xì)胞增殖水平顯著高于未免疫組對(duì)照組和空質(zhì)粒組。


圖1是毒害艾美耳球蟲(chóng)gam22基因整個(gè)ORF擴(kuò)增結(jié)果。泳道I為標(biāo)準(zhǔn)分子量；泳道2和3為擴(kuò)增得到的目的片段，大小為713bp。圖2是毒害艾美耳球蟲(chóng)gam22基因祛除信號(hào)肽，加入酶切位點(diǎn)后的擴(kuò)增結(jié)果。泳道I為標(biāo)準(zhǔn)分子量；泳道2和3為擴(kuò)增得到的目的片段，大小為522bp。圖3是毒害艾美耳球蟲(chóng)gam22基因體外重組表達(dá)蛋白可溶性分析結(jié)果，其中1:標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)分子量標(biāo)記；2:菌體裂解后的上清；3:菌體裂解后的包涵體。圖4是毒害艾美耳球蟲(chóng)gam22基因的純化和復(fù)性結(jié)果分析，其中1:標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)分子量標(biāo)記；2:重組菌超生后上清；3:包涵體尿素裂解后沉淀；4:包涵體尿素裂解后上清；5:結(jié)合緩沖液作用下裂解液與N1-NTA結(jié)合后的流出液；6:洗滌緩沖液的第一次洗脫液；7:洗滌緩沖液的第三次洗脫液；8 =N1-NTA親和純化后的目的蛋白；9:透析復(fù)性后的目的蛋白。圖5是Western-blot鑒定體外重組表達(dá)蛋白特異性的結(jié)果,其中1:預(yù)染蛋白質(zhì)分子量標(biāo)記；2:pET-28a/BL21IPTG 誘導(dǎo)；3:pET-28a_Engam22/BL21IPTG 誘導(dǎo)。圖6是鼠抗毒害艾美耳球蟲(chóng)gam22體外重組表達(dá)蛋白的多克隆抗體Western-blot檢測(cè)結(jié)果，其中1:預(yù)染蛋白質(zhì)分子量標(biāo)記；2:pET_28a/BL21IPTG誘導(dǎo)；3:pET-28a-Engam22/BL21IPTG 誘導(dǎo)。圖7是毒害艾美耳球蟲(chóng)三次免疫雞的康復(fù)血清Western-blot檢測(cè)結(jié)果，其中1:預(yù)染蛋白質(zhì)分子量標(biāo)記；2:pET-28a/BL21IPTG 誘導(dǎo)；3:pET-28a_Engam22/BL21IPTG 誘導(dǎo)。圖8是構(gòu)建核酸疫苗用Engam22基因擴(kuò)增結(jié)果:泳道I為標(biāo)準(zhǔn)分子量；泳道2和3為擴(kuò)增得到的目的片段，大小為579bp。圖9是重組質(zhì)粒pcDNA3.1-Engam22酶切鑒定結(jié)果:泳道I為標(biāo)準(zhǔn)分子量；泳道2、3和4為酶切結(jié)果，其中質(zhì)粒片段大小為5387bp，目的片段大小為571bp。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合附圖和實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)一步說(shuō)明。實(shí)施例1:從毒害艾美耳球蟲(chóng)配子體基因中分離gam22基因常規(guī)方法分離純化毒害艾美耳球蟲(chóng)配子體，用RNA提取試劑盒提取總RNA。RT-PCR 釣取 gam22 基因:參照TaKaRa 公司的(TaKaRa RNA LA PCR Kit (AMV) Ver.1.1)提供的方法:兩步法RT-PCR試劑盒擴(kuò)增gam22基因。Engam22基因的釣取采用上游引物(5’ -ACCCCAAAATAAAATCAAAGGC-3’ )和下游引物(5，-CCATGAAGATCTCAGACGTAGC-3，)。第一步:反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，總體系為10 μ 1:0.5 μ I的總RNA (彡500ng total RNA),25mM 的 MgCl22 μ 1，10XRNA PCR Bufferl μ 1，RNase Free dH204.25 μ 1，濃度為 IOmM 的dNTPl μ 1，RNase Inhibitor0.25 μ I, 5u/μ I AMV 逆轉(zhuǎn)錄酶 0.5 μ I 和 Oligo dT 接頭引物
