專利名稱：一個棉花體細(xì)胞胚發(fā)生受體類激酶基因及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一個棉花的體細(xì)胞胚發(fā)生類受體激酶，命名為GhSERKl，及其編碼基因序列。本發(fā)明還涉及含有該基因的表達(dá)載體，以及利用該基因培育的轉(zhuǎn)基因植株。
背景技術(shù)：
植物胚胎發(fā)育生物學(xué)的范疇廣義地說包含著花的形成，雌雄配子體的發(fā)生，配子 的形成，受精與親和性，以及果實(shí)，種子等孢子體形成過程中結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系，形態(tài)建成 的生理與分子基礎(chǔ)，以及遺傳信息展現(xiàn)的時(shí)空順序等生殖發(fā)育的多個方面(唐錫華等， 2001)。目前，已在植物的花萼、花瓣、花藥、花柱和子房等生殖器官的細(xì)胞組織中檢測到 了一些特異蛋白質(zhì)，這些蛋白質(zhì)是植物細(xì)胞在不同的生殖發(fā)育時(shí)期特異基因的表達(dá)產(chǎn)物， 被認(rèn)為與各個時(shí)期細(xì)胞的功能或組織的形態(tài)建成密切相關(guān)?；ǚ郯l(fā)育是一個復(fù)雜交錯的過 程。在花粉粒釋放時(shí)許多反應(yīng)都達(dá)到最大量。影響花粉發(fā)育的不同階段的突變體已研究了 很多。許多已報(bào)道的花粉敗育突變體都是由于孢子體突變，比如花藥的藥室內(nèi)壁或絨氈層， 因?yàn)榛ㄋ幹斜诩?xì)胞和孢子細(xì)胞間的互作對于小孢子和花粉粒成熟都起著重要的作用。Schmidt等在胡蘿卜(Daucus carota)中尋找能夠監(jiān)測懸浮細(xì)胞培養(yǎng)體細(xì)胞 向胚性細(xì)胞轉(zhuǎn)變的標(biāo)記基因時(shí)發(fā)現(xiàn)的一段cDNA克隆，氨基酸順序以及激酶體外分析表 明，該基因編碼一種亮氨酸重復(fù)受體類激酶LRR-RLK(Schmidt等，2001)。隨后體細(xì)胞 胚發(fā)生相關(guān)類受體蛋白激酶(SERK)基因相繼地在擬南芥、水稻等多種植物中克隆和表 達(dá)，并被證實(shí)是植物界中廣泛存在的結(jié)構(gòu)保守基因家族。SERK基因不僅在胚性組織中 表達(dá)，還在非胚性組織中表達(dá)，參與了植物胚胎發(fā)育、雄性發(fā)育、病害防御和信號傳導(dǎo)等 活動。目前研究發(fā)現(xiàn)SERK基因的表達(dá)參與下列過程首先，SERK可標(biāo)記有胚胎發(fā)生能 力的細(xì)胞無論是DcSERK、AtSERK還是MtSERK，研究表明SERK是胚胎發(fā)生細(xì)胞的一個 很好的標(biāo)記。與其它標(biāo)記如單克隆抗體JIM8、JIM13以及同功酶、酯酶等相比，SERK在 培養(yǎng)條件下顯得具有非常的獨(dú)特性，能夠顯示其它標(biāo)記所不能顯示的被標(biāo)記細(xì)胞與細(xì) 胞成胚能力之間的關(guān)系(Schmidt ED, 1997 ；Thomas TL，1993 Jianru Ζ, 2002) 其次， SERK 參與油菜素類固醇(brassinosteroid, BR)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)(Russinova E 等，2004) BR參與了包括植物生長發(fā)育、抵抗逆境等許多生理活動。目前已鑒定BR信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的部 分組分，如 BRIl(BR insensitive 1)、BAKl(BRI1-associated receptor kinase 1)、 BIN2 (BR-insensitive2)、BESl (BRI 1-EMS-suppressor lprotein,即 BIN2 底物 1 蛋白)、 BZRl (brassinazoleresistantl protein,即BIN2底物2蛋白)等，各組分的功能和相互 之間的關(guān)系也已有了解。BAKl是一種SERK蛋白，等同于AtSERK3。遺傳和生化實(shí)驗(yàn)證明， BAK1/BRI1復(fù)合物引發(fā)BR信號。AtSERK3 (BAKl)的一個作用可能是通過改變質(zhì)膜與胞內(nèi)體 中BRIl的平衡介導(dǎo)BR信號(Rumyana K等，2006)。