人流感嗜血桿菌量子點(diǎn)免疫層析檢測(cè)卡及其制備方法和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及醫(yī)學(xué)檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，具體為一種人流感嗜血桿菌量子點(diǎn)免疫層析檢測(cè) 卡及其制備方法和應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 流感嗜血桿菌（Haemophilusinfluenzae,Hi)是感染人類的一種重要的呼吸道病 原微生物，該菌由波蘭細(xì)菌學(xué)家費(fèi)佛博士在1892年的一次流行性感冒瘟疫中發(fā)現(xiàn)的，在隨 后的時(shí)間里被研究者們廣泛研究?，F(xiàn)僅知人是該病原體的宿主。免疫力較差的老人和兒童 為易感人群，特別是5歲以下的嬰幼兒。Hi可引發(fā)肺炎、結(jié)膜炎、中耳炎、腦膜炎和菌血癥 等，在全球每年至少有300萬(wàn)嚴(yán)重病例發(fā)生，可造成患兒致殘甚至死亡。Hi分為有莢膜的a、 b、c、d、e、f共6個(gè)血清型和無(wú)莢膜的不可分型流感嗜血桿菌（nontypeableHaemophilus influenzae，NTHi)，一度以莢膜b型Hi最為流行。目前我國(guó)開(kāi)展的Hi血清學(xué)檢查大多也 只針對(duì)侵襲力較強(qiáng)的莢膜b型。而由于該型菌株莢膜多糖疫苗的成功研發(fā)與應(yīng)用，其流行 已被有效控制。近來(lái)的研究多顯示，在感染Hi的患者中最常見(jiàn)的菌株是NTHi，其分離率已 達(dá)50%以上。
[0003] 臨床上由于Hi與其他呼吸道病原體引起的感染癥狀類似，因此常難以根據(jù)臨床 表現(xiàn)、X-射線檢查等得出結(jié)論，確診往往依賴于實(shí)驗(yàn)室診斷。嬰幼兒疾病的特點(diǎn)是起病急、 轉(zhuǎn)歸快，因此敏感、快速、實(shí)用的Hi檢測(cè)對(duì)及早進(jìn)行有效的臨床干預(yù)具有非常重要的意義。
[0004] 盡管流感嗜血桿菌在全球范圍內(nèi)傳播，但可用于實(shí)驗(yàn)室診斷的標(biāo)準(zhǔn)化商品試劑的 種類極少。目前，Hi感染的診斷方法有血清學(xué)檢測(cè)法，核酸檢測(cè)法和病原體直接檢測(cè)法。檢 測(cè)血清中HiIgG、IgA、IgM抗體常用的方法有：微量免疫熒光抗體檢測(cè)（MIF)，補(bǔ)體結(jié)合試 驗(yàn)（CF)，重組酶免疫測(cè)定（rEIA)，血清補(bǔ)體結(jié)合一酶免疫測(cè)定試驗(yàn)（SeroCF-EIA)等。然 而Hi抗體的檢出只能說(shuō)明該個(gè)體感染過(guò)Hi，卻不能反映體內(nèi)是否仍有Hi活菌存在，并且血 清學(xué)特異性抗體檢測(cè)常需要根據(jù)IgM抗體的動(dòng)態(tài)結(jié)果進(jìn)行判斷，需要較長(zhǎng)的時(shí)間。更重要 的是，血清學(xué)檢測(cè)的主要檢測(cè)對(duì)象為抗莢膜抗體，而NTHi由于沒(méi)有莢膜，則會(huì)造成漏檢。同 時(shí)，這些技術(shù)均存在靈敏度低、操作步驟復(fù)雜、需要專業(yè)人員操作、重復(fù)性差、檢測(cè)時(shí)間長(zhǎng)、 檢測(cè)特異性差、成本較高等缺陷，因而難以滿足臨床的實(shí)際需要。