0.5μ I。反應(yīng)步驟:42° C逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)30min ;99° C變性5min;5° C冷卻5min。第二步:PCR反應(yīng)，總體積為 50μ 1:25mM 的 MgCl23y 1，10XLA PCR Buffer II(Mg2+Free)4 μ 1，滅菌蒸餾水 31.75 μ I7TaKaRa LA Taq0.25 μ 1，上游引物(10 μ Μ)0.5 μ 1，下游引物(10μΜ)0.5μ 1，然后把第一步反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)中的產(chǎn)物10μ I加入到此體系中。PCR反應(yīng)步驟:94° C預(yù)變性3min;94° C變性30s;56° C退火30s;72° C延伸1.5min，共28個(gè)循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束后，1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，結(jié)果如圖1。將得到的Engam22基因克隆到pGEM-T-easy載體(購(gòu)自Promeqa公司)中,送往華大基因公司測(cè)序。(重組載體命名為:pGEM-T_Easy-Engam220)實(shí)施例2:表達(dá)片段Engam22的擴(kuò)增根據(jù)毒害艾美耳球蟲(chóng)gam22基因的ORF序列和質(zhì)粒pET28a (購(gòu)自Invitrogen公司)的酶切位點(diǎn)，祛除信號(hào)肽后，設(shè)計(jì)特異性引物，擴(kuò)增表達(dá)用的基因片段。根據(jù)質(zhì)粒pET28a上具備的酶切位點(diǎn)，對(duì)Engam22基因進(jìn)行序列分析后，祛除信號(hào)肽，選取EcoR I和Hind III兩個(gè)酶切位點(diǎn)，設(shè)計(jì)得到的特異性引物為:上游引物(5 ’ -TCGGAATTCGACGGAGCACCTGAG-3 ’)含EcoR I酶切位點(diǎn)和3個(gè)保護(hù)性堿基，下游引物(5，-GCGAAGCTTTTAGTTGATGTCGGT-3’ )含 Hind III酶切位點(diǎn)和 3 個(gè)保護(hù)性堿基。50 μ I PCR反應(yīng)體系如下:5μ I的IOX反應(yīng)緩沖液；濃度為ΙΟμΜ的上、下游引物各 I μ 1，4 μ I dNTP (IOmM) ；35 μ I H2O ;0.5 μ I TaKaRa LA Taq 酶，I μ I 模板pGEM-T-Easy-Engam22。95。C 變性 5min;95。C 變性 30s，55。C 退火 30s，72。C 延伸lmin，共30個(gè)循環(huán)；72° C，延伸lOmin。反應(yīng)結(jié)束后，1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，結(jié)果如圖
2。擴(kuò)大反應(yīng)體系后，將得到的PCR產(chǎn)物純化回收，_20°C保存?zhèn)溆?。?shí)施例3:原核表達(dá)載體的構(gòu)建雙酶切pET28a:EcoRI 和 Hind III為 Fermentas 產(chǎn)品。50 μ I 酶切體系為:5 μ IlOXFastDigestGreen Buffer, 20 μ I 載體 pET28a, FastDigest EcoRI 和 FastDigest Hind III各 2.5 μ I,20 μ I ddH20。37° C反應(yīng)2h，1.2%瓊脂糖凝膠電泳，膠回收產(chǎn)物。
雙酶切實(shí)施例2中純化的PCR產(chǎn)物:EcoRI 和 Hind III 為 Fermentas 產(chǎn)品。100 μ I 酶切體系:10 μ IlOXFastDigestGreen Buffer ；20 μ I 純化 PCR (Engam22)產(chǎn)物；FastDigest EcoRI 和 FastDigest Hind III各5 μ I ;60 μ I ddH20。37° C反應(yīng)2h，1.2%瓊脂糖凝膠電泳，膠回收酶切產(chǎn)物。連接反應(yīng):Solution I 為 TaKaRa 產(chǎn)品。8μ I 雙酶切載體 pET28a，2 μ I 雙酶切 PCR 產(chǎn)物，10 μ Isolution I，16°C連接過(guò)夜。取10 μ I連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞DH5 α。涂布到含有卡那霉素抗性的LB平板，第二天挑取單克隆，過(guò)夜培養(yǎng)后，提取質(zhì)粒，采用雙酶切鑒定法挑選陽(yáng)性克隆(重組載體命名為:PET28a-Engam22)，并送交華大基因公司測(cè)序。