專(zhuān)利名稱(chēng)：一種與歐美楊花藥發(fā)育相關(guān)MYB基因PeMYB103及其RNAi載體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一個(gè)與歐美楊(PopulusXeuramericana)花藥發(fā)育相關(guān)MYB基因 PeMYB103及其RNAi載體，屬于分子生物學(xué)與生物技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
花藥是植物的雄性生殖器官，是雄配子體_花粉發(fā)育的場(chǎng)所。研究花藥發(fā)育機(jī)理對(duì)理解植物生殖的遺傳機(jī)制、改進(jìn)農(nóng)林作物育種方法以及防止轉(zhuǎn)基因漂移具有重要意義。MYB是植物轉(zhuǎn)錄因子中最大的家族之一，該家族成員以N端含有MYB結(jié)構(gòu)域?yàn)楣餐卣鳌０此琈YB結(jié)構(gòu)域的數(shù)目，MYB類(lèi)轉(zhuǎn)錄因子可分成3種類(lèi)型MYB1R、R2R3-MYB、MYB3R， 分別含有1個(gè)、2個(gè)和3個(gè)MYB結(jié)構(gòu)域。每個(gè)MYB結(jié)構(gòu)域通常由51 52個(gè)氨基酸組成，在空間結(jié)構(gòu)上，MYB結(jié)構(gòu)域形成螺旋-螺旋_轉(zhuǎn)角-螺旋(helix-helix-turn-helix)結(jié)構(gòu)， 負(fù)責(zé)與DNA序列的特異結(jié)合。植物中絕大多數(shù)MYB類(lèi)轉(zhuǎn)錄因子是R2R3-MYB，在調(diào)節(jié)次生代謝(特別是苯丙酸代謝)、控制細(xì)胞的分化和器官的形態(tài)建成以及參與對(duì)環(huán)境脅迫、光和激素的應(yīng)答等方面起著重要的調(diào)控作用。近年，一些調(diào)控花藥及花粉發(fā)育的MYB類(lèi)轉(zhuǎn)錄因子相繼被鑒定，這些研究主要集中在擬南芥、煙草和玉米等植物中。Yang等人以MYB蛋白同源序列標(biāo)記42bp寡核苷酸探針篩選煙草成熟花粉的cDNA文庫(kù)，首次克隆到花藥特異性的MYB基因NtMYBASl/2，二者編碼的氨基酸序列同源性高達(dá)92%。隨后，運(yùn)用篩選育性降低的突變體結(jié)合遺傳學(xué)手段，人們又先后從擬南芥中鑒定出參與花藥及花粉發(fā)育調(diào)控的MYB類(lèi)轉(zhuǎn)錄因子AtMYB26、AtMYB103、 AtMYB32、AtMYB33、AtMYB65和AtMYB24等。其中，AtMYB103特異在花藥絨氈層和毛狀體中表達(dá)，其功能下調(diào)會(huì)導(dǎo)致絨氈層提前降解和花粉敗育。因此，AtMYB103及其同源基因 (orthologs)可為人為控制高等植物雄性育性提供一個(gè)有效工具。以上研究表明，MYB類(lèi)轉(zhuǎn)錄因子對(duì)花藥及花粉發(fā)育起重要調(diào)控作用。楊樹(shù)是研究林木遺傳、發(fā)育及基因工程改良的模式植物，同時(shí)也是重要的經(jīng)濟(jì)樹(shù)種，在我國(guó)廣泛種植，但長(zhǎng)期以來(lái)存在育種周期較長(zhǎng)、雄株散粉、雌株飛絮及轉(zhuǎn)基因植株安全性等問(wèn)題。因此，挖掘、利用與楊樹(shù)花藥及花粉發(fā)育相關(guān)的重要基因不僅有助于加深對(duì)林木花藥發(fā)育機(jī)理的理解，而且可為控制花粉發(fā)育，構(gòu)建雄性不育系以及防止轉(zhuǎn)基因漂移等方面提供理論依據(jù)和應(yīng)用指導(dǎo)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一個(gè)與歐美楊花藥發(fā)育相關(guān)的MYB基因PeMYB103及其編碼的蛋白質(zhì)，該基因特異在花藥中表達(dá)，表明其在楊樹(shù)花藥發(fā)育過(guò)程中發(fā)揮重要作用。本發(fā)明所提供的PeMYB103基因來(lái)源于歐美楊，其核苷酸序列及其編碼的蛋白質(zhì)序列分別如序列表中所示SEQ ID NO :1和SEQ ID NO :2。