[0005] 核酸檢測(cè)包括核酸雜交和聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR)，核酸雜交檢測(cè)Hi的特異性強(qiáng)， 但敏感性不高，主要用于PCR結(jié)果的檢測(cè)、判定，尚未直接用于臨床標(biāo)本的檢測(cè)；PCR具有較 高的敏感性，但PCR實(shí)驗(yàn)對(duì)實(shí)驗(yàn)室有特殊要求，標(biāo)本處理、擴(kuò)增和檢測(cè)要求嚴(yán)格，且易出現(xiàn) 假陽(yáng)性，在我國(guó)還不能作為常用的臨床診斷方法。
[0006] 病原體檢測(cè)方法主要為病原分離培養(yǎng)法，將標(biāo)本接種于添加了V和X因子的巧克 力血瓊脂培養(yǎng)基上，經(jīng)24小時(shí)培養(yǎng)后，挑取可疑菌落經(jīng)形態(tài)學(xué)鑒定后，用Hi鑒定卡、Vilek 一 60細(xì)菌自動(dòng)分析系統(tǒng)鑒定到種，系統(tǒng)自動(dòng)進(jìn)行生物分型。但該法存在操作步驟復(fù)雜，細(xì) 胞培養(yǎng)時(shí)間長(zhǎng)等明顯缺陷，并不適合臨床應(yīng)用。更重要的是，其中的莢膜腫脹實(shí)驗(yàn)等僅限于 對(duì)有莢膜的菌株進(jìn)行鑒定，而無(wú)莢膜型（NTHi)則全部漏檢。
[0007] 因此，目前建立具高靈敏度、高特異性的人流感嗜血桿菌抗原快速檢測(cè)法以滿足 臨床的檢測(cè)需求就顯得非常必要了。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 本發(fā)明針對(duì)【背景技術(shù)】中現(xiàn)存的幾種人流感嗜血桿菌在檢測(cè)方式中遇到的技術(shù)瓶 頸，提出了一種具有操作簡(jiǎn)便、檢測(cè)快速、可定量及高靈敏度等優(yōu)點(diǎn)的人流感嗜血桿菌量子 點(diǎn)免疫層析檢測(cè)卡及其制備方法和應(yīng)用。
[0009] 本發(fā)明的目的是通過(guò)以下技術(shù)手段來(lái)實(shí)現(xiàn)的：
[0010] 一種人流感嗜血桿菌量子點(diǎn)免疫層析檢測(cè)卡，其特征在于：所述人流感嗜血桿菌 量子點(diǎn)免疫層析檢測(cè)卡包括底板、樣品墊、結(jié)合墊、檢測(cè)層以及吸水墊；所述結(jié)合墊包被有 量子點(diǎn)標(biāo)記的抗人流感嗜血桿菌納米探針；所述檢測(cè)層是由帶有一條檢測(cè)線及一條質(zhì)控線 的固相硝酸纖維素膜構(gòu)成；所述檢測(cè)線包被有鼠抗人流感嗜血桿菌P6蛋白多克隆抗體；所 述質(zhì)控線包被有抗兔IgG;所述檢測(cè)層粘貼在底板上；所述結(jié)合墊以及吸水墊分別設(shè)置在 檢測(cè)層兩端部的上方且與檢測(cè)層部分重疊后分別與檢測(cè)層以及底板粘貼在一起；所述樣品 墊設(shè)置在結(jié)合墊上方且與結(jié)合墊部分重合后分別與結(jié)合墊及底板粘貼在一起。
[0011] 作為優(yōu)選，本發(fā)明所采用的量子點(diǎn)是羧基化兩親聚合物修飾的水溶性CdSe/ZnS 量子點(diǎn)。
[0012] 作為優(yōu)選，本發(fā)明所采用的抗兔IgG包括但不限于羊抗兔IgG。
