一種磁性二氧化硅復(fù)合微球的制備方法及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種磁性二氧化硅復(fù)合微球及其制備方法和應(yīng)用。本發(fā)明利用高溫?zé)峤夥椒ㄖ苽涑槾判运难趸F納米粒子（4～30nm），在磁性納米粒子外表面，利用反相微乳液法包覆二氧化硅外殼（殼厚5～20nm），對(duì)二氧化硅表面進(jìn)行氨基化修飾，用戊二醛作為交聯(lián)臂，再接入配基蛋白，利用配基蛋白與目標(biāo)蛋白的特異性結(jié)合，進(jìn)行蛋白分離。本發(fā)明所制備的磁性微球粒徑小，單分散性好，帶有氨基的復(fù)合微球比表面積大，利用親核加成反應(yīng)，接入交聯(lián)臂戊二醛后，可以接入多種配基蛋白，從而可以分離多種目標(biāo)蛋白，十分適合生物樣品中蛋白的快速分離及應(yīng)用，在生物醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景和巨大的應(yīng)用價(jià)值。
【專利說明】一種磁性二氧化硅復(fù)合微球的制備方法及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于免疫化學(xué)試驗(yàn)領(lǐng)域，涉及一種磁性二氧化硅復(fù)合微球及其制備方法和應(yīng)用
【背景技術(shù)】
[0002]20世紀(jì)90年代以來，隨著納米科技的發(fā)展,磁性材料已步入磁性納米材料的新紀(jì)元。磁性納米材料與體相磁性材料相比磁學(xué)性質(zhì)發(fā)生了很大變化，具有非常廣闊的應(yīng)用前景，已經(jīng)成為國(guó)際上的研究熱點(diǎn)。磁性粒子在蛋白分離、藥物靶向等方面的應(yīng)用，也是當(dāng)前生物領(lǐng)域中的熱門研究課題之一。在眾多的磁性納米材料中，超順磁性Fe304納米粒子在生物體中易代謝分解，因此Fe304納米粒子在生物醫(yī)藥方面具有潛在應(yīng)用。一種合成單分散Fe304納米粒子的常用方法是含鐵的配體化合物(如乙酰丙酮化合物、乙酸鹽、油酸鹽等)的高溫?zé)岱纸?，此反?yīng)是在非極性溶劑中發(fā)生的，獲得顆粒接近單分散，但是疏水性的且不適合生物應(yīng)用。為解決這個(gè)問題需要將疏水的Fe304納米粒子進(jìn)行表面修飾，使其變成親水性的。Si02包覆方法是一種很好的改性方法，因?yàn)镾i02具有很好的生物相容性和穩(wěn)定性，無毒且容易進(jìn)一步和不同官能團(tuán)結(jié)合。對(duì)于二氧化硅表面的硅羥基進(jìn)行氨基化修飾，再接入交聯(lián)臂戊二醛。此磁性二氧化硅復(fù)合微球的交聯(lián)臂含有醛基，通過親核加成反應(yīng)與配基蛋白結(jié)合，戊二醛與蛋白反應(yīng)具有活性高、反應(yīng)快、結(jié)合量高、交聯(lián)性好且交聯(lián)產(chǎn)物性質(zhì)穩(wěn)定，并可保持蛋白質(zhì)的精細(xì)結(jié)構(gòu)，對(duì)酶的活性影響小，固定的蛋白質(zhì)染色性能好等特點(diǎn)。再通過配基蛋白與目標(biāo)蛋白之間的特異性結(jié)合，進(jìn)行目標(biāo)蛋白的分離。相較于其他分離手段，磁分離純化蛋白質(zhì)技術(shù)具有如下優(yōu)勢(shì):操作緩和，能確保蛋白質(zhì)結(jié)果的完整性，可以從蛋白質(zhì)含量較低的樣品中迅速富集濃縮，獲得較高濃度的提純樣品，純化步驟簡(jiǎn)單，甚至可以集細(xì)胞裂解與蛋白質(zhì)分離于一步完成。磁性二氧化硅復(fù)合微球具有抗酸堿腐蝕、抗壓、無毒、穩(wěn)定性好，可重復(fù)利用等優(yōu)點(diǎn)。