第三，SERK參與植物病害防御=LRR-RLKs 參與植物抗病反應(yīng)的報(bào)導(dǎo)較多，如Xa21基因參與了水稻抗白葉枯病反應(yīng)。OsSERKI屬于 LRR-RLKs之一，不僅能被稻瘟菌侵染誘導(dǎo)表達(dá)，還參與了水稻抗稻瘟菌的反應(yīng)。水稻受稻瘟菌侵染后，OsSERKl被誘導(dǎo)表達(dá)，且它的表達(dá)量與水稻的抗病性有定性關(guān)系(Song WY等，1995 ；Staskawicz BJ等，1995)。最后，SERK參與孢子體發(fā)育目前，有報(bào)導(dǎo)稱擬南芥serkl 或serk2的單突變體不能引起孢子體發(fā)育的任何異常表型，但serklserk2雙突變體導(dǎo)致孢 子體發(fā)育不完全或雄性不育。serklSerk2雙突變體的造孢細(xì)胞產(chǎn)生小孢子母細(xì)胞只能進(jìn) 行減數(shù)分裂到四分體時(shí)期，隨后母性細(xì)胞消失，導(dǎo)致雄性完全不育(Catherine A等，2005)。 Tean等觀察到SerklSerk2雙突變體的造孢細(xì)胞的外層細(xì)胞只能發(fā)育成3層細(xì)胞，缺乏野生 型的絨氈層細(xì)胞，使孢子體不能正常發(fā)育成成熟的花粉粒，這與emsl/exs和tpdl突變體表 型相似。SerklSerk2雙突變體的不育性可通過用野生型花粉?；謴?fù)，且產(chǎn)生的種子可以正 常發(fā)育。然而目前尚未見SERK基因在重要經(jīng)濟(jì)作物棉花中的報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個目的是提供棉花GhSERKl基因的基因組序列，全長cDNA序列與氨基 酸序列，它們分別為序列表中SEQ ID NO1、2、3 所示。本發(fā)明的另一個目的是提供棉花GhSERKl基因的開放讀碼框序列，為序列表中 SEQ ID NO 4 所示。本發(fā)明的再一個目的是提供棉花GhSERKl基因的表達(dá)載體pK7GGS11683 (CGMCC No 3879)，以及這個表達(dá)載體上所含有的cDNA序列，它為序列表中SEQ ID NO 5所示。同 時(shí)用任何一種可以引導(dǎo)外源基因在植物中表達(dá)的表達(dá)載體。含有該發(fā)明GhSERKl基因的表 達(dá)載體和細(xì)胞系，以及含有該類基因的植物品系種均為本發(fā)明的保護(hù)范圍。本發(fā)明還有一個目的是所述的表達(dá)載體可通過使用農(nóng)桿菌侵染，花粉管通道，基 因槍轉(zhuǎn)化等導(dǎo)入植物細(xì)胞，可使用本發(fā)明的方法轉(zhuǎn)化的植物宿主包括單子葉植物和雙子葉 植物，例如棉花、水稻、小麥、玉米、油菜、甘蔗、黃瓜、苜蓿等。


圖1表示利用簡并引物擴(kuò)增棉花基因組DNA獲得的GhSERKl基因的DNA片段的電 泳圖。圖2表示含有GhSERKl基因組DNA的BAC克隆酶切圖。圖3表示GhSERKl編碼基因開放讀碼以cDNA為模板PCR擴(kuò)增結(jié)果的瓊脂糖電泳 圖。圖4為GhSERKl基因基因組結(jié)構(gòu)(包含預(yù)測的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn))。圖5為GhSERKl基因外顯子與內(nèi)含子結(jié)構(gòu)示意圖。圖6為GhSERKl基因全長cDNA中5，UTR,開放讀碼框(CDS)與3，UTR結(jié)構(gòu)示意圖。圖7為GhSERKl蛋白跨膜結(jié)構(gòu)域預(yù)測示意圖。圖8為GhSERKl蛋白結(jié)構(gòu)域示意圖。圖9為在雄性不育系和可育系與生殖發(fā)育相關(guān)組織中，GhSERKl基因的表達(dá)差異。圖10為轉(zhuǎn)GhSERKl基因表達(dá)載體(pK7GGS11683與pK7GGS17016)的構(gòu)建過程示意圖。