SEQ ID NO :2氨基酸序列是由 311個(gè)氨基酸組成的蛋白質(zhì)，分子量為35KD，等電點(diǎn)為5. 6，具有典型的R2R3 MYB結(jié)構(gòu)域R2 (第12-64位氨基酸)與R3 (第65-115位氨基酸)。R2結(jié)構(gòu)域自第17位氨基酸開(kāi)始， 每間隔19個(gè)氨基酸有1個(gè)保守的疏水氨基酸殘基色氨酸，共計(jì)3個(gè)W ;R3結(jié)構(gòu)域中第1個(gè) W為苯丙亮氨酸(F，第70位氨基酸)所取代，自L起每間隔18個(gè)氨基酸有1個(gè)W殘基。以上分析結(jié)果表明，PeMYB103是一個(gè)典型的R2R3 MYB轉(zhuǎn)錄因子家族成員。經(jīng)過(guò)BLAST比對(duì)， PeMYB103與調(diào)控?cái)M南芥花藥發(fā)育的重要轉(zhuǎn)錄子AtMYB103同源性為52%，是一種新的歐美楊MYB轉(zhuǎn)錄因子。本發(fā)明的目的還在于提供一種歐美楊PeMYB103基因RNAi載體；同時(shí)，還包括含有該載體的宿主細(xì)胞，所述宿主細(xì)胞為大腸桿菌細(xì)胞、農(nóng)桿菌細(xì)胞。本發(fā)明構(gòu)建的PeMYB103基因RNAi載體，可用于下調(diào)或抑制PeMYB103的表達(dá)，以獲得新的楊樹(shù)雄性不育系，具有極大的研究?jī)r(jià)值和應(yīng)用潛力。本發(fā)明同已有技術(shù)相比可產(chǎn)生如下積極效果本發(fā)明首次從歐美楊中獲得一個(gè)花藥特異MYB基因PeMYB103，并構(gòu)建了其RNAi載體，提出了利用該基因創(chuàng)造楊樹(shù)雄性不育新品種的基因工程改良方法。本發(fā)明的創(chuàng)新性在于(1)首次從歐美楊中獲得一個(gè)花藥特異MYB基因PeMYB103 ；(2)PeMYB103與調(diào)控?cái)M南芥花藥發(fā)育的重要轉(zhuǎn)錄子AtMYB103同源性為52%，表明 PeMYB103在楊樹(shù)花藥發(fā)育中發(fā)揮重要作用。(3)構(gòu)建了 PeMYB103基因RNAi載體，可用于下調(diào)或抑制PeMYB103的表達(dá)，以獲得新的楊樹(shù)雄性不育系，具有極大的研究?jī)r(jià)值和應(yīng)用潛力。


圖1為PeMYB103在不同組織中的表達(dá)模式分析圖；其中1，根；2，莖；3，葉；4，花盤(pán)；5，雌蕊；6，花藥；圖2為亞細(xì)胞定位所用的pCambial300_GFP載體圖；圖3為pBI121_PeMYB103 RNAi表達(dá)載體的構(gòu)建流程示意圖；圖4為pPUCCRNAi+lF質(zhì)粒的酶切鑒定圖；其中M, DNA Marker DL 2000 ；1，BamH I 和 Sal I 雙酶切結(jié)果圖5為pPUCCRNAi+2F質(zhì)粒的酶切鑒定圖；其中M, DNA Marker DL 2000 ；1, Xba I 禾口 Sal I 雙酶切結(jié)果圖6為pBI121_PeMYB103 RNAi質(zhì)粒的酶切鑒定圖；其中M, DNA Marker DL 2000 ；1, Xba I 禾口 Sal I 雙酶切結(jié)果
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的詳細(xì)說(shuō)明下述實(shí)例中所用方法如無(wú)特別說(shuō)明，均為常規(guī)方法。試驗(yàn)材料1.菌株與載體大腸桿菌菌株DHa、農(nóng)桿菌菌株LBA4404購(gòu)自華美生物公司；表達(dá)載體pCambial300載體購(gòu)自Cambia公司；表達(dá)載體pBI 121購(gòu)自Clontech公司。2.主要試劑Taq DNA聚合酶購(gòu)自北京全式金公司、DNA標(biāo)準(zhǔn)分子量購(gòu)自Takara公司；限制性?xún)?nèi)切酶、T4 DNA連接酶、M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶購(gòu)自Promega公司；RNeasy Plant Mini Kit 購(gòu)自 Qiagen ；BDSMART RACE cDNA Amplification Kit 購(gòu)自 Clontech。其它化學(xué)試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。