[0003]對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的文獻(xiàn)進(jìn)行檢索發(fā)現(xiàn)，研究磁性分離蛋白的文獻(xiàn)專利很多。中國(guó)專利200410057258.1申請(qǐng)了一種生物多糖高分子磁性微球及其制備方法，中國(guó)專利200510116850.9申請(qǐng)了一種復(fù)合生物多糖磁性微球制備方法，上述方法制備的微球抗壓和抗腐蝕性能都較差；中國(guó)專利200610147250.3申請(qǐng)了表面固定有蛋白酶的帶氨基的納米磁性微球及其制備方法和應(yīng)用，中國(guó)專利200710047399.9申請(qǐng)了帶有表面官能團(tuán)的磁性微球的制備方法，上述方法直接在磁性微球表面氨基化后應(yīng)用，磁芯四氧化三鐵極易被腐蝕。本發(fā)明克服了這些缺點(diǎn)，而且粒徑小，相同質(zhì)量微球比表面積大大增加，增加分離效率，而且磁芯不易被腐蝕，可回收利用，利于工業(yè)化。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的缺陷，制備出磁性微球粒徑小，單分散性好，帶有氨基的復(fù)合微球比表面積大的磁性二氧化硅復(fù)合微球。利用親核加成反應(yīng)，接入交聯(lián)臂戊二醛后，可以接入多種配基蛋白，從而可以分離多種目標(biāo)蛋白。[0005]本發(fā)明的技術(shù)方案如下:
[0006]一種磁性二氧化硅復(fù)合微球，包括超順磁性四氧化三鐵納米粒子，其特征在于:超順磁性四氧化三鐵納米粒子直徑為4-30nm，超順磁性四氧化三鐵納米粒子外表面包覆有殼厚5-20nm的二氧化娃外殼,所述二氧化娃外殼表面進(jìn)行氨基化修飾,用戍二醒作為交聯(lián)臂，再接入配基蛋白。
[0007]一種磁性二氧化硅復(fù)合微球的制備方法，該方法包含下面的步驟:
[0008]( I)四氧化三鐵前驅(qū)體的制備；
[0009](2)利用反相微乳液法制備二氧化硅包覆的四氧化三鐵磁性微球；
[0010](3)磁性微球表面降低非特異性吸附的處理；
[0011](4)接入配基蛋白。
[0012]所述步驟(I)具體分為兩步:
[0013]第一步，將氯化鐵和油酸鈉以摩爾比為1:1?1:5溶于水、乙醇和正己烷混合溶液中，其中水、乙醇和正己烷體積比為3?4:4:7，在常溫氮?dú)猸h(huán)境下磁力攪拌，并加熱至50?80°C，冷凝回流3?6h ;待溶液冷卻至室溫，利用分液漏斗分離上層有機(jī)相，并用去離子水洗滌干燥，得到棕褐色蠟狀固體，即得到油酸鐵前驅(qū)體；
[0014]第二步，將第一步制備的油酸鐵前驅(qū)體溶于十八烯中，加入油酸，其中油酸與十八烯的摩爾比為1:1?5:1，以加熱速率2?10°C /min加熱至300?380°C，冷凝回流一定時(shí)間30?60min至溶液中發(fā)生強(qiáng)烈反應(yīng)，待溶液變渾濁，呈黑褐色，關(guān)閉反應(yīng)器，直至溶液冷卻至室溫，加入過量乙醇沉淀Fe304納米粒子，離心分離；
[0015]沉淀一再分散操作:將上清液倒出，將納米粒子溶于正己烷中，再加入過量乙醇沉淀出Fe304納米粒子，離心分離；
[0016]重復(fù)上述沉淀一再分散操作，洗滌4?5次，得到疏水Fe304納米粒子。
