一種檢測堿性磷酸酶的方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種檢測堿性磷酸酶的方法，利用堿性磷酸酶ALP還原抗壞血酸磷酸酯AAP生成抗壞血酸AA，然后抗壞血酸使Cu2+還原成Cu+，Cu+可以抑制辣根過氧化物酶的活性，從而不能使TMB?H2O2溶液變色，實現(xiàn)了ALP的檢測。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明利用比色法進(jìn)行ALP的定量檢測，靈敏度高，檢測限低，而且準(zhǔn)確度高。
【專利說明】
一種檢測堿性磷酸酶的方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001]本發(fā)明屬于光化學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種檢測堿性磷酸酶的方法，構(gòu)建Cu2+和HRP-TMB-H202比色體系實現(xiàn)對堿性磷酸酶的靈敏檢測。
【背景技術(shù)】
[0002]近年來，人類的健康狀況越來越受到關(guān)注，堿性磷酸酶(ALP)作為一個典型的磷酸單酯酶是人類多種疾病的重要生物標(biāo)志物之一，它能將多種多樣的催化水解并且轉(zhuǎn)磷酸，包括一些生物大分子和小分子。因此，堿性磷酸酶在細(xì)胞周期、生長、凋亡的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和細(xì)胞內(nèi)的調(diào)節(jié)過程起著關(guān)鍵性的作用。人體中的ALP水平的異常是多種疾病的信號，尤其是涉及到肝和骨血清中的ALP活性是經(jīng)常作為一些疾病的診斷指標(biāo)，包括骨骼疾病(骨腫瘤，佩吉特病，骨軟化癥)、肝臟疾病(癌癥，肝炎，阻塞性黃疸)等。盡管對ALP的研究較為廣泛，但其不同的生理和病理功能尚未完全闡明。近日，ALP對腸道內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)的維持和保護(hù)作用也開始顯露出來。因此，對各種生物系統(tǒng)的動態(tài)ALP活性做進(jìn)一步研究是非常有必要的。
[0003]考慮到它們的重要性，近年來不同的方法已被用于檢測生物體內(nèi)ALP濃度。就ALP而言，有熒光，電化學(xué)，化學(xué)發(fā)光和表面增強(qiáng)共振拉曼散射等研究手段。盡管這些方法中的某些具有較高靈敏度，但它們大多數(shù)不能實時監(jiān)測酶活性。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的在于提供一種檢測堿性磷酸酶的方法，構(gòu)建Cu2+和HRP-TMB-H2O2比色體系實現(xiàn)對堿性磷酸酶的靈敏檢測。本發(fā)明利用堿性磷酸酶ALP還原抗壞血酸磷酸酯AAP生成抗壞血酸AA，然后抗壞血酸使Cu2+還原成Cu+，Cu+可以抑制辣根過氧化物酶的活性，從而不能使TMB-H2O2溶液變色，實現(xiàn)了 ALP的檢測。
[0005]本發(fā)明提供的一種檢測堿性磷酸酶的方法，包括以下步驟:
[0006]a、將抗壞血酸磷酸酯AAP溶液和一系列濃度梯度的堿性磷酸酶ALP溶液混合在PBS緩沖溶液中，然后加入CuSO4溶液，反應(yīng)，得到混合溶液；
[0007]b、分別在步驟a制備的混合溶液中加入HRP溶液，室溫下反應(yīng)后，加入TMB-H2O2顯色溶液，分別檢測其吸光度，構(gòu)建堿性磷酸酶ALP溶液濃度與吸光度的線性關(guān)系；
[0008]c、利用線性關(guān)系，得到待檢測堿性磷酸酶ALP溶液濃度。
[0009]進(jìn)一步的，步驟a中所述一系列濃度梯度的堿性磷酸酶ALP溶液的濃度為:OmU/mL，1mU/mL,2OmU/mL,40mU/mL,60mU/mL,80mU/mL, 10mU/mL和120mU/mL。
[0010]步驟a中，PBS緩沖溶液的pH為5-9;優(yōu)選的為pH=7.4。
[0011]進(jìn)一步的，步驟a中所述反應(yīng)，具體為在20-25°C下，ALP和AAP反應(yīng)時間5_90min。
[0012]進(jìn)一步的，步驟a具體為:
[0013]將1yLlmg/mL的抗壞血酸磷酸酯AAP溶液和15yL—系列濃度梯度的堿性磷酸酶ALP溶液混合在10mL pH= 7.4的I3BS緩沖溶液中，濃度梯度分別為OmU/mL，I OmU/mL，20mU/mL，40mU/mL，60mU/mL，80mU/mL，100mU/mUP120mU/mL，然后分別加入1yL，100yg/mL CuSO4溶液，在室溫下反應(yīng)40min ；
[0014]步驟b具體為:分別在上述步驟a所得混合溶液中加入50yL 10ng/mL的HRP溶液室溫下反應(yīng)20min后，最后加入10yL 8.3mM的TMB-H2O2顯色溶液，分別檢測其吸光度，構(gòu)建堿性磷酸酶ALP溶液濃度與吸光度的線性關(guān)系。
[0015]步驟a之前，將購買的堿性磷酸酶ALP和抗壞血酸AAP用二次水溶解，分別配成
0.lU/mL的堿性磷酸酶ALP溶液和lmg/mL抗壞血酸磷酸酯AAP溶液，然后分別配制100yg/mLC11SO4溶液、10ng/mL HRP和8.3mM TMB-H2O2溶液，并在4°C下保存?zhèn)溆谩?br>[0016]本發(fā)明基于Cu+可以抑制HRP的活性，從而使TMB-H2O2溶液顏色產(chǎn)生變化，構(gòu)建比色體系。在檢測ALP的溶液中，溶液顏色不變藍(lán)，隨著顏色的逐步變淡，吸光度逐漸減小;基于Cu2+和HRP比色體系成功實現(xiàn)對ALP的檢測。由于顏色的深淺和ALP的濃度相關(guān)，隨著ALP的濃度增加，顏色逐漸變淺直至無色，因此該比色體系可以對不同濃度的ALP進(jìn)行定量檢測。
[0017]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明利用比色法進(jìn)行ALP的定量檢測，靈敏度高，檢測限低，而且準(zhǔn)確度高，檢測限是0.9966。
【附圖說明】
[0018]圖1為基于Cu2+和辣根過氧化物酶HRP制備比色體系比色法檢測堿性磷酸酶ALP的實驗原理圖；
[0019]圖2為檢測ALP的可行性分析圖;ALP存在和不存在兩種情況下的紫外光譜圖，其中a為存在ALP，13為不存在ALP ；
[0020]圖3A為pH對本實驗的影響圖；控制整個體系的pH，pH分別為5,6,7.4,8和9；
[0021 ]圖3B為反應(yīng)時間對本實驗的影響圖；控制AAP和ALP的反應(yīng)時間，反應(yīng)時間分別為5min,1min,20min,40min,60min和90min；
[0022]圖3C為反應(yīng)溫度對本實驗的影響圖；控制AAP和ALP的反應(yīng)溫度，分別控制在20°C，25°C，30Γ，37°C，40Γ，45°C 和50Γ ；
[0023 ]圖 4A為ALP溶液的濃度為OmU/mL, I OmU/mL, 20mU/mL, 40mU/mL, 60mU/mL, 8OmU/mL,lOOmU/mL和120mU/mL的ALP的紫外光譜圖；
[0024]圖4B為ALP的線性關(guān)系圖；
[0025]圖5為比色體系對Hemoglobin, thrombin, Iysozyme和ALP四種蛋白質(zhì)的選擇性對比圖；
【具體實施方式】
[0026]實施例1
[0027]—種檢測堿性磷酸酶的方法，包括以下步驟:
[0028]將購買的堿性磷酸酶ALP和抗壞血酸AAP用二次水溶解，分別配成0.lU/mL的堿性磷酸酶ALP溶液和lmg/mL抗壞血酸磷酸酯AAP溶液，然后分別配制100yg/mL CuSO4溶液、10ng/mL HRP和8.3mM TMB-H2O2溶液，并在4°C下保存?zhèn)溆谩?br>[0029]a、將1yL lmg/mL的抗壞血酸磷酸酯AAP溶液和15yL—系列濃度梯度的堿性磷酸酶ALP溶液混合在10mL PBS緩沖溶液(pH= 7.4)中，濃度梯度分別為OmU/mL，10mU/mL，20mU/mL，40mU/mL，60mU/mL，80mU/mL，100mU/mUP120mU/mL，然后分別加入 I OyL，100yg/mLCuS04溶液，在室溫下反應(yīng)40min ；
[0030]b、分別在上述步驟a所得混合溶液中加入50yL 10ng/mL的HRP溶液室溫下反應(yīng)20min后，最后加入10yL 8.3mM的TMB-H2O2顯色溶液，分別檢測其吸光度，構(gòu)建堿性磷酸酶ALP溶液濃度與吸光度的線性關(guān)系。如圖4A、4B所述。
[0031 ] c、利用線性關(guān)系，得到待檢測堿性磷酸酶ALP溶液濃度。
[0032]實施例2