3.本發(fā)明設(shè)計(jì)的引物序列
引物由上海生工生物工程有限公司合成，序列如下
PMYBf 5‘ -CGTTG (T/C)GG(A/C)AA(A/G)AG(T/C)TG(T/C)CGT-3‘
PMYB103-1:5' -CTGGTGTCAACATAAATAAGG-3‘
PMYB103-2 5' -ATGGGTCACCATTCTTGCTGC-3‘
PMYB103-3 5‘ -TTATAGAGATGAAGGGAAAG-3‘
PMYB103-4 5' -TGTGGATAGTAGTGTACGTG-3‘
PMYB103-5 5' -AAGAGCTCATGGGTCACCATTCTTGCTGC-3'(引入Sac [酶切位點(diǎn))
PMYB103-6 5‘ -AAGGTACCTTATAGAGATGAAGGGAAAG-3‘(引入Kpn I酶切位點(diǎn))
PMYB103-RNAi-F
5'-AAGGATCCTGTGGATAGTAGTGTACGTG-3 ‘(引入 BamHI酶切位點(diǎn))
PMYB103-RNAi-Rl
5'-AAGTCGACTTATAGAGATGAAGGGAAAG-3'(引入 Sal I酶切位點(diǎn))
PMYB103-RNAi-R2
占) ^ \\\ /5'-AAGTCGAC TCTAGA TTATAGAGATGAAGGGAAAG-3 ‘(弓丨入 Sal I 禾口 Xba I 酶切位ACTIN f 5' -ACCACATACAACTCCATCAT-3‘ACT IN r 5' -CACCTTGATTTCCATGCTGC-3‘4.植物材料歐美楊(PopulusXeuramericana)5.主要儀器常溫離心機(jī)、冷凍離心機(jī)來(lái)自Eppendorf公司；、PCR儀、凝膠成像儀購(gòu)自Biorad公司。實(shí)施例1、歐美楊MYB基因PeMYB103的克隆與鑒定1. lPeMYB103 3'端的分離1. 1. lPeMYB103 3'端的擴(kuò)增以歐美楊雄花序?yàn)椴牧?，利用RNeasy Plant Mini Kit提取總RNA。用BD SMART RACE cDNA Amplification Kit試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，合成cDNA的第一條鏈，以上具體操作均按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。根據(jù)保守區(qū)的氨基酸序列RCGKSCR—兼并引物PMYBf，以cDNA為模板進(jìn)行3' RACE PCR，獲得一特異片段。PCR擴(kuò)增的條件為94°C 3min預(yù)變性后，94°C lmin, 50°C lmin，72°C 90s，共 35 個(gè)循環(huán)。1. 1.2連接、轉(zhuǎn)化、測(cè)序連接10yL連接體系中依次力卩入3yL擴(kuò)增產(chǎn)物，IyL pGME-TeasyVector (Promega), 1 μ L 10 Xbuffer, 1 μ L Τ4 DNA Ligase，其余用 ddH20 補(bǔ)足。 在7°C下連接過(guò)夜。轉(zhuǎn)化大腸桿菌DHa感受態(tài)細(xì)胞的制備方法參照F.奧斯伯等(《精編分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)指南》，1998，科學(xué)出版社)進(jìn)行。將連接產(chǎn)物通過(guò)42°C熱激導(dǎo)入大腸桿菌DH α感受態(tài)細(xì)胞中，在含有氨芐青霉素(lOOmg/mL)的LB平板上篩選抗性菌落，提質(zhì)粒，酶切鑒定。測(cè)序陽(yáng)性質(zhì)粒送上海生工生物工程有限公司進(jìn)行序列測(cè)定。測(cè)序引物為T(mén)7 Promoter Primer 5' -TAATAADCGACTCACTATAGGG-3‘和SP6 Promoter Primer5' -CATACG ATTTAGGTGACACTATAG-3‘。將所得序列作BLAST分析，得出該片段與擬南芥的AtMYB103有