圖11為轉(zhuǎn)表達(dá)載體pK7GGS17016棉花的PCR鑒定。圖12為轉(zhuǎn)表達(dá)載體pK7GGS11683棉花的PCR鑒定。圖13為轉(zhuǎn)表達(dá)載體pK7GGSl 1683棉花的花器官表型圖。圖14為轉(zhuǎn)表達(dá)載體PK7GGS17016棉花的花器官表型圖。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1棉花GhSERKl編碼基因的克隆材料與方法1)棉花材料棉花材料選用自選品種Y18R。2)菌種大腸桿菌 E. coli DH5 α。3)載體pMD18_T、pK7GWIWG2 (I)。4)工具酶和修飾酶各種限制性內(nèi)切酶和修飾酶購自TaKaRa公司、NEB公司及 Fermentas 公司。5)化學(xué)試劑化學(xué)藥品均為國內(nèi)外分析純。6)引物合成由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。下述實(shí)施例中所有方法如無特別說明均為常規(guī)方法。實(shí)施例1，棉花GhSERKl基因的克隆(1)棉花基因組的制備采用改良CTAB法提取陸地棉品種Y18葉片部位的基因 組，用于PCR;1)提取液配制IL 提取液含Tris_HCl (PH8. 0)0. IMEDTA (PH8. 0)0. 02MNaCl1. 5MPVP40 (w/v)2%CTAB (w/v)2%以上溶液各自溶解后混合，定容到IL ；臨用前加2% β-巰基乙醇。2)稱取0. 3g幼嫩棉花葉片放入2mL離心管里，加入鋼珠，液氮速凍后，放置于 Genegrid研磨儀上振蕩30s，加入ImL預(yù)熱65°C提取緩沖液。顛倒混勻。3)將溶液置于65°C水浴中40分鐘；加等體積氯仿異戊醇(24 1，V/V)振 蕩混勻，4°C離心機(jī)12000rpm離心10分鐘，將上清轉(zhuǎn)移到另一離心管中，用氯仿異丙醇 (24 1，V/V)再抽提一次，離心收集上清；4)加入0. 6倍體積的冰預(yù)冷的異丙醇，緩慢顛倒離心管混勻，室溫靜置30min。用 毛細(xì)管將絮狀DNA挑出，或者直接室溫12000rpm離心10分鐘，用70%的酒精洗滌1_2次， 再用100%酒精洗滌1次，室溫干燥DNA。5)加 200 μ L TE (IOmM Tris-HCl, ImM EDTA, ΡΗ8. 0)或者純水(ddH20)，室溫放置 1小時(shí)，或者65°C水浴使DNA完全溶解；6)加入20ul無DNA酶的RNA酶水(10mg/mL)，37°C保溫1小時(shí)，用等體積的酚氯仿異戊醇(25 24 1，V/V)抽提1 2次，將上清轉(zhuǎn)移到另一個離心管中；7)加0. 1倍體積的3M NaAc (PH5. 2)，2倍體積的冰預(yù)冷的無水乙醇，混勻后放置5分鐘。緩緩水平轉(zhuǎn)離心管5分鐘，此時(shí)將于界面處形成一團(tuán)粘稠透明的絮狀沉淀用毛細(xì)管輕輕鉤出，轉(zhuǎn)移到1. 5ml的離心管中；或者直接12000rpm離心10分鐘，沉淀DNA。8)加lmL70%的酒精洗滌沉淀，IOOOOg離心10分鐘，去掉上清，再用70%、100% 的酒精各洗沉淀一次，在空氣中使核酸沉淀干燥；9)用50ul的TE重新溶解沉淀，于_20°C或_70°C貯存。結(jié)合生物信息學(xué)獲取SERK基因保守片斷EST序列根據(jù)GenBank庫SERK基因結(jié) 構(gòu)特點(diǎn)，結(jié)合保守結(jié)構(gòu)域序列設(shè)計(jì)2條簡并引物上游引物5，CAGTTTCARACHGARGTDGAG3，下游引物5，ATGTTTGCWGCTTTYACRTC3，(M =AorC ；K =GorT ；W =AorT ；R =AorG ；Y =CorT ；S =CorG ；D =AorGorT ；H =AorCorT ；N AorCorGorT)擴(kuò)增獲得一個目的擴(kuò)增結(jié)果，大小為1500bp，回收后與pMDIS-T載體連接、16°C過 夜，轉(zhuǎn)化受體菌DH5 α，菌液PCR及酶切鑒定正確的菌株送測序。(圖1中，M =Marker, 1，，2， 3,4,5分別是GhSERKl以棉花基因組DNA為模板PCR擴(kuò)增獲得1. 5Kb片段)在已知序列的基礎(chǔ)上，設(shè)計(jì)特異引物上游引物5‘ CAGTTTCAGACAGAAGTAGAG3 ‘下游引物5‘ ATGTTTGCTGCTTTCACATC3 ‘篩選棉花Y18基因組BAC文庫，獲得陽性克隆后(圖2中，1 =Marker, 2 箭頭所指 為陽性BAC克隆插入片段大小)，測序獲得GhSERKl的全長基因組序列，為序列表中SEQ ID NO :1 (圖4 為利用Softberry軟件分析獲得GhSERKl基因基因組結(jié)構(gòu)，包含預(yù)測轉(zhuǎn)錄起始 位點(diǎn)后GhSERKl基因全長為6920bp ；其中⑶S表示外顯子，共11個外顯子，10個內(nèi)含子； TSS表示預(yù)測的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)，轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)TSS至ATG為453bp ；圖5為GhSERKl基因中 外顯子與內(nèi)含子的位置及相對片段長度，其中方框?yàn)橥怙@子，直線為內(nèi)含子，共6467bp ；)。