實(shí)施例4:gamEXP22基因在大腸桿菌中的誘導(dǎo)表達(dá)挑取測(cè)序正確的克隆轉(zhuǎn)化感受態(tài)BL21 (DE3)。挑取單個(gè)菌落接種到3ml LB培養(yǎng)液(含100 μ g/ml卡那霉素)中，37° C，200rpm振蕩培養(yǎng)過(guò)夜，按I: 100轉(zhuǎn)接種到IOml含相同濃度抗生素LB中，37° C200rpm振蕩培養(yǎng)4h，加入終濃度為ImM的IPTG，37° C200rpm誘導(dǎo)4h，12%SDS-PAGE檢測(cè)表達(dá)情況。結(jié)果如圖3，清楚表明表達(dá)的蛋白分子量在29kDa左右，而且主要存在于包涵體內(nèi)。實(shí)施例5:表達(dá)產(chǎn)物的純化和復(fù)性4° C12000rpm離心5min收集菌體，以0.1M PBS重懸沉淀，然后冰浴超聲(超聲2s,間隙3s, 25min)。4°C 12000rpm離心IOmin,收集包涵體沉淀。沉淀中加入10ml LysisEquilibrium Buffer (IOOmM NaH2P04, IOmM Tris.C1,8M urea, ρΗ8.0)，超聲(超聲 2s，間隙3s，15min)輔助包涵體的裂解，4° C12000rpm離心lOmin，收集上清加入到預(yù)先用LEBuffer平衡處理的N1-NTA柱·中，4°C作用30min,期間要不斷的搖晃。按照GenScript公司提供的操作手冊(cè)純化蛋白。收集ElutionBufferC IOOmM NaH2PO4, IOmM Tris Cl, 500mM Imidazole, 8M urea,pH8.0)洗脫的蛋白，裝入透析袋，在復(fù)性緩沖液(50mmol/L Tris-HCl，0.15mol/L NaCl,pH8.0)分別加入6M、4M、2M、1M尿素進(jìn)行梯度透析復(fù)性，每個(gè)濃度的尿素，4°C透析復(fù)性8h，最后在含有OM尿素的PBS (pH8.0)中透析復(fù)性8h。PEG8000濃縮蛋白，12%SDS_PAGE檢測(cè)，蛋白-20° C保存。重組蛋白的純化和復(fù)性結(jié)果如圖4。實(shí)施例6:表達(dá)產(chǎn)物的特異性檢測(cè)將誘導(dǎo)的陽(yáng)性重組菌和空質(zhì)粒轉(zhuǎn)化菌蛋白20 μ 1，12%SDS-PAGE電泳，并轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上，轉(zhuǎn)印結(jié)束后將NC膜置在含3%BSA的TBS緩沖液中室溫封閉1.5h，隨后用一抗為鼠抗HIS標(biāo)簽單克隆抗體(BBI，USA)(用封閉液稀釋至I μ g/ml，共15ml)，37°C下作用1.5h，TBST洗滌5min，重復(fù)3次；接著用HRP標(biāo)記的兔抗鼠IgG為二抗，用封閉液1: 2000稀釋?zhuān)覝叵伦饔?.5h，TBST洗滌5min，重復(fù)3次；最后用TMB緩沖液顯色lmin，去離子水漂洗終止反應(yīng)后室溫干燥，結(jié)果如圖5。實(shí)施例7:表達(dá)產(chǎn)物的免疫原性檢測(cè)將誘導(dǎo)的陽(yáng)性重組菌和空質(zhì)粒轉(zhuǎn)化菌蛋白20 μ 1，12%SDS-PAGE電泳，并轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上，轉(zhuǎn)印結(jié)束后將NC膜置在含3%BSA的TBS緩沖液中室溫封閉1.5h，隨后用一抗為本實(shí)驗(yàn)室制備的鼠抗gam22抗原多克隆抗體，用封閉液1: 200稀釋?zhuān)?7°C下作用1.5h;TBST洗滌5min，重復(fù)3次，接著用HRP標(biāo)記的兔抗鼠IgG為二抗，用封閉液1: 1000稀釋?zhuān)覝叵伦饔?.5h ；TBST洗滌5min，重復(fù)3次；最后用TMB緩沖液顯色lmin，去離子水漂洗終止反應(yīng)后室溫干燥，結(jié)果如圖6。將誘導(dǎo)的陽(yáng)性重組菌和空質(zhì)粒轉(zhuǎn)化菌蛋白20 μ 1，12%SDS-PAGE電泳，并轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上，轉(zhuǎn)印結(jié)束后將NC膜置在含3%BSA的TBS緩沖液中室溫封閉1.5h，隨后一抗為本實(shí)驗(yàn)室制備免疫E.necatrix后雞的康復(fù)血清，用封閉液1: 100稀釋?zhuān)?7°C下作用