[0017]所述步驟(2)具體分為三步:第一步，將6.8?20g的表面活性劑分散在200?600ml的環(huán)己烷中，超聲；
[0018]第二步，將40?120mg疏水Fe304納米粒子加入到上述溶液中，持續(xù)攪拌，加入
0.5?1.5ml濃度為25%-28%氨水到混合溶液中；
[0019]第三步，用衡壓滴液方式將0.5?1.5mlTE0S分次滴入上述混合溶液中，攪拌反應(yīng)8?24h，離心洗滌后獲得Fe304@Si02復(fù)合微球，將Fe304@Si02復(fù)合微球再分散于乙醇中。
[0020]所述步驟(3)具體分為兩步:
[0021]第一步，將0.0lg的Fe304@Si02復(fù)合微球溶于50ml的乙醇溶液中，加入25ml體積分?jǐn)?shù)為5%或lmol/L的APTES (3-氨丙基三乙氧基硅烷)，機(jī)械攪拌反應(yīng)12?100h，反應(yīng)后加熱至25?100°C，冷凝回流一定時(shí)間0.5?10h，用乙醇清洗，真空干燥。
[0022]第二步，將上述微球溶于乙醇中，再將此溶液溶于PBS緩沖溶液中，其中乙醇與PBS緩沖溶液體積比1:1?10:1，加入戊二醛(25%，v/v)，乙醇與PBS體積比范圍(I:1?100:1 )，常溫機(jī)械攪拌一段時(shí)間4?20h，洗滌后將其分散于O?2000mlPBS緩沖溶液中，最后接入交聯(lián)臂戊二醛。
[0023]所述步驟(4)具體為:一定量的上述帶有醛基的復(fù)合微球溶于一定量的PBS緩沖溶液中，孵化一定濃度(O?lmg/mL)的牛血清蛋白(BSA)溶液，時(shí)間(O?10h)。
[0024]所述的表面活性劑為長(zhǎng)烷烴鏈類溶劑。[0025]所述的磁性二氧化硅復(fù)合微球與目標(biāo)蛋白特異性結(jié)合，進(jìn)行蛋白分離的應(yīng)用。
[0026]本發(fā)明的有益效果是:本發(fā)明利用高溫?zé)峤夥椒ㄖ苽涑槾判运难趸F納米粒子(4?30nm)，在磁性納米粒子外表面，利用反相微乳液法包覆二氧化硅外殼(殼厚5?20nm),對(duì)二氧化硅表面進(jìn)行氨基化修飾，用戊二醛作為交聯(lián)臂，再接入配基蛋白，利用配基蛋白與目標(biāo)蛋白的特異性結(jié)合，進(jìn)行蛋白分離。本發(fā)明所制備的磁性微球粒徑小，單分散性好，帶有氨基的復(fù)合微球比表面積大，利用親核加成反應(yīng)，接入交聯(lián)臂戊二醛后，可以接入多種配基蛋白，從而可以分離多種目標(biāo)蛋白，十分適合生物樣品中蛋白的快速分離及應(yīng)用，在生物醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景和巨大的應(yīng)用價(jià)值。
[0027]( I)本發(fā)明所制備的磁性微球粒徑小，單分散性好，帶有氨基的復(fù)合微球比表面積大；
[0028](2)此磁性二氧化硅復(fù)合微球的交聯(lián)臂含有醛基，通過親核加成反應(yīng)與配基蛋白結(jié)合，戊二醛與蛋白反應(yīng)具有活性高、反應(yīng)快、結(jié)合量高、交聯(lián)性好且交聯(lián)產(chǎn)物性質(zhì)穩(wěn)定，并可保持蛋白質(zhì)的精細(xì)結(jié)構(gòu)，對(duì)酶的活性影響小，固定的蛋白質(zhì)染色性能好等特點(diǎn)；
[0029](3)通過配基蛋白與目標(biāo)蛋白之間的特異性結(jié)合，進(jìn)行目標(biāo)蛋白的分離，相較于其他分離手段，磁分離純化蛋白質(zhì)技術(shù)具有如下優(yōu)勢(shì):操作緩和，能確保蛋白質(zhì)結(jié)果的完整性，可以從蛋白質(zhì)含量較低的樣品中迅速富集濃縮，獲得較高濃度的提純樣品，純化步驟簡(jiǎn)單，甚至可以集細(xì)胞裂解與蛋白質(zhì)分離于一步完成；
