干燥后真空抽干包裝成成品試劑盒酶標(biāo)板；
[0039] ②試劑盒其他成分的配置：
[0040]A)酶標(biāo)二抗：用酶稀釋液（10mMPBS+1%牛血清白蛋白+0· 05%Tween20)配制成 1:500(V酶標(biāo)二抗:V酶稀釋液）的使用濃度；
[0041]B)樣品稀釋液：10mMPBS;
[0042] C)陽性對照：10mMPBS+陽性血清；
[0043]D)陰性對照：10mMPBS+陰性血清；
[0044] E)顯示劑A液：0.5%過氧化物尿素+5mMPBS;
[0045]F)顯示劑B液：1 % 3, 3'，5, 5' -四甲基聯(lián)苯胺+5mMPBS;
[0046]G)終止液：5mM硫酸；
[0047] H)20X濃縮洗滌液：1MPBS+0. 2%Tween20〇
[0048] 實(shí)施例2在實(shí)施例1的基礎(chǔ)上，用過碘酸鈉氧化法制備酶標(biāo)二抗，具體步驟如下：
[0049]稱取10mg辣根過氧化物酶（Sigma公司，HRP)，溶于lmL純水中；加入lmL新鮮配 制的0. 06mol/L高碘酸鈉溶液（北京化學(xué)試劑公司），室溫避光攪拌30min;加入lmL溶解 了 5mg純化后的兔抗水貂二抗的0.lmol/L碳酸鹽緩沖液，室溫避光輕攪2-3h;加新鮮配制 的0.2mL5mg/mL硼氫化鈉（北京化學(xué)試劑公司），4°C放置2h，以穩(wěn)定結(jié)合物；再移入透析 袋，于pH為7. 2的PBS透析過夜，-20 °C保存?zhèn)溆谩?br>[0050] 試驗(yàn)例1本發(fā)明快速檢測試劑盒的檢測方法及結(jié)果判定
[0051] (1)設(shè)置兩個孔分別加入100μL陽性對照；
[0052] (2)另設(shè)置兩個孔分別加入100μL陰性對照；
[0053] (3)取100μL經(jīng)1:100稀釋好的待檢樣品加入其他孔中，并做好記錄；
[0054] (4)37°(：孵育2〇11^11;
[0055] (5)將各孔的液體棄入廢液桶，每孔加250μL的洗滌液進(jìn)行洗板，重復(fù)3次，每次 30s，用毛巾或者紙巾拍干孔內(nèi)殘余液體；
[0056] (6)每孔加100μL酶標(biāo)結(jié)合物；
[0057] (7)37°C孵育20min;重復(fù)步驟（5);
[0058](8)每孔先加50μL底物液A，再加50μL底物液B;
[0059] (9) 37°C孵育lOmin(避光顯色）；每孔再加50μL終止液終止反應(yīng)；
[0060] (10)立刻于450nm波長處測定各孔的吸光度值，即0D45。值。
[0061] 試驗(yàn)有效性判斷：
[0062] ⑴陰性對照：正常情況下，陰性對照孔0D450值彡0· 3 ;
[0063] (2)陽性對照：正常情況下，陽性對照孔0D450值> 0· 3;
[0064] (3)P/N=樣本OD/N值，若陰性對照均值小于等于0. 1，則N值=0. 2+陰性對照 均值；若陰性對照均值大于〇. 1，則N值=陰性對照均值。
[0065] (4)結(jié)果判定：P/N彡2,判定該檢測樣品為陽性；2彡P(guān)/N< 3,判定該檢測樣品為 弱陽性，P/N彡3,判定該檢測樣品為強(qiáng)陽性。
[0066] 試驗(yàn)例2本發(fā)明快速檢測試劑盒與雙流向免疫電泳針對水貂阿留申病毒抗體進(jìn) 行敏感性和特異性對比，對比結(jié)果見表1和表2
[0067] 表1與水貂阿留申雙流向免疫電泳（CIE)進(jìn)行敏感性對比

【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種水貂阿留申病毒抗體ELISA快速檢測試劑盒的制備方法，其特征在于，所述制 備方法包括以下步驟： (1) 阿留申病毒培養(yǎng)： 將10日齡因阿留申病毒導(dǎo)致死亡的仔貂，取出睪丸和腎臟制備細(xì)胞懸液，細(xì)胞密度為 1~5 X IO4個/ml，37°C培養(yǎng)，營養(yǎng)液采用DMEM培育基，按DMEM培育基的體積加入5%新生 牛血清，細(xì)胞經(jīng)4天長成單層后，棄去營養(yǎng)液，加入除菌的連續(xù)通過貂體的第三代反應(yīng)毒， 接毒量為1 %，加入維持液，維持液采用不加血清的DMHM培養(yǎng)液，接毒后一周出現(xiàn)病變并收 集病毒，冷凍凍融三次待用； (2) 阿留申病毒純化： 稱取凝膠干粉G-20010-12克，緩慢地倒入20倍凝膠體積的蒸餾水中，在室溫條件下 浸泡三小時或在沸水中浸泡4-5小時，輕輕攪拌，在室溫靜止30分鐘，將上層液體傾出，再 用蒸餾水浮洗4次，然后裝柱加樣；收集時將每管洗脫液依次排列，逐份用SPA菌體（+)血 清試劑作特異性測定，根據(jù)特異性和峰值收集，第一峰為純化的阿留申病毒蛋白，第二峰為 非特異蛋白；經(jīng)s印hadex-G200分離后，將樣品裝入透析袋中、用聚乙二醇20000濃縮成要 求的蛋白含量、透析、平衡、分裝、4°C保存，即得純化的病毒抗原。