1.5h ；TBST洗滌5min，重復(fù)3次，接著用HRP標(biāo)記的兔抗雞IgY (IgG)為二抗，用封閉液I: 1000稀釋?zhuān)覝叵伦饔?.5h ；TBST洗滌5min，重復(fù)5次；最后用TMB緩沖液顯色lmin，去離子水漂洗終止反應(yīng)后室溫干燥，結(jié)果如圖7。實(shí)施例8:核酸疫苗的構(gòu)建PCR釣取構(gòu)建核酸疫苗用的Engam22基因:根據(jù)Engam22基因的ORF序列和質(zhì)粒pcDNA3.1 (購(gòu)自Invitrogen公司)的特性，設(shè)計(jì)特異性引物，擴(kuò)增目的片段。根據(jù)質(zhì)粒 pcDNA3.1的特征,選取Hind III和EcoR I兩個(gè)酶切位點(diǎn)，設(shè)計(jì)得到的特異性引物為:上游引物(5’ -CCCAAGCTTATGAGGGCTATCCTAACCAC-3’，)含 Hind III酶切位點(diǎn)和3個(gè)保護(hù)性堿基，下游引物(5’ -GCGGAATTCTTAGTTGATGTCGGTAAGCT-3’ )含EcoRI酶切位點(diǎn)和3個(gè)保護(hù)性堿基。50 μ I PCR反應(yīng)體系如下:5μ I的IOX反應(yīng)緩沖液；濃度為ΙΟμΜ的上、下游引物各 I μ 1，4 μ I dNTP (IOmM) ；35 μ I Η20 ;0.5 μ I TaKaRa LA Taq 酶，I μ I 模板pcDNA3.1-Engam22。95。C 變性 5min;95。C 變性 30s，55。C 退火 30s，72。C 延伸 lmin,共30個(gè)循環(huán)；72° C，延伸lOmin。反應(yīng)結(jié)束后，1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，結(jié)果如圖8。擴(kuò)大反應(yīng)體系后，將得到的PCR產(chǎn)物純化回收，_20°C保存?zhèn)溆谩ｋp酶切純化的PCR產(chǎn)物:Hind III 和 EcoRI 為 Fermentas 產(chǎn)品。100 μ I 酶切體系:10 μ IlOXFastDigestGreen Buffer ；20 μ I 純化 PCR (Engam22)產(chǎn)物；FastDigest EcoRI 和 FastDigest Hind III各5 μ I ;60 μ I ddH20。37° C反應(yīng)2h，1.2%瓊脂糖凝膠電泳，膠回收酶切產(chǎn)物。雙酶切pcDNA3.1:Hind III和 EcoRI 為 Fermentas 產(chǎn)品。50 μ I 酶切體系為:5 μ IlOXFastDigestGreen Buffer, 20 μ I 載體 pcDNA3.1, FastDigest EcoRI 和 FastDigest Hind III各 2.5 μ I,20 μ I ddH20。37° C反應(yīng)2h，1.2%瓊脂糖凝膠電泳，膠回收產(chǎn)物。連接反應(yīng):Solution I 為 TaKaRa 產(chǎn)品。8 μ I 雙酶切載體 pcDNA3.1，2 μ I 雙酶切 PCR 產(chǎn)物，10 μ I solution I，16°C連接過(guò)夜。取10 μ I連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞DH5 α。涂布到含有氨芐抗性的LB平板，第二天挑取單克隆，過(guò)夜培養(yǎng)后，提取質(zhì)粒，采用雙酶切鑒定法挑選陽(yáng)性克隆(重組質(zhì)粒命名為:pcDNA3.1-Engam22),并送交華大基因公司測(cè)序。實(shí)施例9:核酸疫苗的免疫原性分析抗體水平:血清獲取:將6日齡雛雞隨機(jī)分為4組，即核酸疫苗免疫組、pcDNA3.1空質(zhì)粒組、卵囊免疫組、空白對(duì)照組，每組12羽。常規(guī)方法獲取重組質(zhì)粒，測(cè)定質(zhì)粒濃度，質(zhì)粒組每雞胸肌注射25%高滲蔗糖溶液并按摩輔助擴(kuò)散，再于相同位置縱向肌肉注射質(zhì)粒溶液(含質(zhì)粒100 μ g)，卵囊免疫組的免疫劑量為5000個(gè)/羽孢子化卵囊。在7日齡(I免前)、14日齡(2免前)、21日齡時(shí)，分別在每組中隨機(jī)取4只雞，采血2ml，分離血清，用于抗體水平檢測(cè)，評(píng)價(jià)核酸疫苗的體液免疫水平。