[0013] 作為優(yōu)選，本發(fā)明所采用的檢測(cè)層長(zhǎng)2cm，所述檢測(cè)層粘貼在長(zhǎng)度是6. 6-7. 7cm的 底板表面中間段；所述檢測(cè)層與粘貼在檢測(cè)層以及底板上的且長(zhǎng)度是2. 5_3cm的吸水墊重 疊0. 2-0. 4cm;所述檢測(cè)層與粘貼在檢測(cè)層以及底板上的且長(zhǎng)度是0. 5-0. 8cm的結(jié)合墊重 疊0. 2-0. 4cm;所述結(jié)合墊與粘貼在結(jié)合墊以及底板上的長(zhǎng)度是2. 5cm的樣品墊重疊0. 2- 0. 4cm;所述檢測(cè)線與質(zhì)控線的間距是0. 5-0. 8cm;所述底板的寬度是0. 3-0. 5cm。
[0014] 作為優(yōu)選，本發(fā)明所采用的吸水墊是吸水濾紙；所述底板是PVC板。
[0015] -種基于上述的人流感嗜血桿菌量子點(diǎn)免疫層析檢測(cè)卡的制備方法，其特征在 于：所述制備方法包括以下步驟：
[0016] 1)結(jié)合墊的制備：
[0017] 1. 1)重組P6_His融合蛋白的制備、純化：
[0018] 1. 1. 1)對(duì)人流感嗜血桿菌表面蛋白P6進(jìn)行生物信息學(xué)分析，獲取其胞外結(jié)構(gòu)域 中抗原表位最為豐富的肽段；
[0019] 1. 1. 2)找到步驟1. 1. 1)中所得到肽段對(duì)應(yīng)的基因編碼序列，并在序列的5'端及 3'端引入酶切位點(diǎn)并化學(xué)合成全基因序列，同時(shí)標(biāo)記記為P6;其序列參見(jiàn)序列表；
[0020] 1. 1.3)將步驟1. 1.2)中所得到的P6按分子生物學(xué)方法克隆入表達(dá)載體 pET-28a(+)后轉(zhuǎn)入大腸桿菌中表達(dá)重組P6-His融合蛋白；所述重組P6-His融合蛋白以可 溶性表達(dá)方式存在于菌體中；
[0021] 1. 1. 4)用鎳柱純化步驟1. 1. 3)所得到的重組蛋白，SDS-PAGE檢測(cè)其純度后，以 Bradford法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度，調(diào)整蛋白濃度為0. 2mg/mL后備用；
[0022] 1. 2)兔及鼠抗人流感嗜血桿菌P6蛋白多克隆抗體IgG的制備：
[0023] 1. 2. 1)以步驟1. 1. 4)中所得到的重組P6_His融合蛋白為完全抗原，分別免疫新 西蘭大白兔及豚鼠；分別制備兔抗人流感嗜血桿菌P6蛋白抗血清及鼠抗人流感嗜血桿菌 P6蛋白抗血清；所述兔抗人流感嗜血桿菌P6蛋白抗血清及鼠抗人流感嗜血桿菌P6蛋白抗 血清的間接ELISA效價(jià)均大于1X105 ;
[0024] 1. 2. 2)采用ProteinG親和層析柱分別純化兔抗人流感嗜血桿菌P6蛋白抗血清 及鼠抗人流感嗜血桿菌P6蛋白抗血清中的多克隆抗體IgG;
[0025] 1. 2. 3)用凱基Braford蛋白含量檢測(cè)試劑盒測(cè)定步驟1. 2. 2)所得到的二種多克 隆抗體IgG的濃度，將其蛋白濃度均調(diào)整為3mg/mL后備用；
[0026] 1. 3)量子點(diǎn)標(biāo)記的抗人流感嗜血桿菌納米探針的制備與純化：
[0027] 1. 3. 1)向微量離心管中依次加入2nmol量子點(diǎn)、300nmolN-羥基琥珀酰亞胺和 300nmol碳二亞胺，以磷酸鹽緩沖液定容為2ml，于旋轉(zhuǎn)混合儀中，以15rpm/min，37°C反應(yīng) 30min后，透析去除過(guò)量的N-羥基琥珀酰亞胺以及碳二亞胺；所述磷酸鹽緩沖液中各組分 含量分別為：2. 9g/L磷酸氫二鈉、0. 295g/L磷酸二氫鈉以及2g/L氯化鈉，所述磷酸鹽緩沖 液的pH= 7. 3 ;