[0030](4)磁性二氧化硅復(fù)合微球具有抗酸堿腐蝕、抗壓、無毒、穩(wěn)定性好，可重復(fù)利用等優(yōu)點(diǎn)。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0031]圖1為利用油酸鐵前驅(qū)體高溫?zé)峤庵苽銯e304納米粒子透射電鏡圖
[0032]圖2為利用反相微乳液法制備Fe304@Si02微球透射電鏡圖
【具體實(shí)施方式】
[0033]以下通過【具體實(shí)施方式】對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行進(jìn)一步的說明和描述。
[0034]實(shí)施例一
[0035]一、Fe3O4納米粒子的制備
[0036]1.油酸鐵前驅(qū)體的制備
[0037]2.7gFeCl3.6H20溶于水、乙醇和正己烷混合溶液中，體積為70mL，再加入8.875g油酸鈉，常溫氮?dú)猸h(huán)境下磁力攪拌，加熱至70°C，冷凝回流4h。反應(yīng)完成后，關(guān)閉儀器，待溶液冷卻至室溫，利用分液漏斗分離，上層有機(jī)相中包含油酸鐵的混合物，將上層有機(jī)相用去離子水洗滌，真空干燥，除去溶劑正己烷，得到棕褐色蠟狀固體即油酸鐵前驅(qū)體。
[0038]2.利用油酸鐵前驅(qū)體高溫?zé)峤庵苽銯e3O4納米粒子
[0039]將Ig油酸鐵前驅(qū)體溶于5.56mL十八烯中，加入0.16mL的油酸，磁力攪拌，以
3.30C /min的加熱速率加熱至320°C，冷凝回流30min。溶液中發(fā)生強(qiáng)烈反應(yīng)，溶液逐漸變渾濁，至黑褐色，即合成了四氧化三鐵納米粒子。關(guān)閉反應(yīng)器至溶液冷卻至室溫，加入過量乙醇沉淀Fe3O4納米粒子，離心分離。將上清液輕輕倒出，將納米粒子溶于正己烷中，再加入過量乙醇沉淀出Fe3O4納米粒子，再離心分離。重復(fù)上述沉淀一再分散操作，洗滌4?5次，即可得到疏水Fe3O4納米粒子。
[0040]二、利用反相微乳液法制備Fe3O4OSiO2微球
[0041]6.8g的表面活性劑分散在200mL的環(huán)己烷中，超聲lOmin。將40mgFe304納米粒子溶于IOmL環(huán)己烷中，加入到上述溶液中，持續(xù)攪拌，加入0.5mL氨水(25%_28%)，用衡壓滴液方式將0.5mLTE0S分8次滴入上述混合溶液中，攪拌反應(yīng)16h。離心洗滌后獲得Fe3O4OSiO2核殼納米顆粒，將Fe3O4OSiO2核殼納米顆粒分散于乙醇中保存。
[0042]三、降低磁球表面非特異性吸附的處理，即進(jìn)行表面氨基化，再接入交聯(lián)臂戊二醛
[0043]1.0.0lg的Fe3O4OSiO2復(fù)合微球溶于50mL乙醇溶劑中，加入25uL的APTES (3_氨丙基三乙氧基硅烷)，機(jī)械攪拌反應(yīng)72h，加熱至70V，回流lh，用乙醇清洗，利用激光粒度儀測(cè)表面電位+2.17mV。
[0044]2.將上述微球溶液溶于20mL的PBS (0.0lM, Ph=7.4)緩沖溶液中，加入35uL戊二醛(25%，v/v)，常溫機(jī)械攪拌8h，洗滌后將其分散4.3mLPBS (0.2M，pH=6)的緩沖溶液中。利用激光粒度儀測(cè)表面電位-2.28mV。
[0045]四、接入配基蛋白