5較高的同源性，將其命名為PeMYB103。1. 2PeMYB103 5'端的分離根據(jù)獲得的片段序列，設(shè)計(jì)特異引物PMYB103-1，通過(guò)5' RACEPCR分離基因的5' 端序列。具體操作參照 BD SMARTTM RACE cDNAAmplification Kit(Clontech)說(shuō)明。擴(kuò)增產(chǎn)物的連接、轉(zhuǎn)化及測(cè)序方法同1. 1. 2。1. 3 PeMYB103編碼區(qū)全序列的分離在目的基因的編碼區(qū)兩端設(shè)計(jì)特異引物PMYB103-2和PMYB103-3，以cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得cDNA編碼區(qū)全序列。PCR擴(kuò)增的條件為94°C 3min預(yù)變性后，94°C lmin, 50°C lmin,72°C 90s，共35個(gè)循環(huán)。擴(kuò)增產(chǎn)物的連接、轉(zhuǎn)化及測(cè)序方法同1. 1. 2。篩選陽(yáng)性克隆pGEM-PeMYB103，送上海生工生物工程有限公司分別用T7和SP6從兩側(cè)進(jìn)行測(cè)序證實(shí)， 該片段與將3'端序列和5'端序列拼接所得的序列一致，至此，獲得PeMYB103編碼區(qū)全序列。實(shí)施例2、歐美楊PeMYB103基因的序列分析及同源性比較利用DNAstar、Primer Premier 5. 0軟件對(duì)PeMYB103 cDNA編碼氨基酸序列進(jìn)行分析，結(jié)果顯示，PeMYB103是由311個(gè)氨基酸組成的蛋白質(zhì)，分子量為35KD，等電點(diǎn)為5. 6， 具有典型的R2R3MYB結(jié)構(gòu)域R2 (第12-64位氨基酸)與R3 (第65-115位氨基酸)。R2結(jié)構(gòu)域自第17位氨基酸開(kāi)始，每間隔19個(gè)氨基酸有1個(gè)保守的疏水氨基酸殘基色氨酸，共計(jì) 3個(gè)W;R3結(jié)構(gòu)域中第1個(gè)W為苯丙亮氨酸(F，第70位氨基酸)所取代，自L起每間隔18 個(gè)氨基酸有1個(gè)W殘基。以上分析結(jié)果表明，PeMYB103是一個(gè)典型的R2R3 MYB轉(zhuǎn)錄因子家族成員。用NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中的Blast軟件將PeMYB103與GenBank中的序列進(jìn)行比對(duì)和相似性搜索，發(fā)現(xiàn)PeMYB103與擬南芥的AtMYB103同源性為52 %，且同源區(qū)域都集中在N端 R2R3 DNA結(jié)合域，而C端同源性極低，表明分離得到的PeMYB103是一個(gè)新的楊樹(shù)MYB基因 PeMYB103。實(shí)施例3、歐美楊PeMYB103基因在不同組織中的表達(dá)特征采用RT-PCR半定量法對(duì)PeMYB103的表達(dá)模式進(jìn)行分析。分別提取根、莖、葉、花盤(pán)、花藥、雌蕊等不同組織的總RNA。取1 μ g的總RNA，用20 μ L的M-MLV酶反應(yīng)體系反轉(zhuǎn)錄合成cDNA的第1條鏈。根據(jù)PeMYB103的3端非保守區(qū)設(shè)計(jì)特異引物PMYB103-4和 PMYB103-3,進(jìn)行PCR擴(kuò)增。以肌動(dòng)蛋白基因ACTIN為擴(kuò)增內(nèi)部參照，擴(kuò)增引物為ACTIN f 和 ACT IN r。擴(kuò)增條件為:94°C 3min 預(yù)變性后，94°C lmin，54°C lmin，72°C 90s，30 個(gè)循環(huán)。 結(jié)果顯示，僅在花藥cDNA中擴(kuò)增出目的片段(圖1)，表明PeMYB103為花藥特異基因，在楊樹(shù)花藥發(fā)育過(guò)程中發(fā)揮重要作用。實(shí)施例4、PeMYB103蛋白的亞細(xì)胞定位用GFP融合蛋白技術(shù)進(jìn)行了 PeMYB103亞細(xì)胞定位研究。