間接ELISA法檢測(cè):將純化復(fù)性后的pET28a_Engam22重組蛋白用碳酸鹽緩沖液(ρΗ9.6)稀釋后，按每孔I μ g/100 μ I包被ELISA板，4°C過(guò)夜；PBST洗板3次，每次5min,加入含1%BSA的封閉液(20(^1/孔)，37°〇封閉2h ;PBST洗板3次，每次5min，加入I: 200稀釋的待檢血清(100 μ I/孔)，每個(gè)樣品均設(shè)三個(gè)重復(fù)孔，37°C溫育Ih ；PBST洗板3次，每次5min,加入I: 2000稀釋的HRP標(biāo)記的兔抗雞IgG (100 μ I/孔)，37°C溫育Ih ；PBST洗滌5次，每次5min，加入100 μ I新鮮配制的TMB底物顯色液，37°C溫育IOmin ;顯色后立即加入50 μ 12MH2S04溶液終止反應(yīng)，酶標(biāo)儀測(cè)定每孔樣品的OD450值。表I是各試驗(yàn)組雞的抗體水平間接ELISA法檢測(cè)結(jié)果:在試驗(yàn)前各組雞的抗體水平相近。免疫后第I周，pcDNA3.1-Engam22組的抗體水平較未免疫組對(duì)照組和空質(zhì)粒組的要高，相比差異顯著(P〈0.05)，與卵囊免疫組相比要低，但兩者間差異不顯著(P>0.05)。在免疫后第2周，卵囊免疫組抗體水平升到最高，與pcDNA3.1-Engam22組有顯著差異(P〈0.05)，但后者的抗體水平仍然顯著高于未免疫組對(duì)照組和空質(zhì)粒組(P〈0.05)。表I免疫對(duì)抗體水平的影響(OD45tl)
權(quán)利要求
1.一種雞毒害艾美耳球蟲(chóng)配子體抗原基因Engam22,其基因全長(zhǎng)為713bp,其核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示。
2.一種雞毒害艾美耳球蟲(chóng)配子體抗原，其氨基酸序列如SEQ ID N0.2所示。
3.重組雞毒害艾美耳球蟲(chóng)配子體抗原的制備方法，其特征在于包括以下步驟: O從毒害艾美耳球蟲(chóng)配子體基因中分離gam22基因: 引物序列如SEQ ID N0.4和SEQ ID N0.5所示，以配子體總RNA反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA為模板，擴(kuò)增713bp的特異性片段，命名為Engam22，將含有目的片段PCR產(chǎn)物經(jīng)試劑盒純化回收后，克隆到 pGEM-T-easy 載體中，得到 pGEM-T_easy-Engam22 ； 2)原核表達(dá)載體的構(gòu)建 特異性引物序列如SEQ ID N0.6和SEQ ID N0.7，以構(gòu)建的pGEM-T_easy-Engam22載體為模板，擴(kuò)增522bp的特異性片段，并將此片段連接到原核表達(dá)載體pET28a中，得到pET28a_Engam22 ； 3)毒害艾美耳球蟲(chóng)gam22基因的高效表達(dá)，純化，復(fù)性 將構(gòu)建好的原核表達(dá)載體pET28a-Engam22轉(zhuǎn)化BL21宿主菌，IPTG誘導(dǎo)表達(dá)后，超聲裂解釋放包涵體后，尿素變性；變性蛋白通過(guò)含有HIS標(biāo)簽的N1-NTA親和層析純化后，分別在含有6M、4M、2M、1M尿素的透析液和OM尿素的PBS中各復(fù)性8h，最終通過(guò)PEG8000濃縮，收集蛋白，12%SDS-PAGE分析，4V保存。
4.權(quán)利要求1所述的Engam22基因在 構(gòu)建核酸疫苗中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明屬于基因工程疫苗領(lǐng)域，具體涉及一種雞毒害艾美耳球蟲(chóng)配子體抗原基因、表達(dá)及其表達(dá)產(chǎn)物的應(yīng)用。該基因的開(kāi)放閱讀框大小為561bp。將其構(gòu)建為原核表達(dá)載體pET28a-Engam22，轉(zhuǎn)化BL21宿主菌后誘導(dǎo)表達(dá)。表達(dá)產(chǎn)物能被雞康復(fù)血清所識(shí)別，顯示重組蛋白有免疫原性。該基因構(gòu)建的重組真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1-Engam22免疫雛雞，能誘導(dǎo)產(chǎn)生體液免疫與細(xì)胞免疫，顯示該基因能用于雞球蟲(chóng)基因工程疫苗的研制。
文檔編號(hào)C07K14/455GK103233017SQ201310162739
公開(kāi)日2013年8月7日 申請(qǐng)日期2013年5月6日 優(yōu)先權(quán)日2013年5月6日
發(fā)明者陶建平, 劉丹丹, 曹李琴, 許金俊 申請(qǐng)人:揚(yáng)州大學(xué)