[0046]配置初始濃度為0.25mg/mL的牛血清蛋白(BSA)溶液，IOmg上述帶有醛基的復(fù)合微球溶于5mLPBS (0.0lM, pH=7.4)緩沖溶液，取25mLBSA溶液放入磁球溶液中孵化3h，溫度為30°C。測(cè)得剩余溶液中蛋白的吸光度0.1129，通過標(biāo)準(zhǔn)蛋白吸光度曲線可以得知，剩余BSA溶液濃度0.125109mg/mL，通過間接法計(jì)算:
[0047]0.25mg/mL*25mL-0.125109mg/mL*30mL=2.49673mg
[0048]得知磁性復(fù)合微球接入配基蛋白的量為2.49673mg/10mg磁性微球。
[0049]此帶有醛基的復(fù)合磁性微球可以接多種配基蛋白，再利用此帶有配基蛋白的磁性微球進(jìn)行多種目標(biāo)蛋白的分離。
[0050]實(shí)施例二
[0051]一、Fe3O4納米粒子的制備
[0052]1.油酸鐵前驅(qū)體的制備
[0053]2.7gFeCl3.6H20溶于水、乙醇和正己烷混合溶液中，體積為70mL，再加入8.875g油酸鈉，常溫氮?dú)猸h(huán)境下磁力攪拌，加熱至50°C，冷凝回流6h。反應(yīng)完成后，關(guān)閉儀器，待溶液冷卻至室溫，利用分液漏斗分離，上層有機(jī)相中包含油酸鐵的混合物，將上層有機(jī)相用去離子水洗滌，真空干燥，除去溶劑正己烷，得到棕褐色蠟狀固體即油酸鐵前驅(qū)體。
[0054]2.利用油酸鐵前驅(qū)體高溫?zé)峤庵苽銯e3O4納米粒子
[0055]將Ig油酸鐵前驅(qū)體溶于5mL十八烯中，加入0.15mL的油酸，磁力攪拌，以2V /min的加熱速率加熱至330°C，冷凝回流50min。溶液中發(fā)生強(qiáng)烈反應(yīng)，溶液逐漸變渾濁，至黑褐色，即合成了四氧化三鐵納米粒子。關(guān)閉反應(yīng)器至溶液冷卻至室溫，加入過量乙醇沉淀Fe3O4納米粒子，離心分離。將上清液輕輕倒出，將納米粒子溶于正己烷中，再加入過量乙醇沉淀出Fe3O4納米粒子，再離心分離。重復(fù)上述沉淀一再分散操作，洗滌4?5次，即可得到疏水Fe3O4納米粒子。
[0056]二、利用反相微乳液法制備Fe3O4OSiO2微球
[0057]13.6g的表面活性劑分散在400mL的環(huán)己烷中，超聲lOmin。將80mgFe304納米粒子溶于ImL環(huán)己烷中，加入到上述溶液中，持續(xù)攪拌，加入ImL氨水(25%_28%)，用衡壓滴液方式將0.5mLTE0S分8次滴入上述混合溶液中，攪拌反應(yīng)16h。離心洗滌后獲得Fe3O4OSiO2核殼納米顆粒，將Fe3O4OSiO2核殼納米顆粒分散于乙醇中保存。如圖2。
[0058]三、降低磁球表面非特異性吸附的處理，即進(jìn)行表面氨基化，再接入交聯(lián)臂戊二醛
[0059]1.0.0lg的Fe3O4OSiO2復(fù)合微球溶于50mL乙醇溶劑中，加入25uL的APTES (3_氨丙基三乙氧基硅烷)，機(jī)械攪拌反應(yīng)72h，加熱至70°C，回流lh，用乙醇清洗，利用激光粒度儀測(cè)表面電位+2.17mV。
[0060]2.將上述微球溶液溶于20mL的PBS (0.01M, Ph=7.4)緩沖溶液中，加入35uL戊二醛(25%，v/v)，常溫機(jī)械攪拌8h，洗滌后將其分散4.3mLPBS (0.2M，pH=6)的緩沖溶液中。利用激光粒度儀測(cè)表面電位-2.28mV。
[0061]四、接入配基蛋白如實(shí)施例一。
[0062]實(shí)施例三
[0063]一、Fe3O4納米粒子的制備
[0064]1.油酸鐵前驅(qū)體的制備
