中的濃度） 生物胞素水溶液 2mmol兒 試劑2: 尚氛酸水溶液 60 wt% 試劑3: Na2C03 水溶液 lmol/L 試劑4: 碳酸鈉-碳酸氫鈉緩沖液CpH9.0) 250mol/L 1,2-二乙酰苯 1 wt% (在試劑4屮的濃度）
[0067] (2)生物素酶酶活性的檢測
[0068] 1)樣本的制備
[0069]樣本為健康成人的血漿，用量為10yL。
[0070] 2)樣本的檢測
[0071 ]向試劑1中加入血漿樣本，血漿樣本與試劑1的體積比1:19，加入樣本和試劑后混 合使之發(fā)生反應(yīng)，于37°C反應(yīng)24小時，反應(yīng)結(jié)束后加入試劑2終止反應(yīng)，試劑2與試劑1體積 比為1:20。終止后樣品管lOOOOg離心10min，取上清液，加入試劑3，其中上清液與試劑3的比 例為2:1，中和后(pH為9)再加入試劑4,其中上清液與試劑4的比例為1:1，衍生反應(yīng)條件為 30°C 下反應(yīng) 30min。
[0072]衍生反應(yīng)結(jié)束后用熒光檢測設(shè)備檢測體系在激發(fā)波長360nm(Ex = 360nm)以及發(fā) 射波長460nm(Em = 460nm)下的焚光值。
[0073]上述測定設(shè)置3個重復(fù)，經(jīng)計算健康成人干血濾紙片樣品的熒光讀值平均為2756。 [0074] 3)空白對照熒光值的測定
[0075] 對血漿樣本進(jìn)行滅活處理:將血漿樣本放入沸水浴中煮沸5分鐘。將試劑1中加入 至滅活后的血漿樣本中，血漿樣本與試劑1的體積比1:18，樣本和試劑后混合后，于37°C反 應(yīng)24小時，反應(yīng)結(jié)束后加入向反應(yīng)體系中加入試劑2終止反應(yīng)，試劑2與反應(yīng)體系的體積比 為1:20。終止后樣品管10000g離心1 Omin，取上清液，加入試劑3，其中上清液與試劑3的比例 為2:1，中和后(pH為9)再加入試劑4,其中上清液與試劑4的比例為1:1;檢測該體系在激發(fā) 波長360nm(Ex = 360nm)以及發(fā)射波長460nm(Em = 460nm)下的焚光值作為空白對照的焚光 值。
[0076]上述測定設(shè)置3個重復(fù)，經(jīng)計算空白對照的熒光讀值平均為466。
[0077] 4)標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制
[0078] 取不同濃度賴氨酸標(biāo)準(zhǔn)品，其濃度分別為0、7.5、15、30、60、90、120、150μπιο 1 /L，分 別與試劑4進(jìn)行衍生反應(yīng)，其中衍生反應(yīng)的條件與步驟2)中相同；檢測并記錄衍生反應(yīng)后的 體系在激發(fā)波長360nm和發(fā)射波長460nm下的焚光值；以賴氨酸的濃度為橫坐標(biāo)，以焚光值 為縱坐標(biāo)，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，如圖1所示。
[0079]根據(jù)所制作的標(biāo)準(zhǔn)曲線以及血漿樣品的平均熒光值與空白對照的平均熒光值的 差值，計算得出健康成人血液中生物素酶酶活性，為136.21±5.02(n = 3)，其中，酶活性的 單位定義為：以每L樣本每小時水解所述生物胞素生成的賴氨酸的微摩爾數(shù)，表示為Miol/ L/h〇
[0080]結(jié)果顯示，樣本的酶活力測定實驗結(jié)果穩(wěn)定(CV值小于5%，通過平行樣間的差異 比較得知），說明本發(fā)明的檢測生物素酶活力的方法可以有效檢測出血漿樣本中的生物素 酶酶活力，方法簡便，結(jié)果穩(wěn)定可靠。
[0081 ]實施例2、生物素酶酶活性的檢測
[0082]以經(jīng)臨床診斷和基因分析已確診的生物素酶缺乏癥的志愿者為分析對象，以健康 志愿者為對照。
[0083] 樣本為干血濾紙片，與實施例1中相同。
[0084] 檢測方法與實施例1中相同，每個樣本分別進(jìn)行3次獨立的酶活性測定實驗，檢測 結(jié)果見表1所示。
[0085] 表1健康成人與生物素酶缺乏癥患者的酶活均值
[0086]
[0087]由表1中的數(shù)據(jù)可知，健康成人樣本酶活性為：102.65 ± 9.17 (n= 10);生物素酶缺 乏癥患者的酶活力只有健康成人對照組的0.89%，這一結(jié)果與基因分析的結(jié)論相吻合。驗 證了本發(fā)明提供的試劑盒進(jìn)行生物素酶酶活性的檢測時，具有穩(wěn)定性、特異性、可靠性，可 應(yīng)用于臨床檢測與生物素酶酶活力異常相關(guān)的疾病。