將PeMYB103的cDNA片段插入到PCAMBIA1300載體(載體圖譜見(jiàn)2)中GFP基因的上游，構(gòu)建了含有PeMYB103_GFP 融合基因的雙元載體，用基因槍轉(zhuǎn)化方法轉(zhuǎn)化洋蔥表皮細(xì)胞，在熒光顯微鏡下觀察，發(fā)現(xiàn) PeMYB103-GFP融合蛋白定位在細(xì)胞核中。融合表達(dá)載體的構(gòu)建方法如下根據(jù)PeMYB103 的cDNA編碼區(qū)兩端序列設(shè)計(jì)引物PMYB103-5和PMYB103-6 (分別引入Sac I和Kpn I酶切位點(diǎn))，通過(guò)PCR擴(kuò)增獲得PeMYB103 cDNA編碼區(qū)全序列。先將擴(kuò)增的PeMYB103片段和 PCAMBIA1300載體分別用Sac I和Kpn I進(jìn)行雙酶切，然后在pCAMBIA1300載體反應(yīng)液中加入2 μ L堿性磷酸酶，置于37°C下進(jìn)行去磷酸化。PeMYB103片段和pCAMBIA1300載體片段按照2 10 1的比例在T4DNA連接酶作用下16°C過(guò)夜。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DHa， 在含有卡那霉素(50mg/mL)的LB平板上篩選抗性菌落，提質(zhì)粒，進(jìn)行酶切鑒定，正確的即為重組質(zhì)粒 pCAMBIA1300-PeMYB103-GFP。實(shí)施例5、PeMYB103基因RNAi載體的構(gòu)建PeMYB103基因RNAi載體的構(gòu)建策略見(jiàn)圖3。5. lPeMYB103RNAi中間載體的構(gòu)建5. 1. lPeMYB103基因3'端非保守區(qū)的獲得選擇PeMYB103 基因 3 ‘端非保守區(qū)設(shè)計(jì)引物 PMYB103-RNAi-FPMYB 103-RNAi-Rl 和PMYB103-RNAi-R2，為便于載體的構(gòu)建，在引物PMYB 103-RNAi-F中引入BamH I酶切位點(diǎn)，在引物PMYB103-RNA1-R1中引入Sal I酶切位點(diǎn)，引物PMYB103_RNAi_R2中引入Sal I 和 Xba I 酶切位點(diǎn)。用引物 PMYB103-RNAi-F、PMYB 103-RNAi-Rl 及 PMYB 103-RNAi-F、 PMYB103-RNAi-R2分別進(jìn)行擴(kuò)增，獲得大小均為400bp的片段1和片段2，將擴(kuò)增產(chǎn)物送上海生工生物工程有限公司測(cè)序，證實(shí)片段1和片段2均為PeMYB103基因3'端片段。5. 1. 2 重組質(zhì)粒 pUCCRNA i+lF 的構(gòu)建將擴(kuò)增的目的片段1和pUCCRNA i質(zhì)粒分別用BamH I和Ml I進(jìn)行雙酶切，回收 400bp的PeMYB103片段和2. Skb的載體片段。目的片段1和載體片段按照2 10 1的比例在T4 DNA連接酶作用下16°C過(guò)夜。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DHa，在含有氨芐青霉素 (100mg/mL)的LB平板上篩選抗性菌落，提質(zhì)粒，用BamH I和Ml I進(jìn)行雙酶切鑒定，正確的即為含有正向目的片段的重組質(zhì)粒pUCCRNA i+lF(圖4)。5. 1. 3 重組質(zhì)粒 pUCCRNA i+2F 的構(gòu)建用Xho I和Bgl II雙酶切重組質(zhì)粒pUCCRNA i+lF，回收載體片段。同時(shí)，用BamH I和Ml I雙酶切目的片段2，并進(jìn)行回收純化。二者在T4DNA連接酶作用下16°C過(guò)夜。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DHa，在含有氨芐青霉素(lOOmg/mL)的LB平板上篩選抗性菌落，提質(zhì)粒，用)(ba I和Ml I雙酶切鑒定，正確的即為含有正向和反向目的片段的pUCCRNAi載體 pUCCRNA i+2F (圖 5)。5. 1. 4 pBI121-PeMYB103 RNAi 載體的構(gòu)建用Xba I和Ml I分別雙酶切以上構(gòu)建的pUCCRNA i+2F載體和pBI121載體，回收 Ikb PeMYB103 RNAi片段和13kb pBI 121載體片段。同樣按照2 10 1的比例在T4 DNA連接酶作用下16°C過(guò)夜。