[0033]一種檢測堿性磷酸酶的方法，PBS緩沖溶液的pH分別為5,6,7.4,8和9，其他與實施例I操作相同，結(jié)果如圖3A所示。實施例3
[0034]一種檢測堿性磷酸酶的方法，步驟a中反應(yīng)時間為5min , 1min , 20min , 40min ,60min和90min，其他與實施例1操作相同，結(jié)果如圖3B所示。
[0035]實施例4
[0036]一種檢測堿性磷酸酶的方法，步驟a中反應(yīng)溫度為20°C，25°C，30°C，37°C，40°C ,45°(:和50°(:，其他與實施例1操作相同，結(jié)果如圖3C所示。
[0037]實施例5選擇性實驗
[0038]將4組1yL,lmg/mL的AAP分別加入 120mU/mL ALP , ΙμΜ thrombin, ΙΟμΜHemoglobin,和8kU/mL(29mM) lysozyme在37°C 下反應(yīng)40min后，分別加入50yL, 10ng/mL的HRP反應(yīng)20min，最后加入10yL，8.3mM的TMB，觀察溶液的顏色；另做一組空白實驗，不加ALP，操作與上述相同。
[0039]吸光度結(jié)果如圖5所示，可見該方法對ALP的檢測的選擇性較高。
【主權(quán)項】
1.一種檢測堿性磷酸酶的方法，其特征在于，所述檢測堿性磷酸酶的方法包括以下步驟: a、將抗壞血酸磷酸酯AAP溶液和一系列濃度梯度的堿性磷酸酶ALP溶液混合在PBS緩沖溶液中，然后加入CuSO4溶液，反應(yīng)，得到混合溶液； b、分別在步驟a制備的混合溶液中加入HRP溶液，室溫下反應(yīng)后，加入TMB-H2O2顯色溶液，分別檢測其吸光度，構(gòu)建堿性磷酸酶ALP溶液濃度與吸光度的線性關(guān)系； c、利用線性關(guān)系，得到待檢測堿性磷酸酶ALP溶液濃度。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測堿性磷酸酶的方法，其特征在于，步驟a中所述一系列濃度梯度的喊性磷酸酶ALP溶液的濃度為:OmU/mL, 10mU/mL, 20mU/mL, 40mU/mL, 60mU/mL,80mU/mL，10mU/mL和120mU/mL。3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的檢測堿性磷酸酶的方法，其特征在于，步驟a中，PBS緩沖溶液的pH為5-9。4.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的檢測堿性磷酸酶的方法，其特征在于，步驟a中所述反應(yīng)，具體為在20-25 °C下，ALP和AAP反應(yīng)時間5_90min。5.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的檢測堿性磷酸酶的方法，其特征在于，步驟a具體為:將10μL lmg/mL的抗壞血酸磷酸酯AAP溶液和15yL—系列濃度梯度的堿性磷酸酶ALP溶液混合在10mL pH= 7.4 的 PBS 緩沖溶液中，濃度梯度分別為 OmU/mL，I OmU/mL，20mU/mL，40mU/mL，60mU/mL，80mU/mL, lOOmU/mL和 120mU/mL，然后分別加入1yL, 100yg/mL C11SO4溶液，在室溫下反應(yīng)40mino6.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的檢測堿性磷酸酶的方法，其特征在于，步驟b具體為:分別在上述步驟a所得混合溶液中加入50yL 10ng/mL的HRP溶液室溫下反應(yīng)20min后，最后加入10yL 8.3mM的TMB-H2O2顯色溶液，分別檢測其吸光度，構(gòu)建堿性磷酸酶ALP溶液濃度與吸光度的線性關(guān)系。
【文檔編號】G01N21/78GK106066325SQ201610352426
【公開日】2016年11月2日
【申請日】2016年5月25日 公開號201610352426.2, CN 106066325 A, CN 106066325A, CN 201610352426, CN-A-106066325, CN106066325 A, CN106066325A, CN201610352426, CN201610352426.2
【發(fā)明人】王廣鳳, 史東敏, 孫悅
【申請人】安徽師范大學(xué)