檢測(cè)左卡尼汀中對(duì)映異構(gòu)體含量的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于藥物檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種檢測(cè)左卡尼汀中對(duì)映異構(gòu)體含量的 方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 左卡尼汀(Levocarnitine)，又名左旋肉堿，是食物的組成成份，廣泛存在于自然 界中，山羊肉中含量最高，約為2.lg/kg，而植物性食物中含量極少甚至沒有，被認(rèn)為是類維 生素的營養(yǎng)素。人體本身也能合成左旋肉堿，成人體內(nèi)約有20克左旋肉堿，主要分布于心 肌、骨骼肌中。
[0003]左卡尼汀于1905年由俄國科學(xué)家Gulewitsch和Krimberg從肌肉提取物中首次被 發(fā)現(xiàn)。經(jīng)過多年的研究發(fā)展，左卡尼汀現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于臨床。其主要功能是促進(jìn)脂類代謝， 它既能將長鏈脂肪酸帶進(jìn)線粒體基質(zhì)，并促進(jìn)其氧化分解，為細(xì)胞提供能量，又能將線粒體 內(nèi)產(chǎn)生的短鏈脂?；敵觥Ｑa(bǔ)充左卡尼汀可緩解其因體內(nèi)缺乏引起的脂肪代謝紊亂、骨骼 肌和心肌等組織的功能障礙。左卡尼汀結(jié)構(gòu)如下：
[0004]
[0005]Zn下化7」S例個(gè)伃住一丨、于?土中心，所以只存在一個(gè)對(duì)映異構(gòu)體，即右卡尼汀。據(jù) 文獻(xiàn)報(bào)道，右卡尼汀對(duì)肉堿乙酰轉(zhuǎn)移酶和肉堿脂肪酰轉(zhuǎn)移酶有競(jìng)爭性抑制作用，因此考慮 到用藥的安全性，需要嚴(yán)格控制左卡尼汀中右卡尼汀的含量。
[0006]目前歐洲藥典和美國藥典中收載的左卡尼汀均未對(duì)其對(duì)映異構(gòu)體進(jìn)行控制，在文 獻(xiàn)（J.Pharm.Biomed.Anal. 30(2002)209-218)、CN101723843A及CN102359995A等文獻(xiàn)中，報(bào) 道了左卡尼汀衍生化之后用HPLC測(cè)定異構(gòu)體的方法，但這些方法所用衍生化試劑成本較 高，因此有必要對(duì)檢測(cè)左卡尼汀中對(duì)映異構(gòu)體含量的方法進(jìn)行更深入地研究。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]本發(fā)明的目的是提供一種檢測(cè)左卡尼汀中對(duì)映異構(gòu)體含量的方法，利用苯甲酰鹵 化合物作為衍生化試劑，具有較高的重復(fù)性、精密度和準(zhǔn)確度。
[0008]本發(fā)明所述的左卡尼汀中對(duì)映異構(gòu)體含量的方法，包括如下步驟：
[0009] (1)色譜條件：
[0010]色譜柱:CHIRALIE手性柱，250X4.6mm4^55ym;
[0011] 檢測(cè)波長232nm;
[0012] 流動(dòng)相:正己烷-無水乙醇-三氟乙酸；
[0013]流速：1 · 0~1 · 5ml/min;
[0014]運(yùn)行時(shí)間：25min;
[0015] 空白溶液:不加左卡尼汀的衍生溶液；
[0016] (2)衍生化：
[0017] 稱取左卡尼汀、右卡尼汀，分別置于反應(yīng)瓶中，加入溶劑和衍生化試劑，60~70°C 攪拌0.5小時(shí)，減壓蒸干，得到相應(yīng)的衍生物；
