一種動(dòng)物組織中辛硫磷殘留量的檢測方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種動(dòng)物組織中辛硫磷殘留量的檢測方法，包括以下步驟：(1)待測樣本先由經(jīng)二氯甲烷洗脫，37℃氮?dú)獯蹈珊蟮玫教崛∥铮?2)將提取物溶于甲醇，再用0.45μm有機(jī)濾膜過濾得到提取物溶液；(3)以甲醇?水溶液作為流動(dòng)相，利用高效液相色譜法進(jìn)行檢測，確定動(dòng)物組織辛硫磷的殘留量；待測樣與現(xiàn)有技術(shù)中檢測蔬菜水果辛硫磷殘留量的方法相比，本發(fā)明采用高效液相色譜的方法，具有取樣量少，檢測時(shí)間短，操作簡便等優(yōu)點(diǎn)；本發(fā)明的檢測結(jié)果準(zhǔn)確，辛硫磷檢測限為0.01mg/L，能夠滿足一般化學(xué)農(nóng)藥藥物殘留定量的要求。
【專利說明】
一種動(dòng)物組織中辛硫磷殘留量的檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001]本發(fā)明涉及一種農(nóng)藥殘留量的檢測方法，具體涉及一種動(dòng)物組織中辛硫磷殘留量的檢測方法。
【背景技術(shù)】
[0002]我國是一個(gè)農(nóng)業(yè)大國，藥劑防治在防控糧食作物重大病蟲害的過程中發(fā)揮了重要作用。農(nóng)藥施用后絕大部分在自然環(huán)境中代謝、降解和迀移，但農(nóng)藥使用不當(dāng)既可造成環(huán)境污染，也可引起農(nóng)作物上的農(nóng)藥殘留，并通過食物鏈蓄積和傳遞作用進(jìn)入畜禽機(jī)體，從而導(dǎo)致畜禽產(chǎn)品農(nóng)藥殘留，危害人類自身健康，造成一系列連續(xù)的不良后果。因而農(nóng)藥殘留不僅影響到我國畜禽產(chǎn)品質(zhì)量安全水平和出口貿(mào)易，更重要的是對人體健康帶來了直接或間接的危害。目前，雖然我國已有了一套相對完善的食品衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)，但嚴(yán)重缺乏畜禽產(chǎn)品中有機(jī)磷、氨基甲酸酯類、擬除蟲菊酯類等農(nóng)藥殘留的限量標(biāo)準(zhǔn)，特別是許多劇毒、高殘留的農(nóng)藥沒有制定限量指標(biāo)。而截至目前，我國尚未系統(tǒng)開展畜禽產(chǎn)品中農(nóng)藥殘留的基礎(chǔ)性研究工作，缺乏畜禽產(chǎn)品中農(nóng)藥殘留的風(fēng)險(xiǎn)評估數(shù)據(jù)的文獻(xiàn)報(bào)道。而越來越多的作物，畜產(chǎn)品農(nóng)藥殘留量超標(biāo)的報(bào)道也提醒著我們:進(jìn)一步加強(qiáng)動(dòng)物組織中農(nóng)藥殘留水平的監(jiān)測也已刻不容緩。
[0003]辛硫磷(Phoxim)又稱拜辛松、巴賽松、腈肟磷、倉蟲凈、倍腈松、肟硫磷、百吉、倍氰松、肟磷等，分子式:C12H15N2O3PS,是一種的高效、低毒、低殘留廣譜有機(jī)磷農(nóng)藥，在中性及酸性介質(zhì)中穩(wěn)定，在堿性介質(zhì)中易分解；易光解，在無光照條件下殘效期長。畜牧業(yè)中主要用來防治牛羊豬兔等動(dòng)物的疥癬病，驅(qū)趕體表寄生蟲。因此，該農(nóng)藥的殘留對于動(dòng)物生產(chǎn)以及畜牧產(chǎn)品生產(chǎn)有著較大的影響。