3) GhSERKl全長cDNA序列的獲得采用3，RACE 和 5，RACE 的方法得到 了 GhSERKl 全長 cDNA 序列，3，RACE 和 5，RACE 按TaKaRa公司的3，RACE和5，RACE試劑盒說明操作。具體方法包括以下步驟1、總RNA的提取1)將0. 2g冷凍的材料放入預(yù)冷的研缽中，研磨成粉狀，倒入2mL離心管中，加ImL 預(yù)熱至80°C的基本提取液，10 μ 1 DTT貯備液和25 μ 1蛋白酶K貯備液，混勻；2) 420C，IOOrpm,溫和搖動 90 分鐘；3)每管加入80 μ 1 2mol/L KCl溶液，調(diào)整KCl終濃度至160mmol/L，冰浴1小時(shí)；4) 12，OOOrpm離心 20 分鐘，取 900 μ 1 上清液，加入 300 μ 1 8mol/L LiCl，混勻，冰 上過夜沉淀；5) 12，OOOrpm離心20分鐘，棄上清，沉淀用2mol/L LiCl (冰預(yù)冷)洗2 3次，直
至上清液無色；6)懸浮 LiCl-RNA 沉淀于 400 μ 1 10mmol/L Tris-Cl (ρΗ7· 5)，混勻，12，OOOrpm 離 心10分鐘，轉(zhuǎn)移上清至新離心管中；7)加入1/10體積的2mol/L KAc (ρΗ5· 5)，混勻，冰浴15分鐘；
8) 12，OOOrpm離心10分鐘，除去鹽不溶性物質(zhì)，取上清；9)用2. 5倍體積的無水乙醇于_20°C沉淀過夜或_70°C沉淀2 3小時(shí)；10)用70%冷乙醇洗滌RNA沉淀，真空快速干燥，溶于DEPC水中；11)力卩 RNase-Free DNase, 37°C, 30 分鐘；
12)加等體積的氯仿異戊醇抽提；13)用2. 5倍體積的無水乙醇于_20°C沉淀過夜或_70°C沉淀2 3小時(shí)；14)用70%乙醇洗滌沉淀，干燥；15)將RNA溶于DEPC處理的水中備用。2、第一鏈cNDA的合成用東洋紡公司的ReverTra Ace- α -反轉(zhuǎn)錄酶試劑盒，按試 劑盒說明書進(jìn)行操作反應(yīng)體系RNA (1-5 μ g)11. 0μ 1RNase Inhibitor (IOU/μ 1)Ι.ΟμΙ5 X RT buffer4. 0 μ 1dNTP Mixture(IOmmo1/L each)2. 0 μ 1AMV Oligo (lOpmol/μ 1)1· 0 μ 1ReverTra Ace_1. 0 μ 1total20. 0μ 1反應(yīng)條件42°C，20min；99°C，5min ；4°C，5min ；瞬間離心，_20°C保存。3、設(shè)計(jì)引物進(jìn)行3，RACE和5，RACE用于3' RACE 引物3， Primer 5 ‘GCTGTCAACGATACGCTACGTAACG 3，3’ Nested Primer 5 ‘CGCTACGTAACGGCATGACAGTG 3’3' RACE fpl 5' -CCTCCTTTTGTACCACCACCGCC-3‘3' RACE fp2 5' -CGCCAATTTCTTCTCCAAGTGGG-3‘用于5，RACE的特異引物5’ Primer 5 ‘ -CGACTGGAGCACGAGGACACTGA-3‘5' Nested Primer 5' -GGACACTGACATGGACTGAAGGAGTA-3‘5' RACE rpl 5' -GTCCAAGATGAACTTCTGGGTCCTC-3‘5' RACE rp2 5' -AATTCTTGAGGTTTCCGCCGACGCC-3‘將擴(kuò)增出的DNA片段用1 %的瓊脂糖膠分離、回收并連接到pMDIS-T easy Vector，轉(zhuǎn)化Ε. coli DH5 α，酶切鑒定正確后送華大基因測序，利用生物軟件Vector9. 0、 Conting對獲得的序列進(jìn)行拼接，獲得基因的全長cDNA序列，為序列表中SEQ IDNO :2，根據(jù) BLAST的分析結(jié)果，因?yàn)榕c擬南芥的SERKl基因相似性最高，因此命名為GHSERK1。(圖6為 GhSERKl基因全長cDNA結(jié)構(gòu)，其中5，肌1 為42牝？，開放讀碼框(CDS)為1884bp，3，UTR為 194bp ；)根據(jù)獲得的序列設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增其開放讀碼框cDNA序列，3'端引物為fp2，5'端 引物為rp2，為方便鑒定，在其5'端引物加入HindIII酶切位點(diǎn)，在其3'端引物加入SalI 酶切位點(diǎn)rp2 5' -CGCAAGCTTATGGAAGGAAGCAAAAAGG-3‘