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DHa，在含有卡那霉素(50mg/mL)的LB平板上篩選抗性菌落，提質(zhì)粒，用)(ba I和Ml I雙酶切鑒定，正確的即為質(zhì)粒pBI121-PeMYB103 RNAi (圖 6)。實(shí)施例6、pBI121-PeMYB103 RNAi載體向農(nóng)桿菌LBA4404的導(dǎo)入6. 1感受態(tài)細(xì)胞的制備1、挑取單菌落LBA4404，接種于5mL附加有50mg/L的利副平的液體LB培養(yǎng)基中， 過(guò)夜培養(yǎng)；2、取2mL培養(yǎng)物至液體LB中，繼續(xù)培養(yǎng)至0D800為0. 5左右；
3、將培養(yǎng)物冰浴30分鐘，4°C，5000rpm,離心5分鐘； 4、棄去上清，IOmL 0. lmol/L冷的NaCl懸浮菌體；
5、4°C，5000rpm,離心 5 分鐘；5、棄上清，ImL 20mmol/L冷的CaC12懸浮，分裝成200 μ L/管，液氮中冷凍后-70°C保存。6. 2轉(zhuǎn)化、篩選1、冰上融化感受態(tài)細(xì)胞，加入1-2 μ L重組質(zhì)粒DNA(pBI121-PeMYB103RNAi)，冰浴 45分鐘，液氮中冷凍1分鐘，再37°C水浴3分鐘。2、加入ImL無(wú)抗生素的LBJ8°C，200rpm，3小時(shí)。3、12000rpm離心1分鐘以濃縮菌液，100 μ L回溶菌體。4、將轉(zhuǎn)化后的菌液涂于附加50mg/L卡那霉素，50mg/L利副平的固體LB培養(yǎng)基上， 置于下培養(yǎng)2-3天。5、進(jìn)行菌落PCR反應(yīng)驗(yàn)證，陽(yáng)性菌落即為已導(dǎo)入pBI121_PeMYB103RNAi載體的農(nóng)桿菌LBA4404。使用含有pBI121-PeMYB103 RNAi質(zhì)粒的農(nóng)桿菌侵染楊樹(shù)，有望獲得花粉敗育的轉(zhuǎn)基因植株。
權(quán)利要求
1.一個(gè)與歐美楊(PopulusXeuramericana)花藥發(fā)育相關(guān)MYB基因PeMYB103，其特征在于其核苷酸序列及其編碼的蛋白質(zhì)序列分別如序列表中SEQ ID NO :1和SEQ ID NO :2所7J\ ο
2.—種RNAi載體，其特征在于其含有權(quán)利要求1所述的基因PeMYB103。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種RNAi載體，其特征在于所述的載體為pBI121-PeMYB103 RNAi。
4.一種宿主細(xì)胞，其特征在于其含有權(quán)利要求2所述的RNAi載體。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的一種宿主細(xì)胞，其特征在于包括大腸桿菌細(xì)胞或農(nóng)桿菌細(xì)胞。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一個(gè)與歐美楊(Populus×euramericana)花藥發(fā)育相關(guān)MYB基因PeMYB103及其RNAi載體，本發(fā)明首次從歐美楊中獲得一個(gè)花藥特異MYB基因PeMYB103，該基因編碼一個(gè)由311個(gè)氨基酸組成的核定位轉(zhuǎn)錄因子。PeMYB103與調(diào)控?cái)M南芥花藥發(fā)育的重要轉(zhuǎn)錄子AtMYB103同源性為52％。本發(fā)明構(gòu)建了PeMYB103的RNAi載體，該載體可用于下調(diào)或抑制PeMYB103的表達(dá)，以獲得花粉敗育的轉(zhuǎn)基因植株。本發(fā)明的基因?qū)⒃谕ㄟ^(guò)基因工程途徑創(chuàng)建雄性不育系，尤其是培育楊樹(shù)新品種方面具有極大的應(yīng)用潛力。
文檔編號(hào)C12N15/63GK102181453SQ201010612880
公開(kāi)日2011年9月14日 申請(qǐng)日期2010年12月17日 優(yōu)先權(quán)日2010年12月17日
發(fā)明者馮培勇, 劉林德, 宿紅艷, 張娟, 王磊 申請(qǐng)人:魯東大學(xué)