[0065]2.7gFeCl3.6H20溶于水、乙醇和正己烷混合溶液中，體積為70mL，再加入8.875g油酸鈉，常溫氮?dú)猸h(huán)境下磁力攪拌，加熱至80°C，冷凝回流3h。反應(yīng)完成后，關(guān)閉儀器，待溶液冷卻至室溫，利用分液漏斗分離，上層有機(jī)相中包含油酸鐵的混合物，將上層有機(jī)相用去離子水洗滌，真空干燥，除去溶劑正己烷，得到棕褐色蠟狀固體即油酸鐵前驅(qū)體。
[0066]2.利用油酸鐵前驅(qū)體高溫?zé)峤庵苽銯e3O4納米粒子
[0067]將Ig油酸鐵前驅(qū)體溶于6mL十八烯中，加入0.18mL的油酸，磁力攪拌，以10°C /min的加熱速率加熱至340°C，冷凝回流60min。溶液中發(fā)生強(qiáng)烈反應(yīng)，溶液逐漸變渾濁，至黑褐色，即合成了四氧化三鐵納米粒子。關(guān)閉反應(yīng)器至溶液冷卻至室溫，加入過量乙醇沉淀Fe3O4納米粒子，離心分離。將上清液輕輕倒出，將納米粒子溶于正己烷中，再加入過量乙醇沉淀出Fe3O4納米粒子，再離心分離。重復(fù)上述沉淀一再分散操作，洗滌4?5次，即可得到疏水Fe3O4納米粒子。
[0068]二、利用反相微乳液法制備Fe3O4OSiO2微球
[0069]20g的表面活性劑分散在600mL的環(huán)己烷中，超聲lOmin。將120mgFe304納米粒子溶于1.5mL環(huán)己烷中，加入到上述溶液中，持續(xù)攪拌，加入1.5mL氨水(25%_28%)，用衡壓滴液方式將0.5mLTE0S分8次滴入上述混合溶液中，攪拌反應(yīng)16h。離心洗滌后獲得Fe3O4OSiO2核殼納米顆粒，將Fe3O4OSiO2核殼納米顆粒分散于乙醇中保存。
[0070]三、降低磁球表面非特異性吸附的處理，即進(jìn)行表面氨基化，再接入交聯(lián)臂戊二醛
[0071]1.0.0lg的Fe3O4OSiO2復(fù)合微球溶于50mL乙醇溶劑中，加入25uL的APTES (3_氨丙基三乙氧基硅烷)，機(jī)械攪拌反應(yīng)72h，加熱至70V，回流lh，用乙醇清洗，利用激光粒度儀測(cè)表面電位+2.17mV。
[0072]2.將上述微球溶液溶于20mL的PBS (0.0lM, Ph=7.4)緩沖溶液中，加入35uL戊二醛(25%，v/v)，常溫機(jī)械攪拌8h，洗滌后將其分散4.3mLPBS (0.2M，pH=6)的緩沖溶液中。利用激光粒度儀測(cè)表面電位-2.28mV。
[0073]四、接入配基蛋白如實(shí)施例一。
[0074]雖然已經(jīng)關(guān)于其優(yōu)選的實(shí)施例具體示出和描述了本發(fā)明，但本領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解對(duì)形式和細(xì)節(jié)可以做出上述和其它的改變而不脫離本發(fā)明的精神和范圍。因此旨在本發(fā)明不局限于描述和示例的精確形式以及細(xì)節(jié)，而是落入所附權(quán)利要求的范圍內(nèi)。
【權(quán)利要求】
1.一種磁性二氧化硅復(fù)合微球，包括超順磁性四氧化三鐵納米粒子，其特征在于:超順磁性四氧化三鐵納米粒子直徑為4-30nm，超順磁性四氧化三鐵納米粒子外表面包覆有殼厚5-20nm的二氧化娃外殼,所述二氧化娃外殼表面進(jìn)行氨基化修飾,用戍二醒作為交聯(lián)臂，再接入配基蛋白。
2.一種磁性二氧化 硅復(fù)合微球的制備方法，該方法包含下面的步驟: (1)四氧化三鐵前驅(qū)體的制備； (2)利用反相微乳液法制備二氧化硅包覆的四氧化三鐵磁性微球； (3)磁性微球表面降低非特異性吸附的處理； (4)接入配基蛋白。