fp2 5' -CGCGTCGACCCTTGGACCGGATAACTCAAC-3'PCR反應(yīng)體系cDNAΙ.ΟμΙ反應(yīng)buffer (IOX)5. O μ 1dNTP(2. 5mmol/L each)4. O μ 1fp2(10yM)1. Ομ 1Γρ2(10μΜ)1. Ομ 1Taq 酶(2· 5υ/μ 1)1. 25μ 1ddH.O_36. 75 μ 1total50. Ομ 1反應(yīng)條件:95°C,5min；95°C，30 秒；55°C，45 秒；72°C，2min30s ；35 個循環(huán)；72°C, 5min ；4°C，pause。反應(yīng)結(jié)束后，對PCR產(chǎn)物進(jìn)行0. 8%瓊脂糖凝膠電泳檢測，檢測結(jié)果如圖 3所示(泳道M為marker，泳道1為GhSERKlRT-PCR產(chǎn)物得到分子量約為1. 8kb的條帶)， 與預(yù)期結(jié)果相符。用瓊脂糖凝膠回收試劑盒(AXYGEN公司)回收該片段，然后將該回收片 段與pGEM-T Easy (Promega公司)載體進(jìn)行連接。連接體系PCR 回收產(chǎn)物3. 0μ1pMD18-TΙ.ΟμΙT4DNA LigaseΙ.ΟμΙ反應(yīng)buffer (10Χ)Ι.ΟμΙddH20_4. 0μ 1total10. 0μ 116 °C保溫過夜。用上述連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌T0P10感受態(tài)。將重組體系加入感受態(tài)細(xì)胞溶液 中，輕輕混勻，置冰上30分鐘。在42 °C下熱激處理90秒，立即置冰上，冰浴2分鐘。加 入500 μ 1 LB液體培養(yǎng)基，37 °C搖床180rpm，培養(yǎng)45分鐘，然后涂布在有氨芐青霉素 (50mg/L)的LB固體培養(yǎng)基上，倒置培養(yǎng)37°C過夜，篩選陽性克隆，得到重組質(zhì)粒命名為 pGEMTGSl⑶S(CGMCC No 3878)。以該載體上的T7和SP6啟動子序列為引物對其進(jìn)行核苷 酸序列測定。最后獲得GhSERKl基因的開放讀碼框序列，為序列表中SEQ ID N0:3，根據(jù)開 放讀碼框序列推測出其蛋白序列為序列表中SEQ ID NO :4。(圖7 為根據(jù)GhSERKl基因的 氨基酸序列預(yù)測的跨膜結(jié)構(gòu)域，其中胞外結(jié)構(gòu)域1_241位氨基酸；跨膜結(jié)構(gòu)域242-264位 氨基酸；胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域265-627位氨基酸；圖8為GhSERKl蛋白結(jié)構(gòu)域示意圖，其中外顯子1 編碼信號肽(signal peptide, SP)；外顯子2編碼亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)(leu zipper, ZIP)；外顯 子3 6編碼5個富亮氨酸重復(fù)序列(leu-rich repeat, LRR)，其中除外顯子4編碼LRR2 和LRR3外，其他每一個外顯子編碼一個LRR ；外顯子7編碼含SPP(Ser-Pro-Pro)基序的富 脯氨酸結(jié)構(gòu)域；外顯子8編碼跨膜結(jié)構(gòu)域(transmembrane region, TM)；外顯子9 11編 碼胞內(nèi)激酶活性結(jié)構(gòu)域。)實(shí)施例2GhSERKl基因在棉花中的表達(dá)特性分析1，模板制備采用改良的熱硼酸法(上文已述)，從棉花兩個雄性可育系(Y18與P30B)和一個雄性不育系(P30A)的與生殖發(fā)育相關(guān)的組織花蕾(6個發(fā)育時(shí)期 2-day-old, 5-day-old, 7-day-old, 11-day-old, 14-day-old, 18-day-old,以 i @ 3mm 的 花蕾作為現(xiàn)蕾第一天)，花萼，花瓣，花藥，胚珠中提取總RNA，其中與可育系Y18與P30B 相比，雄性不育系P30A的表型雌蕊正常發(fā)育，而花粉完全敗育。提取的RNA質(zhì)量由OD26tl/ OD280比值和0. 7%瓊脂糖凝膠電泳鑒定。