[0004]現(xiàn)有技術(shù)中，對于辛硫磷殘留量的檢測，主要在水、作物、蔬果等中進(jìn)行，國家標(biāo)準(zhǔn)方法是，將樣本用石油醚(或石油醚/丙酮)避光浸提12小時(shí)左右，洗滌抽濾或回流處理，濾液中加硫酸鈉水溶液，再用石油醚萃取，濃縮獲得樣品；含有辛硫磷的樣品在富氫焰上燃燒，以氫磷氧(HPO)碎片的形式，放射出波長526nm的特征光，這種特征光通過濾光片選擇后，由光電倍增管接收，轉(zhuǎn)換成電信號，經(jīng)微電流放大器放大后，分別記錄標(biāo)準(zhǔn)和樣品的峰高，以外標(biāo)法定量樣品的含量。該方法取樣量較大、操作過程復(fù)雜、檢測時(shí)間長，難以快速獲得檢測結(jié)果。并且，目前也尚未有對于如SD大鼠，豬等動(dòng)物體內(nèi)的辛硫磷殘留量進(jìn)行檢測的報(bào)道。
[0005]由于SD大鼠等試驗(yàn)動(dòng)物對化學(xué)農(nóng)藥比較敏感，其攝入不同含量農(nóng)藥中毒以后的癥狀比較相似，所以不能根據(jù)病癥來進(jìn)行診斷。因此，為了準(zhǔn)確判定化學(xué)農(nóng)藥中毒后動(dòng)物體內(nèi)農(nóng)藥的殘留量，迫切需要探索一種可行的、簡便的化學(xué)農(nóng)藥檢測方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的目的是提供一種動(dòng)物組織中辛硫磷殘留量的檢測方法。
[0007]為達(dá)到上述發(fā)明目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案是:一種動(dòng)物組織中辛硫磷殘留量的檢測方法，包括以下步驟:
[0008](I)待測樣本先由經(jīng)二氯甲烷洗脫，37°C氮?dú)獯蹈珊蟮玫教崛∥铮?br>[0009](2)將提取物溶于甲醇，再用0.45μπι有機(jī)濾膜過濾得到提取物溶液；
[0010](3)以甲醇-水溶液作為流動(dòng)相，利用高效液相色譜法進(jìn)行檢測，確定組織中辛硫磷殘留量。
[0011 ]本發(fā)明還具有如下技術(shù)特征:
[0012]1、如上所述的待測樣本選自SD動(dòng)物的腸道組織、肝臟組織、腎臟組織或肌肉組織中的一種。
[0013]2、如上所述的步驟(2)中對應(yīng)每0.1g組織樣品提取物所使用的甲醇的用量為lml。
[0014]3、如上所述的步驟(3)利用高效液相色譜分析法得到辛硫磷殘留量的方法是，將辛硫磷標(biāo)準(zhǔn)品稀釋成不同濃度的溶液，經(jīng)高效液相色譜分析獲得不同濃度相對應(yīng)的峰面積，制備標(biāo)準(zhǔn)曲線，對待測的提取物溶液進(jìn)行高效液相色譜檢測，獲得其辛硫磷對應(yīng)峰的峰面積，與標(biāo)準(zhǔn)曲線對比獲得樣品的辛硫磷殘留量。4、一種SD大鼠的組織中辛硫磷殘留量的檢測方法，步驟如下:
[0015]步驟(I):取待測組織樣本0.lg，在液氮中充分研磨，轉(zhuǎn)移至含有1.5-2.0g硅藻土 /三硅酸鎂的研缽中繼續(xù)研磨;將兩張快速定量濾紙折疊好至于漏斗上，用回形針固定;將研缽內(nèi)混合物倒入濾紙中，量取8-lOml二氯甲烷，洗脫濾紙內(nèi)混合物1-2次;再取2-5ml二氯甲烷沖洗研缽，將濾液與洗液一并倒入濾器中，收集濾液，將濾液在37°C氮?dú)鈼l件下吹干，
[0016]步驟(2):每0.1g組織樣品提取物加入Iml甲醇，漩渦振蕩10s，收集溶液，將溶液過0.45μπι有機(jī)濾膜，待測；
[0017]步驟(3):將純品的辛硫磷標(biāo)品稀釋成不同濃度的溶液，經(jīng)高效液相色譜分析獲得不同濃度相對應(yīng)的峰面積，制備標(biāo)準(zhǔn)曲線，對待測的提取物溶液進(jìn)行高效液相色譜檢測，獲得其辛硫磷對應(yīng)峰的峰面積，與標(biāo)準(zhǔn)曲線對比獲得樣品的辛硫磷殘留量。
[0018]5、如上所述的待測樣本選自SD大鼠的腸道組織、肝臟組織、腎臟組織或肌肉組織中的一種。