3.權(quán)利要求2所述的制備方法，其特征在于:所述步驟(1)具體分為兩步: 第一步，將氯化鐵和油酸鈉以摩爾比為1:1~1:5溶于水、乙醇和正己烷混合溶液中，其中水、乙醇和正己烷體積比為3~4:4:7，在常溫氮?dú)猸h(huán)境下磁力攪拌，并加熱至50~80°C，冷凝回流3~6h ;待溶液冷卻至室溫，利用分液漏斗分離上層有機(jī)相，并用去離子水洗滌干燥，得到棕褐色蠟狀固體，即得到油酸鐵前驅(qū)體； 第二步，將第一步制備的油酸鐵前驅(qū)體溶于十八烯中，加入油酸，其中油酸與十八烯的摩爾比為1:1~5:1，以加熱速率2~10°C /min加熱至300~380°C，冷凝回流一定時(shí)間30~60min至溶液中發(fā)生強(qiáng)烈反應(yīng)，待溶液變渾濁，呈黑褐色，關(guān)閉反應(yīng)器，直至溶液冷卻至室溫，加入過量乙醇沉淀Fe304納米粒子，離心分離； 沉淀一再分散操作:將上清液倒出，將納米粒子溶于正己烷中，再加入過量乙醇沉淀出Fe304納米粒子，離心分離； 重復(fù)上述沉淀一再分散操作，洗滌4~5次，得到疏水Fe304納米粒子。
4.權(quán)利要求3所述的制備方法，其特征在于:所述步驟(2)具體分為三步: 第一步，將6.8~20g的表面活性劑分散在200~600ml的環(huán)己烷中，超聲； 第二步，將40~120mg疏水Fe304納米粒子加入到上述溶液中，持續(xù)攪拌，加入0.5~1.5ml濃度為25%-28%氨水到混合溶液中； 第三步，用衡壓滴液方式將0.5~1.5mlTEOS分次滴入上述混合溶液中，攪拌反應(yīng)8~24h，離心洗滌后獲得Fe304@Si02復(fù)合微球，將Fe304@Si02復(fù)合微球再分散于乙醇中。
5.權(quán)利要求2所述的制備方法，其特征在于:所述步驟(3)具體分為兩步: 第一步，將0.01g的Fe304@Si02復(fù)合微球溶于50ml的乙醇溶液中，加入25ml體積分?jǐn)?shù)為5%或lmol/L的APTES (3-氨丙基三乙氧基硅烷)，機(jī)械攪拌反應(yīng)12~100h，反應(yīng)后加熱至25~100°C，冷凝回流一定時(shí)間0.5~10h，用乙醇清洗，真空干燥。 第二步，將上述微球溶于乙醇中，再將此溶液溶于PBS緩沖溶液中，其中乙醇與PBS緩沖溶液體積比1:1~10: 1，加入戊二醛(25%，v/v)，乙醇與PBS體積比范圍(1:1~100:1)，常溫機(jī)械攪拌一段時(shí)間4~20h，洗滌后將其分散于O~2000mlPBS緩沖溶液中，最后接入交聯(lián)臂戊二醛。
6.權(quán)利要求2所述的制備方法，其特征在于:所述步驟(4)具體為:一定量的上述帶有醛基的復(fù)合微球溶于一定量的PBS緩沖溶液中，孵化一定濃度(O~lmg/mL)的牛血清蛋白(BSA)溶液，時(shí)間(O~10h)。
7.權(quán)利要求4所述的制備方法，其特征在于:所述的表面活性劑為長(zhǎng)烷烴鏈類溶劑。
8.權(quán)利要求1所述的 磁性二氧化硅復(fù)合微球與目標(biāo)蛋白特異性結(jié)合，進(jìn)行蛋白分離的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】H01F1/42GK103903827SQ201410105086
【公開日】2014年7月2日 申請(qǐng)日期:2014年3月20日 優(yōu)先權(quán)日:2014年3月20日
【發(fā)明者】趙九蓬, 趙長(zhǎng)杰 申請(qǐng)人:哈爾濱益材新材料有限公司