[0018] (3)對(duì)映異構(gòu)體貯備溶液的配置：
[0019]精密稱取右卡尼汀衍生物，置于容量瓶中，用無水乙醇溶解，然后用無水乙醇稀釋 至濃度為〇. 〇5mg/ml;
[0020] (4)系統(tǒng)適用性溶液的配置：
[0021] 精密稱取左卡尼汀衍生物，置于容量瓶中，再加入對(duì)映異構(gòu)體貯備溶液，用無水乙 醇溶解，然后用無水乙醇稀釋至左卡尼汀衍生物濃度為1.0~2.Omg/ml、對(duì)映異構(gòu)體衍生物 濃度為〇·0025~0·005mg/ml;
[0022] (5)供試品溶液的配置：
[0023]精密稱取左卡尼汀衍生物，置于容量瓶中，用無水乙醇溶解并稀釋至濃度為1.0~ 2.Omg/ml；
[0024] (6)檢測(cè)方法：
[0025] 取空白溶液1Ομ1注入液相色譜儀，記錄圖譜；取系統(tǒng)適用性溶液1Ομ1注入液相色 譜儀，重復(fù)6次，記錄圖譜;取供試品溶液?ομL注入液相色譜儀，記錄圖譜，記錄峰面積，計(jì)算 左卡尼汀中對(duì)映異構(gòu)體的含量。要求6次測(cè)定對(duì)映體衍生物峰面積的RSD< 5.0%，主峰峰面 積的RSD< 5.0 %，各峰保留時(shí)間的RSD< 2.0 %，各峰間分離度、理論板數(shù)均符合要求。
[0026] 其中：
[0027] 所述正己烷-無水乙醇-三氟乙酸流動(dòng)相體積比為70:10~30:0.3。
[0028]所述溶劑為甲酸、乙酸或三氟乙酸，優(yōu)選乙酸，以每克左卡尼汀/右卡尼汀計(jì)，溶劑 用量為5~10ml。
[0029] 所述衍生化試劑為具有如下結(jié)構(gòu)的化合物：
[0030]
[0031]X為C1或Br;R為H、CH3或CH3CH2 ;R基團(tuán)的位置為鄰位、間位或?qū)ξ弧?br>[0032]所述衍生化試劑優(yōu)選苯甲酰氯。
[0033]所述衍生化試劑的用量為左卡尼汀/右卡尼汀的1.2~2.0當(dāng)量。
[0034]本發(fā)明的有益效果如下：
[0035] 本發(fā)明利用苯甲酰鹵系列化合物作為衍生化試劑對(duì)左卡尼汀進(jìn)行衍生化，然后采 用HPLC進(jìn)行檢測(cè)，以面積歸一化法計(jì)算對(duì)映體的含量。本發(fā)明檢測(cè)左卡尼汀中對(duì)映異構(gòu)體 含量，有著較高的重復(fù)性、精密度和準(zhǔn)確度，對(duì)控制左卡尼汀原料藥的質(zhì)量、保證用藥安全 有重要意義。
[0036] 另外，本發(fā)明使用苯甲酰鹵系列化合物作為衍生化試劑，成本較低，TLC法監(jiān)測(cè)衍 生化過程顯示，衍生化反應(yīng)完全，左卡尼汀及其對(duì)映異構(gòu)體全部轉(zhuǎn)化為相應(yīng)的衍生物，從而 保證了檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確。
【附圖說明】
[0037]圖1是實(shí)施例2中左卡尼汀苯甲酰氯衍生物的HPLC圖譜；
[0038]圖2是實(shí)施例2中右卡尼汀苯甲酰氯衍生物的HPLC圖譜；
[0039]圖3是實(shí)施例2中系統(tǒng)適用性溶液第一次實(shí)驗(yàn)結(jié)果的HPLC圖譜；
[0040]圖4是實(shí)施例2中檢測(cè)左卡尼汀對(duì)映異構(gòu)體含量的HPLC圖譜；
[0041]圖5是實(shí)施例3中檢測(cè)左卡尼汀對(duì)映異構(gòu)體含量的HPLC圖譜；
[0042]圖6是實(shí)施例4中檢測(cè)左卡尼汀對(duì)映異構(gòu)體含量的HPLC圖譜。
【具體實(shí)施方式】