[0019]與現(xiàn)有技術(shù)中檢測蔬菜水果辛硫磷殘留量的方法相比，本發(fā)明采用高效液相色譜的方法，具有取樣量少，檢測時(shí)間短，操作簡便等優(yōu)點(diǎn);本發(fā)明的檢測結(jié)果準(zhǔn)確，辛硫磷檢測限為0.01mg/L，能夠滿足一般化學(xué)農(nóng)藥藥物殘留定量的要求。
【附圖說明】
[0020]圖1是本發(fā)明實(shí)施例提供的辛硫磷標(biāo)準(zhǔn)品液相色譜圖。
[0021]圖2是本發(fā)明實(shí)施例提供的空白組織樣品液相色譜圖。
[0022]圖3是實(shí)施例中辛硫磷內(nèi)標(biāo)樣品液相色譜圖。
[0023]圖4是實(shí)施例中辛硫磷添毒樣品液相色譜圖。
[0024]圖5是本發(fā)明實(shí)施例提供的不同濃度辛硫磷標(biāo)準(zhǔn)品與測試的峰面積之間的關(guān)系曲線圖。
【具體實(shí)施方式】
[0025]下面結(jié)合實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步描述:
[0026]實(shí)施例1
[0027]動(dòng)物肝臟組織中的辛硫磷殘留量的檢測方法
[0028](I)材料及設(shè)備:
[0029]動(dòng)物品種選用SD大鼠。農(nóng)藥采用辛硫磷標(biāo)準(zhǔn)品(色譜純，Sigma公司產(chǎn)品，編號:14816-18-3 )，甲醇(色譜純，Sigma公司產(chǎn)品，編號:67-56-1 )，二氯甲烷(分析純，天津富宇公司產(chǎn)品)。
[0030]高效液相色譜儀為美國WATERS公司產(chǎn)品(WATERS 6000)，包括WATERS2487紫外檢測器;色譜柱0DSC18為PG instruments Ltd公司產(chǎn)品。
[0031](2)給藥及采樣:
[0032]采用常規(guī)飼養(yǎng)方法飼養(yǎng)，每日早8:00采用經(jīng)口灌喂方式進(jìn)行染毒，以大豆油為溶劑，染毒量為0.5mL，染毒濃度為180mg/kg.BW。每日稱重I次，以調(diào)整灌喂量。每天I次，每周7天，共持續(xù)30d。灌喂后放回籠中，自由飲水，自由采食。在動(dòng)物試驗(yàn)的第30d采血，進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室分析。取組織樣品用生理鹽水清洗后放于樣品袋中，貼好標(biāo)簽并保存于-20°C冰箱。
[0033](3)樣品處理
[0034]取SD大鼠肝臟組織樣品0.10g，在液氮中充分研磨，轉(zhuǎn)移至含有1.5-2.0g硅藻土 /三硅酸鎂的研缽中繼續(xù)研磨。將兩張快速定量濾紙折疊好至于漏斗上，用回形針固定。將研缽內(nèi)混合物倒入濾紙中。量取S-1OmL二氯甲烷，洗脫濾紙內(nèi)混合物1-2次;再取2-5mL二氯甲烷沖洗研缽，倒入濾器中，一并收集濾液，37°C氮?dú)獯蹈?，將提取物溶于ImL甲醇，漩渦振蕩1s，再用0.45μπι有機(jī)濾膜過濾，待測。
[0035](4)色譜條件的選擇
[0036]流動(dòng)相:甲醇-水溶液(體積比為3:1)，流速:1 mL/min，柱溫:30°C
[0037]進(jìn)樣量:20yL，測定波長:280nm
[0038](5)辛硫磷標(biāo)準(zhǔn)液的配制
[0039]準(zhǔn)確稱取辛硫磷標(biāo)準(zhǔn)品0.0105g，用甲醇溶液定容至100mL，配制成105mg//L的辛硫磷標(biāo)準(zhǔn)液。將標(biāo)準(zhǔn)液貯存于棕色容量瓶中，4°(:保存。再用甲醇稀釋成5.251^/1，1.051^/1，0.525mg/L，0.105mg/L，和0.0105mg/L 的標(biāo)準(zhǔn)溶液。
[0040](6)標(biāo)準(zhǔn)曲線與最低檢測限