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述水貂阿留申病毒抗體ELISA快速檢測試劑盒的制備方法，其特 征在于，所述快速檢測試劑盒中兔抗水貂二抗的制備及酶標(biāo)二抗的制備： 將水貂血清用辛酸-硫酸銨法純化，將純化血清與501佐劑按體積比1 :0. 5-1. 5的比 例混合，對2-3月齡新西蘭白兔進(jìn)行免疫，腿部肌肉注射，Img/只，以后每隔兩周免疫一次， 免疫劑量、部位同上；5免后心臟采血，即得到兔抗水貂二抗，然后用蛋白A柱純化兔血清， 計(jì)算蛋白濃度，用過碘酸鈉氧化法制備酶標(biāo)二抗。3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述水貂阿留申病毒抗體ELISA快速檢測試劑盒的制備方法，其特 征在于，所述快速檢測試劑盒中用過碘酸鈉氧化法制備酶標(biāo)二抗的具體步驟如下： 稱取IOmg辣根過氧化物酶，溶于ImL純水中；加入ImL新鮮配制的0. 06mol/L高碘酸 鈉溶液，室溫避光攪拌30min ;加入ImL溶解了 5mg純化后的兔抗水紹二抗的0. lmol/L碳 酸鹽緩沖液，室溫避光輕攪2-3h ;加新鮮配制的0. 2mL 5mg/mL硼氫化鈉，4°C放置2h，以穩(wěn) 定結(jié)合物；再移入透析袋，于PH為7. 2的PBS透析過夜，-20°C保存?zhèn)溆谩?. 根據(jù)權(quán)利要求2所述水貂阿留申病毒抗體ELISA快速檢測試劑盒的制備方法，其特 征在于，將水貂血清用辛酸-硫酸銨法純化，將純化的血清與501佐劑按體積比1 :1的比例 混合。5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述水貂阿留申病毒抗體ELISA快速檢測試劑盒的制備方法，其特 征在于，所述快速檢測試劑盒中酶標(biāo)板的制備： 在聚乙烯微孔板上預(yù)包被純化的病毒抗原，該包被使用pH為9. 6的IOmM碳酸鹽緩沖 液，在4°C下包被過夜；然后使用PBST洗滌兩次，PBST為10mMPBS+0. 05% Tween20,再加入 封閉液，封閉液為IOmM PBS+2%牛血清白蛋白，BSA，37°C封閉2小時，干燥后真空抽干包裝 成成品試劑盒酶標(biāo)板。6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述水貂阿留申病毒抗體ELISA快速檢測試劑盒的制備方法，其特 征在于，所述快速檢測試劑盒中其他成分的配置： A)酶標(biāo)二抗：用酶稀釋液（IOmM PBS+1 %牛血清白蛋白+0. 05 % Tween20)配制成 1:500 (V酶標(biāo)二抗:V酶稀釋液）的使用濃度； B) 樣品稀釋液：IOmM PBS ; C) 陽性對照：10mM PBS+陽性血清； D) 陰性對照：10mM PBS+陰性血清； 已）顯示劑八液：0.5%過氧化物尿素+51111?83; F) 顯示劑B液：1 % 3, 3'，5, 5' -四甲基聯(lián)苯胺+5mM PBS ; G) 終止液：5mM硫酸； H) 20X 濃縮洗滌液：1M PBS+0. 2% Tween20〇7. 如權(quán)利要求1-6任一項(xiàng)所述的制備方法制得的水貂阿留申病毒抗體ELISA快速檢測 試劑盒。8. 如權(quán)利要求7所述的水貂阿留申病毒抗體ELISA快速檢測試劑盒在水貂阿留申病毒 抗體的檢測方面的應(yīng)用。
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種水貂阿留申病毒抗體ELISA快速檢測試劑盒及其制備方法，步驟包括：(1)阿留申病毒培養(yǎng)；(2)阿留申病毒純化；(3)兔抗水貂二抗的制備及酶標(biāo)二抗的制備；(4)快速檢測試劑盒的制備。本發(fā)明可以快速、靈敏、準(zhǔn)確的檢測水貂阿留申病毒抗體，克服了國內(nèi)檢測水貂阿留申抗體主要以雙流向電泳法和PCR法的問題。
【IPC分類】G01N33/569
【公開號】CN105242042
【申請?zhí)枴緾N201510608449
【發(fā)明人】王玉茂, 沈志強(qiáng), 武玉香, 唐世云
【申請人】山東省濱州畜牧獸醫(yī)研究院
【公開日】2016年1月13日
【申請日】2015年9月22日