[0043]以下結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步描述。
[0044] 實(shí)施例1
[0045]檢測(cè)方法：
[0046] 1、色譜條件：
[0047]色譜柱：CHIRALIE手性柱，250X4·6mm，粒徑5μπι;檢測(cè)波長232nm;流動(dòng)相：正己 烷-無水乙醇-三氟乙酸（體積比70 : 30 : 0.3);柱溫：30°C;流速：1.Oml/min;運(yùn)行時(shí)間： 25min;進(jìn)樣量：10μ1;
[0048]空白溶液:不加左卡尼汀的衍生溶液。
[0049] 2、溶液的配置
[0050] 2.1右卡尼汀衍生物貯備溶液的配置：
[00511 精密稱取右卡尼汀衍生物10mg，置10ml容量瓶中，用無水乙醇溶解至刻度，搖勻， 精密量取lml，置20ml量瓶中，加無水乙醇稀釋至刻度，搖勻，即得，濃度為0.05mg/ml;
[0052] 2.2系統(tǒng)適應(yīng)性溶液的配置：
[0053] 精密稱取左卡尼汀衍生物20mg，置20ml容量瓶中，先加少量無水乙醇溶解，再加入 右卡尼汀衍生物貯備溶液1.0ml，用無水乙醇稀釋至刻度，混勻，左卡尼汀衍生物濃度為1. Omg/ml、對(duì)映異構(gòu)體衍生物濃度為0.0025mg/ml。
[0054] 2.3供試品溶液的配置：
[0055]精密稱取左卡尼汀衍生物20mg，置20ml容量瓶中，用無水乙醇溶解并稀釋至刻度， 混勻，左卡尼汀衍生物濃度為1.〇mg/ml。
[0056] 3、檢測(cè)方法：
[0057] 取空白溶液10μ1注入液相色譜儀，記錄圖譜，空白溶液應(yīng)無干擾峰；
[0058] 取系統(tǒng)適應(yīng)性溶液ΙΟμΙ注入液相色譜儀，重復(fù)6次，記錄圖譜，要求6次測(cè)定對(duì)映體 衍生物峰面積的RSD<5.0%，主峰峰面積的RSD<5.0%，各峰保留時(shí)間的RSD<2.0%，各峰 間分離度、理論板數(shù)均符合要求。
[0059] 取供試品溶液10μ1注入液相色譜儀，記錄圖譜，記錄峰面積，計(jì)算左卡尼汀中對(duì)映 異構(gòu)體的含量。
[0060] 實(shí)施例2
[0061]以苯甲酰氯為衍生化試劑檢測(cè)左卡尼汀中對(duì)映異構(gòu)體含量：
[0062] 1、左卡尼汀衍生化反應(yīng)
[0063] 稱取左卡尼汀161mg，置于反應(yīng)瓶中，加入1.6ml乙酸和168mg(1.2當(dāng)量)苯甲酰氯， 60~65°C攪拌0.5小時(shí)，減壓蒸干，得左卡尼汀苯甲酰氯衍生物。
[0064] 2、右卡尼汀衍生化反應(yīng)
[0065]稱取右卡尼汀161mg，置于反應(yīng)瓶中，加入1.6ml乙酸和168mg(1.2當(dāng)量)苯甲酰氯， 60~65°C攪拌0.5小時(shí)，減壓蒸干，得右卡尼汀苯甲酰氯衍生物。
[0066] 3、按照實(shí)施例1中檢測(cè)方法進(jìn)行檢測(cè)，系統(tǒng)適用性實(shí)驗(yàn)測(cè)定結(jié)果見表1:
[0067]表1系統(tǒng)適用性實(shí)驗(yàn)測(cè)定結(jié)果
[0068]
[0069]圖譜見圖1~4。其中，圖1是左卡尼汀苯甲酰氯衍生物的HPLC圖譜；圖2是右卡尼汀 苯甲酰氯衍生物的HPLC圖譜。圖1、圖2中檢測(cè)結(jié)果見表2。
[0070]表2圖1、圖2檢測(cè)結(jié)果
[0071]
[0072]左卡尼汀樣品中對(duì)映異構(gòu)體含量為0.026wt%，結(jié)果見表3,圖譜見圖4。
[0073]表3以苯甲酰氯為衍