[0041 ]取各濃度標(biāo)準(zhǔn)工作液，經(jīng)0.45μπι濾膜過濾，取20yL進(jìn)樣測定，每個(gè)系列進(jìn)樣3次，取平均峰面積值。以辛硫磷質(zhì)量濃度X(mg/L)為橫坐標(biāo)，以相應(yīng)的峰面積Y為縱坐標(biāo)繪制工作曲線，求得線性方程。以響應(yīng)值與濃度變化的增量確定儀器的靈敏度，根據(jù)3倍噪音與靈敏度之比計(jì)算藥物的檢測限。
[0042](7)分析方法評價(jià)
[0043]準(zhǔn)確度指測定值(平均值)與真實(shí)值的接近程度，表示分析結(jié)果的正確性。采用標(biāo)準(zhǔn)添加法，在空白SD大鼠的肝臟、腸道組織中添加3個(gè)不同水平濃度的辛硫磷進(jìn)行回收率試驗(yàn)。每個(gè)加標(biāo)水平重復(fù)測定3次，同時(shí)作空白實(shí)驗(yàn)，以回收率大于95%為標(biāo)準(zhǔn)。
[0044](8)方法驗(yàn)證
[0045 ] 辛硫磷標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖參見附圖1所示，從圖中可以看出辛硫磷標(biāo)準(zhǔn)品在280nm下檢測到的出峰時(shí)間是7.995min。
[0046]特異性分析
[0047]通過測定空白樣品，辛硫磷內(nèi)標(biāo)樣品及添毒樣品的色譜峰來檢測辛硫磷在樣品中的出峰情況，辛硫磷在肝臟組織中的出峰情況如圖2-4所示，結(jié)果顯示，肝臟空白樣品在Smin左右沒有出峰(圖2)，加標(biāo)樣品在8.135min有一個(gè)明顯的峰，即辛硫磷樣品峰(圖3)。灌喂辛硫磷以后的肝臟組織樣品，在8.053min處檢測到辛硫磷峰(圖4)。
[0048]如圖5所示，為紫外檢測器所檢測到的峰面積與辛硫磷濃度的關(guān)系曲線，可見，辛硫磷在0.0105-5.25mg/L濃度范圍內(nèi)，辛硫磷的濃度值與響應(yīng)峰面積值之間的相關(guān)系數(shù)為
0.9992，呈良好的線性關(guān)系。辛硫磷檢測限為0.01mg/L，能夠滿足藥物殘留定量的要求。
[0049]樣品加標(biāo)回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差
[0050]采用標(biāo)準(zhǔn)添加法，在SD的肝臟、腎臟、腸道和肌肉組織中添加3個(gè)不同水平濃度的辛硫磷進(jìn)行回收率試驗(yàn)，每個(gè)加標(biāo)水平重復(fù)測定3次。根據(jù)上述處理方法，樣品的回收率都大于95 %，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差小于5 % ο回收率高，滿足檢測微量農(nóng)藥的需求，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差較小，說明方法重現(xiàn)性好，是可以采用的。
[0051 ]肝臟中辛硫磷含量
[0052]肝臟中辛硫磷含量濃度為1.032mg/L。
[0053]實(shí)施例2:
[0054]去除腸道中內(nèi)容物后的空腸組織辛硫磷殘留量的檢測方法
[0055]采用常規(guī)飼養(yǎng)方法飼養(yǎng)，每日早8:00采用經(jīng)口灌喂方式進(jìn)行染毒，以大豆油為溶劑，染毒量為0.5mL，染毒濃度為180mg/kg.BW。每日稱重I次，以調(diào)整灌喂量。每天I次，每周7天，共持續(xù)30d。灌喂后放回籠中，自由飲水，自由采食。在大鼠試驗(yàn)的第30d采血，宰殺進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室分析。取空腸組織樣品用生理鹽水清洗后放于樣品袋中，貼好標(biāo)簽并保存于-20°C冰箱。