以其為模板按下列方案進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)在一 個PCR小管中加入2yg總RNA和IyL Oligo (dT) 1(1，65°C溫育lOmin，然后迅速置于冰上 2min，再力口入 5 XMMLV (RNase H free) Buffter 5 μ L, dNTP (25mmol/L) 5 μ L, Ribonuclease Inhibitor 20U, MMLV 200U，最后用 Nuclease free 水補(bǔ)充至總體積 25 μ L，42 °C 溫育 90min, 72°C lOmin, 95°C水浴 5min 滅活匪LV，得到的 cDNA_20°C保存?zhèn)溆谩?，模板cDNA的相對定量及內(nèi)標(biāo)引物的設(shè)計(jì)根據(jù)棉花延伸因子基因EFl α的序列 信息，內(nèi)參引物設(shè)計(jì)如下GhEFl α fp 5' -GCGATCTGGTAAGGAGCTTG 3‘GhEFl α rp 5' -GGAGAAGGTTTCCACAACC-3‘以棉花cDNA做模板，用該引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR 反應(yīng)體系模板 1 μ 1，PCR Buffer 5 μ 1, IOmMdNTP 3 μ 1, GhEFl α fp 1 μ 1, GhEFl α rp 1 μ 1，Taq IU，ddH20 8 μ 1。PCR 條件94 °C，2min ；94 °C，30Sec ；55 °C，30Sec ；72 °C，30Sec ；30cycle ；72 "C, lOmin。根據(jù)PCR產(chǎn)物的電泳結(jié)果對模板cDNA進(jìn)行稀釋，調(diào)整模板cDNA的用量，直到 GhEFl α fp和GhEFl α rp引物擴(kuò)增出的DNA條帶的量基本一致，使每微升溶液中模板cDNA 的含量基本一致。3)熒光定量PCR分析根據(jù)內(nèi)參基因EFla所設(shè)計(jì)的引物GhEFl a fp和GhEFl a rp，以及GhSERKl基因的 特異引物SPl 5' -GTTGGCCGAGAGATGGGATG-3‘SP2 5' -ATGCGGACTGGGCTTACAGG 3‘以棉花兩可育系(Y18與P30B)和一個不育系(P30A)上述與生殖發(fā)育相關(guān)的組 織cDNA為模板PCR擴(kuò)增，每個樣品設(shè)置3次重復(fù)。實(shí)時(shí)定量PCR擴(kuò)增體系反應(yīng)體系如下 cDNA模板0. 2μ L、10y L 2 X SYBR Green I MIXUOymol Γ1 正向引物 0. 4 μ L、10 μ mo 1 L-1 反向引物0. 4μ L，加水到總體積20 μ L0 PCR程序94°C預(yù)變性5min ； 94 °C 30s, 59 °C 30s， 721308，44個循環(huán)；72151^11，41保存。SYBR Green I染料購買于Toyobo公司，實(shí)時(shí)熒 光定量PCR儀選用MJ公司的PTC-200，BIO-RAD公司的Chromo4軟件收集數(shù)據(jù)。參考Jiang 等(2007年)所描述的方法用2_Δ Δετ法處理GhPG2基因在各個組織之間相對表達(dá)的CT值。 (圖9 中，F(xiàn)B =Flower Bub (花蕾)；S印als (花萼)；Petal (花瓣)；Anther (花藥)；Ovule (胚 珠))3，結(jié)合棉花發(fā)育特點(diǎn)，熒光定量結(jié)果表明1)在花蕾發(fā)育的前三個時(shí)期，P30A的花萼與花瓣原基正常分化，此時(shí)P30A中 GhSERKl基因表達(dá)與可育系相同，呈遞增趨勢；2)在花蕾發(fā)育的第四期至第五期，此時(shí)正值棉花雄蕊分化與發(fā)育。根據(jù)細(xì)胞學(xué)形態(tài)觀察，P30A雄蕊中絨氈層發(fā)育異常，而此時(shí)GhSERKl基因表達(dá)下降；