[0088]實施例3、生物素酶酶活性的檢測
[0089] 樣本為干血濾紙片，與實施例1中相同。
[0090] 檢測方法與實施例1中相同，共設(shè)置6組反應(yīng)，每組含2個樣本和2個空白對照，并分 別于4h、7h、16h、20h、24h和30h終止一組反應(yīng)，然后進(jìn)行衍生反應(yīng)，并檢測熒光值，考察反應(yīng) 過程中干血片中生物素酶的穩(wěn)定性（如圖2所示，線性方程為 ：y = 73.97x+66.64，R2 = 0.998)。從圖2中可以看出，在30h內(nèi)，干血片中的生物素酶酶活性穩(wěn)定，檢測結(jié)果可靠。
[0091] 由上述實施例可知，完全可以采用常規(guī)的熒光檢測設(shè)備利用本發(fā)明的試劑盒進(jìn)行 生物素酶酶活性的檢測，并且靈敏度高，特異性好，操作簡便，便于推廣應(yīng)用于臨床檢測與 生物素酶酶活力異常相關(guān)的疾病。
【主權(quán)項】
1. 一種檢測生物素酶酶活性的試劑盒，其特征在于:所述試劑盒包括獨立包裝的試劑 1、試劑2、試劑3和試劑4; 所述試劑1為由緩沖液1、酶活穩(wěn)定劑和生物胞素組成的緩沖體系，所述試劑1的pH值為 3 ~11; 所述試劑2為終止液； 所述試劑3為中和液； 所述試劑4為由緩沖液2和衍生底物組成的體系，所述衍生底物為1，2_二乙酰苯、茚三 酮、焚光胺和鄰苯二醛中任一種。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于:所述試劑1中，所述緩沖液1的摩爾濃度 為50~500mmol/L，所述酶活穩(wěn)定劑的摩爾濃度為1~50mmol/L，所述生物胞素的摩爾濃度 為0·05~2mmol/L; 所述試劑2中，所述終止液的質(zhì)量百分含量為30 %~70 % ; 所述試劑3中，所述中和液的摩爾濃度為0.2~2mol/L; 所述試劑4中，所述緩沖液2的摩爾濃度為50~500mmol/L，所述衍生底物的質(zhì)量百分含 量為0.05%~5%。3. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的試劑盒，其特征在于:所述緩沖液1和所述緩沖液2均選自 下述緩沖試劑中至少一種： a)乙酸鈉-乙酸緩沖液，pH為2.6-5.8、b)甲酸鈉-甲酸緩沖液，pH為2.0-5.0、c)梓檬酸-檸檬酸鈉緩沖液，pH為3.0-6.6、d)磷酸氫鹽-檸檬酸緩沖液，pH為2.2-8.0、e)磷酸氫鹽-檸 檬酸鹽緩沖液，pH為2.2-8.0、f)磷酸鹽緩沖液，pH為4.9-8.2、g)檸檬酸-氫氧化鈉-鹽酸緩 沖液，pH為2.2-6.5、h)Tris-鹽酸緩沖液，pH為7.1-8.9、i)甘氨酸-氫氧化鈉緩沖液，pH為 8.6-10.6和j)碳酸鈉-碳酸氫鈉緩沖液，pH為9.16-10.83。4. 根據(jù)權(quán)利要求1-3中任一項所述的試劑盒，其特征在于：所述酶活穩(wěn)定劑為MgS04、 MgCl2、乙二胺四乙酸二鈉、乙二胺四乙酸二鉀、β-巰基乙醇、二硫蘇糖醇、牛血清白蛋白、甘 油和二甲基亞砜中至少一種。5. 根據(jù)權(quán)利要求1-4中任一項所述的試劑盒，其特征在于:所述終止液為高氯酸、鹽酸、 硫酸、硝酸和三氯乙酸中至少一種的水溶液； 所述中和液為碳酸鈉、碳酸氫鈉、氫氧化鈉、氫氧化鉀和氫氧化鈣中至少一種的水溶 液。6. 權(quán)利要求1-5中任一項所述試劑盒在輔助診斷生物素酶缺乏癥中的應(yīng)用。7. 生物胞素在制備輔助診斷生物素酶缺乏癥的檢測試劑盒或檢測生物素酶酶活性中 的應(yīng)用。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種檢測生物素酶酶活性的試劑盒。所述試劑盒包括獨立包裝的試劑1、試劑2、試劑3和試劑4；所述試劑1為由緩沖液1、酶活穩(wěn)定劑和生物胞素組成的緩沖體系，所述試劑1的pH值為3～11；所述試劑2為終止液；所述試劑3為中和液；所述試劑4為由緩沖液2和衍生底物組成的體系，所述衍生底物為1,2-二乙酰苯、茚三酮、熒光胺和鄰苯二醛中任一種。利用本發(fā)明試劑盒進(jìn)行檢測時，可以干血片為檢測樣本，這使得本方法可應(yīng)用于新生兒篩查，滿足生物素酶缺乏癥需及時診治的要求，易于推廣使用。
【IPC分類】G01N33/573
【公開號】CN105510583
【申請?zhí)枴緾N201510830513
【發(fā)明人】郝淑靜, 劉曉敏, 劉衛(wèi)德, 胡潔
【申請人】北京中科非凡生物技術(shù)有限公司, 北京中科醫(yī)學(xué)檢驗所有限公司, 北京和信創(chuàng)新生物科技有限責(zé)任公司
【公開日】2016年4月20日
【申請日】2015年11月25日