[0056]取SD大鼠空腸組織樣品0.10g，在液氮中充分研磨，轉(zhuǎn)移至含有1.5-2.0g硅藻土 /三硅酸鎂的研缽中繼續(xù)研磨。將兩張快速定量濾紙折疊好至于漏斗上，用回形針固定。將研缽內(nèi)混合物倒入濾紙中。量取S-1OmL二氯甲烷，洗脫濾紙內(nèi)混合物1-2次;再取2-5mL二氯甲烷沖洗研缽，倒入濾器中，一并收集濾液，37°C氮?dú)獯蹈?，將提取物溶于ImL甲醇，漩渦振蕩1s，再用0.45μπι有機(jī)濾膜過濾，待測。進(jìn)行高效液相色譜分析。
[0057]采用實(shí)施例一同樣的方法進(jìn)行檢測，測得去除腸道中內(nèi)容物后的空腸組織辛硫磷的濃度為2.086mg/L。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種動(dòng)物組織中辛硫磷殘留量的檢測方法，其特征在于:包括以下步驟: (1)待測樣本先由經(jīng)二氯甲烷洗脫，37°c氮?dú)獯蹈珊蟮玫教崛∥铮? (2)將提取物溶于甲醇，再用0.45μπι有機(jī)濾膜過濾得到提取物溶液； (3)以甲醇-水溶液作為流動(dòng)相，利用高效液相色譜法進(jìn)行檢測，確定組織中辛硫磷殘留量。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種動(dòng)物組織中辛硫磷殘留量的檢測方法，其特征在于:所述的待測樣本選自SD動(dòng)物的腸道組織、肝臟組織、腎臟組織或肌肉組織中的一種。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種動(dòng)物組織中辛硫磷殘留量的檢測方法，其特征在于:步驟(2)中對應(yīng)每0.1g組織樣品提取物所使用的甲醇的用量為Iml。4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種動(dòng)物組織中辛硫磷殘留量的檢測方法，其特征在于:步驟(3)利用高效液相色譜分析法得到辛硫磷殘留量的方法是，將辛硫磷標(biāo)準(zhǔn)品稀釋成不同濃度的溶液，經(jīng)高效液相色譜分析獲得不同濃度相對應(yīng)的峰面積，制備標(biāo)準(zhǔn)曲線，對待測的提取物溶液進(jìn)行高效液相色譜檢測，獲得其辛硫磷對應(yīng)峰的峰面積，與標(biāo)準(zhǔn)曲線對比獲得樣品的辛硫憐殘留量。5.—種SD大鼠的組織中辛硫磷殘留量的檢測方法，其特征在于，步驟如下: 步驟(I):取待測組織樣本0.1g，在液氮中充分研磨，轉(zhuǎn)移至含有1.5-2.0g硅藻土/三硅酸鎂的研缽中繼續(xù)研磨;將兩張快速定量濾紙折疊好至于漏斗上，用回形針固定;將研缽內(nèi)混合物倒入濾紙中，量取8-lOml二氯甲烷，洗脫濾紙內(nèi)混合物1-2次;再取2-5ml二氯甲烷沖洗研缽，將濾液與洗液一并倒入濾器中，收集濾液，將濾液在37 °C氮?dú)鈼l件下吹干， 步驟(2):每0.1g組織樣品提取物加入Iml甲醇，漩渦振蕩10s，收集溶液，將溶液過0.45μπι有機(jī)濾I吳，待測； 步驟(3):將純品的辛硫磷標(biāo)品稀釋成不同濃度的溶液，經(jīng)高效液相色譜分析獲得不同濃度相對應(yīng)的峰面積，制備標(biāo)準(zhǔn)曲線，對待測的提取物溶液進(jìn)行高效液相色譜檢測，獲得其辛硫磷對應(yīng)峰的峰面積，與標(biāo)準(zhǔn)曲線對比獲得樣品的辛硫磷殘留量。6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的一種動(dòng)物組織中辛硫磷殘留量的檢測方法，其特征在于:所述的待測樣本選自SD大鼠的腸道組織、肝臟組織、腎臟組織或肌肉組織中的一種。
【文檔編號】G01N30/02GK106018589SQ201610318041
【公開日】2016年10月12日
【申請日】2016年5月13日
【發(fā)明人】單安山, 張婧, 宋文濤, 孫岳丞
【申請人】東北農(nóng)業(yè)大學(xué)