3)到第六期，花蕾已進(jìn)入雌蕊分化與發(fā)育階段，此時(shí)GhSERKl基因表達(dá)上升。4)P30A成熟花藥中GhSERKl基因的表達(dá)明顯低于P30B。其成熟花萼，花瓣和胚珠與P30B的相近。結(jié)論=GhSERKl與棉花的生殖發(fā)育相關(guān)，而且可能參與花粉的絨氈層發(fā)育。實(shí)施例3、棉花GhSERKl植物表達(dá)載體的構(gòu)建利用Invitrogen公司的GATEWAY系統(tǒng)構(gòu)建植物表達(dá)載體，選擇GhSERKl中兩個 cDNA片段，它們分別為序列表中SEQ IDNO :5、6。分別命名為1683和7016，其中片段1683和 7016是SERK基因保守結(jié)構(gòu)域的兩個部分。將它們分別與pMD18-T連接，命名為pMDGS11683 與pMDGS17016，分別與入門載體pD0NR211進(jìn)行BP重組反應(yīng)，將它們重組到pD0NR211上。BP重組體系pMDGS11683orpMDGS170161.0μ 1(50 IOOng)pD0N0R221 (30 50ng)0. 5 μ 1BP enzyme MixΙ.ΟμΙddH20_2. 5μ 1total5. 0μ 125°C保溫 1 小時(shí)，加 1 μ 1 Proteinase K，37°C，IOmin 終止反應(yīng)。將重組產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌T0P10感受態(tài)，經(jīng)卡那篩選得到陽性克隆，將重組子命 名為 pD0NR211-1683 與 pD0NR211-7016。提取陽性克隆質(zhì)粒pD0NR211-1683 與 pD0NR211-7016 (統(tǒng)稱 pD0N0R221_GhSERK)， 利用LR重組反應(yīng)將它們分別重組到植物表達(dá)載體pK7GWIWG2(I)上。LR重組體系pD0N0R221-GhSERK 質(zhì)粒(50 IOOng)1. 0 μ 1pK7GWIWG2 (I) (30 50ng)0. 5 μ 1LR enzyme Mix0. 5 μ 1ddH,0_0. 5μ 1total2. 5μ 125°C保溫 1 小時(shí)，加 1 μ 1 Proteinase K，37°C，IOmin 終止反應(yīng)。用上述重組體系轉(zhuǎn)化大腸桿菌T0P10感受態(tài)，經(jīng)壯觀霉素篩選得到陽性克隆，將 重組子命名為 PK7GGS11683 (CGMCC No 3879)與 pK7GGS17016。(圖 IOEntry Clone (入門 載體)pD0NR211-1683, pD0NR211-7016 ；Destination Vector (表達(dá)載體):pK7GWIWG2 (I)； Gene =GhSERKl中兩個cDNA片段，分別命名為1683和7016 ；Binary Vector (雙元載體) PK7GGS11683，pK7GGS17016。)實(shí)施例4、棉花GhSERKl轉(zhuǎn)基因棉花的篩選與獲得1、棉花GhSERKl植物表達(dá)載體轉(zhuǎn)化棉花用gene pulser Xcell電轉(zhuǎn)儀(美國Bio Rad公司)并參照說明書進(jìn)行操作，將 質(zhì)粒PK7GGS11683與pK7GGS17016用電擊轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌LBA4404，經(jīng)含利福平和壯觀霉 素的抗性平板進(jìn)行篩選得到農(nóng)桿菌陽性克隆，再利用噴施農(nóng)桿菌法，在上述陽性克隆農(nóng)桿 菌的介導(dǎo)下將PK7GGS11683與pK7GGS17016轉(zhuǎn)化棉花。
2、抗性篩選轉(zhuǎn)基因植株噴施農(nóng)桿菌法轉(zhuǎn)化后收到的種子，播種于大田中，培養(yǎng)到幼苗長出8-10片真葉且較粗壯時(shí)噴施卡那霉素，可發(fā)生顯色反應(yīng)的為陽性植株。同時(shí)剪取葉片，提基因組DNA鑒定 是否為轉(zhuǎn)基因株系，鑒定正確的轉(zhuǎn)基因株系記為Tl代轉(zhuǎn)基因材料。3、轉(zhuǎn)基因棉花的PCR鑒定1)棉花基因組DNA的提取上文已詳述。2)轉(zhuǎn)基因植株的PCR鑒定以步驟1基因組DNA為模板，上游引物1683-sp :5， -GAATGCTGGAAGGTGATGGG-3，；7016-sp :5， -TTGCGTTGGGATCTGCTAGG-3，；下游引物5，-CCATAGGGGTTTAGATGCAACTG-3，；用PCR的方法對轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行鑒定，其中上游引物根據(jù)所選擇的棉花SERKl cDNA片段序列設(shè)計(jì)，下游引物根據(jù)植物表達(dá)載體PK7GWIWG2 (I)載體序列設(shè)計(jì)。PCR反應(yīng)體系基因組DNAΙ.ΟμΙ反應(yīng)buffer (IOX)2. 0 μ 1dNTP(2. 5mmol/L each)1. 