[0028] 1. 3. 2)在活化的量子點(diǎn)中，加入4-12nmol的步驟1. 2)所制備的兔抗人流感嗜血 桿菌P6蛋白多克隆抗體IgG，避光反應(yīng)2h，加入端氨基化聚乙二醇至終濃度為1. 5%，封閉 未反應(yīng)的活化羧基位點(diǎn)，繼續(xù)避光反應(yīng)lh;用0. 2μπιPES濾器過(guò)濾除去抗體聚集物，然后 將濾液轉(zhuǎn)移到50000MW超濾離心管中，以8000g離心力在4°C下離心15min，除去未發(fā)生偶 聯(lián)反應(yīng)的抗體和反應(yīng)中的副產(chǎn)物；收集超濾管濾膜上層量子點(diǎn)-抗體偶聯(lián)物溶液，溶于2ml 磷酸鹽洗滌液中，再將此溶液轉(zhuǎn)移到50000MW超濾離心管中，以8000g離心力在4°C下離心 15min，收集超濾管濾膜上層量子點(diǎn)-抗體偶聯(lián)物溶液，溶于lml磷酸鹽保存液中，至此制得 量子點(diǎn)標(biāo)記的抗人流感嗜血桿菌納米探針；
[0029] 所述磷酸鹽洗滌液中各組分含量分別為：2. 9g/L磷酸氫二鈉、0. 295g/L磷酸二氫 鈉、2g/L氯化鈉、5ml/L吐溫-20以及l(fā)g/L疊氮鈉；所述磷酸鹽洗滌液的pH= 7. 3 ;所述磷 酸鹽保存液中各組分含量分別為：2. 9g/L磷酸氫二鈉、0. 295g/L磷酸二氫鈉、2g/L氯化鈉、 10g/LBSA以及l(fā)g/L疊氮鈉；所述磷酸鹽保存液的pH= 7. 3 ;
[0030] 1. 4)量子點(diǎn)標(biāo)記抗體的負(fù)載：
[0031] 將聚酯纖維膜浸入步驟1. 3. 2)所得到的量子點(diǎn)標(biāo)記的抗人流感嗜血桿菌納米探 針溶液中l(wèi)h，取出，25°C干燥后4°C密封保存?zhèn)溆?，至此制得結(jié)合墊；
[0032] 2)樣品墊的制備：
[0033] 取玻璃纖維素膜一張，將玻璃纖維素膜在樣品墊處理液中浸泡至少3h以上，再置 于生物安全柜內(nèi)37°C通風(fēng)干燥后，25°C密封干燥保存；至此制得樣品墊；
[0034] 所述樣品墊處理液中各組分含量分別為：2. 9g/L磷酸氫二鈉、0. 295g/L磷酸二氫 鈉、2g/L氯化鈉、20g/L牛血清白蛋白（BSA)、10ml/L吐溫-20、20g/L蔗糖以及5g/L聚乙烯 吡咯烷酮，所述樣品墊處理液的pH= 7. 3 ;
[0035] 3)檢測(cè)層的制備：
[0036] 3. 1)將步驟1. 2)制備的鼠抗人流感嗜血桿菌P6蛋白多克隆抗體與抗兔IgG用磷 酸鹽緩沖液均調(diào)整至終濃度為〇. 5-2. 5mg/mL后備用；所述磷酸鹽緩沖液中各組分含量分 別為：2. 9g/L磷酸氫二鈉、0. 295g/L磷酸二氫鈉以及2g/L氯化鈉，所述磷酸鹽緩沖液的pH =7. 3 ；
[0037] 3. 2)將稀釋好的鼠抗人流感嗜血桿菌P6蛋白多克隆抗體裝入BI0D0T劃膜儀噴頭 中，設(shè)置0. 8-2. 5μΙ/cm的量噴于硝酸纖維素膜上，形成檢測(cè)線；將稀釋好的抗兔IgG裝入 BI0D0T劃膜儀噴頭中，設(shè)置0. 8-2. 5μΙ/cm的量按照與檢測(cè)線0. 5-0. 8cm的間隔噴于硝酸 纖維素膜上作為質(zhì)控線；
[0038] 3. 3)將噴有檢測(cè)線以及質(zhì)控線的硝酸纖維素膜在37°C干燥2h，4°C密封干燥保 存；至此制得檢測(cè)層；
[0039] 4)底板的制備
[0040] 將PVC材質(zhì)的底板按實(shí)際要求裁剪后備用；
[0041] 5)吸水墊