6μ 1上游引物(10μ Μ)0. 5μ 1下游引物(10μ Μ)0. 5μ 1Taq 酶(2· 5υ/μ 1)0. 5 μ 1dd Η,Ο_13. 9μ 1total20. 0μ 1反應(yīng)條件:95°C,5min；95°C，30 秒；58°C，45 秒；72°C，2min30s ；35 個循環(huán)；72°C, 5min ；4°C，pause。反應(yīng)結(jié)束后，對PCR產(chǎn)物進(jìn)行1 %瓊脂糖凝膠電泳檢測，檢測結(jié)果如圖11， 12所示(圖11 泳道1-9為轉(zhuǎn)質(zhì)粒pK7GGS17016的株系，10為陽性質(zhì)粒pK7GGS17016，11為 野生型，M為marker ；圖12 泳道1_8為轉(zhuǎn)pK7GGS11683的株系，9為陽性質(zhì)粒pK7GGS11683， M為Marker，10為野生型植株，11為無模板對照)所有轉(zhuǎn)基因株系的擴(kuò)增條帶與陽性質(zhì)粒 擴(kuò)增條帶大小一致，與預(yù)期大小相符，而野生型則沒有擴(kuò)增條帶，表明目的基因成功轉(zhuǎn)入棉 花中。4、轉(zhuǎn)表達(dá)載體pK7GGS11683與pK7GGS17016棉花的花器官表型分別含有干擾載體pK7GGS11683與pK7GGS17016的轉(zhuǎn)基因棉花花器官的表型為 雌蕊發(fā)育正常，但雄蕊中無花粉粒，即出現(xiàn)雄性完全敗育的現(xiàn)象(圖13 左面為野生型的花 器官，右面為轉(zhuǎn)表達(dá)載體PK7GGS11683棉花的花器官；圖14 左面為野生型的花器官，右面 為轉(zhuǎn)表達(dá)載體PK7GGS17016棉花的花器官)。結(jié)合實(shí)施例2的結(jié)果，說明=GhSERKl基因與棉花生殖發(fā)育相關(guān)，而且在雄蕊發(fā)育 中起重要作用。
權(quán)利要求
一個棉花體細(xì)胞胚發(fā)生相關(guān)類受體蛋白激酶基因GhSERK1，它的氨基酸序列如SEQ IDNO4所示。
2.一個棉花體細(xì)胞胚發(fā)生相關(guān)類受體蛋白激酶基因GhSERKl，其基因組堿基序列如 SEQ IDNO 1 所示。
3.一個棉花體細(xì)胞胚發(fā)生相關(guān)類受體蛋白激酶基因GhSERKl，其開放讀碼框(CDS)堿 基序列如SEQ ID NO 3所示。
4.一個棉花體細(xì)胞胚發(fā)生相關(guān)類受體蛋白激酶基因GhSERKl，其干擾載體 PK7GGS11683 上含有的 GhSERKl 序列如 SEQ ID NO 5 所示。
5.根據(jù)權(quán)利要求2或3提供的核苷酸序列片段所構(gòu)建的表達(dá)載體，其特征在于含有 任選權(quán)利要求2或3所述的其中之一核苷酸片段的表達(dá)載體。
6.根據(jù)權(quán)力要求5所述的表達(dá)載體，其特征在于所述表達(dá)載體為植物表達(dá)載體 pK7GGS11683(CGMCC No 3879)。
7.含有權(quán)利要求5、6所述表達(dá)載體的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系。
8.一種培育轉(zhuǎn)基因植株的方法，其特征在于將權(quán)利要求5、6所述的植物表達(dá)載體導(dǎo) 入植物細(xì)胞，獲得的轉(zhuǎn)基因植株。
9.根據(jù)權(quán)力要求8所述的方法，其特征在于所述被轉(zhuǎn)化的目的植物為單子葉植物或 雙子葉植物，如水稻、小麥、棉花、玉米、擬南芥、油菜或大豆等。
全文摘要
本發(fā)明公開了一個新棉花體細(xì)胞胚發(fā)生相關(guān)受體類激酶GhSERK1，及其編碼基因與應(yīng)用。它的氨基酸序列如SEQ ID NO3所示；其編碼基因的基因組序列分別如SEQ ID NO1所示；其編碼基因的cDNA序列如SEQ ID NO2所示；其開放讀碼框序列為序列表中SEQ ID NO4所示。本發(fā)明還公開了該基因(GhSERK1)在棉花雄蕊發(fā)育中起重要作用的特性。該基因?qū)ε嘤坌圆挥参锲贩N提供基因源，對培育植物雄性不育系具有重要的意義。
文檔編號C12N15/63GK101824421SQ20101019047
公開日2010年9月8日 申請日期2010年6月3日 優(yōu)先權(quán)日2010年6月3日
發(fā)明者張銳, 石雅麗, 郭三堆 申請人:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所;郭三堆