的制備
[0042] 將吸水濾紙按實(shí)際要求裁剪后備用；
[0043] 6)人流感嗜血桿菌量子點(diǎn)免疫層析檢測(cè)卡的組裝：
[0044] 6. 1)將步驟4)所制備得到的底板上的粘性保護(hù)膜揭掉；
[0045] 6. 2)將步驟3)所制備得到的檢測(cè)層粘貼到底板的中部區(qū)域，并抹平膜面；
[0046] 6. 3)將步驟5)所制備得到的吸水墊組裝到底板上，使吸水墊的左邊與檢測(cè)層有 部分重疊，同時(shí)將其右邊緣與底板的右邊緣對(duì)齊粘好并抹平；
[0047] 6. 4)將步驟1)所制備得到的結(jié)合墊按部分重疊的方式重疊于硝酸纖維素膜的左 邊緣處，同時(shí)將結(jié)合墊粘于底板上；
[0048] 6. 5)將步驟2)所制備得到樣品墊則按部分重疊的方式重疊于結(jié)合墊的左邊緣 處，另一邊與底板的左邊緣對(duì)齊，粘于底板上并抹平；
[0049] 6. 6)將組裝好的人流感嗜血桿菌量子點(diǎn)免疫層析檢測(cè)卡進(jìn)行裁剪，4°C密封干燥 避光保存；
[0050] 所述步驟6.1)至步驟6.6)均是在生物安全柜內(nèi)進(jìn)行操作。
[0051] 作為優(yōu)選，本發(fā)明所采用的步驟1. 3. 2)中加入6nmol的步驟1. 2)所制備的兔抗 人流感嗜血桿菌P6蛋白多克隆抗體IgG;
[0052] 作為優(yōu)選，本發(fā)明所采用的步驟3. 1)中將步驟1. 2)制備的鼠抗人流感嗜血桿菌 P6蛋白多克隆抗體與抗兔IgG用磷酸鹽緩沖液調(diào)整至終濃度分別為1. 5-2.Omg/mL以及 0. 5-1. 5mg/mL；
[0053] 作為優(yōu)選，本發(fā)明所采用的步驟3. 2)中，將稀釋好的鼠抗人流感嗜血桿菌P6蛋白 多克隆抗體裝入BI0D0T劃膜儀噴頭中，設(shè)置1. 0-2. 0μΙ/cm的量噴于硝酸纖維素膜上，形 成檢測(cè)線；將稀釋好的抗兔IgG裝入BI0D0T劃膜儀噴頭中，設(shè)置1. 0-2. 0μΙ/cm的量按照 與檢測(cè)線0. 5-0. 8cm的間隔噴于硝酸纖維素膜上作為質(zhì)控線。
[0054] -種基于上述的人流感嗜血桿菌量子點(diǎn)免疫層析檢測(cè)卡作為非診斷性檢測(cè)人流 感嗜血桿菌的應(yīng)用。
[0055] -種基于上述的人流感嗜血桿菌量子點(diǎn)免疫層析檢測(cè)卡的非診斷性檢測(cè)方法，其 特征在于：所述檢測(cè)方法包括以下步驟：
[0056] 1)將待檢樣品用500μ1的樣品處理液充分溶解后，取出120μL滴于檢測(cè)卡的樣 品墊上，15分鐘后于紫外燈下觀察檢測(cè)結(jié)果；所述樣品處理液中各組分含量分別為磷酸氫 二鈉2. 9g/L、磷酸二氫鈉0· 295g/L、Tritonx-10010mL/L以及氯化鈉2g/L，所述樣品處理 液的pH= 7.3 ;
[0057] 2)若待檢樣品中含有人流感嗜血桿菌抗原，則與結(jié)合墊中的量子點(diǎn)標(biāo)記的抗人流 感嗜血桿菌納米探針結(jié)合，通過(guò)層析作用先與硝酸纖維素膜上的鼠抗人流感嗜血桿菌P6 蛋白多克隆抗體結(jié)合后在紫外線激發(fā)下在檢測(cè)線處會(huì)形成肉眼可見(jiàn)的一條熒光檢測(cè)線，未 結(jié)合完的量子點(diǎn)標(biāo)記抗體繼續(xù)層析與抗兔IgG結(jié)合后在紫外線激發(fā)下形成肉眼可見(jiàn)的第 二條熒光質(zhì)控線；
[0058] 若待檢樣品中無(wú)人流感嗜血桿菌抗原，則僅出現(xiàn)一條熒光質(zhì)控線；若熒光質(zhì)控線 未出現(xiàn)，則該檢測(cè)卡失效。
[0059] 作為優(yōu)選，本發(fā)明所采用的待檢樣品是包括但不限于咽拭子。
[0060] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下優(yōu)點(diǎn)：
[0061] 1、本發(fā)明的檢測(cè)人流感嗜血桿菌抗原的方法是將免疫層析與量子點(diǎn)標(biāo)記技術(shù)綜 合起來(lái)，利用本發(fā)明制備的高效價(jià)、高特異性多克隆抗體，通過(guò)激發(fā)熒光來(lái)對(duì)樣品進(jìn)行檢 測(cè)，具有靈敏度高的特點(diǎn)（其對(duì)人流感嗜血桿菌的檢測(cè)底線為2X104CFU/ml)，用其對(duì)臨床 樣品的檢測(cè)結(jié)果與目前對(duì)該病原體的檢測(cè)"金標(biāo)準(zhǔn)"-培養(yǎng)法的相比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
[0062] 2、本發(fā)明所用的抗體均是識(shí)別人流感嗜血桿菌特異性P6抗原胞外保守區(qū)的多克 隆抗體，其特異性高，同時(shí)其較目前最廣泛使用的單克隆抗體而言制備成本低廉，因此，本 發(fā)明檢測(cè)成本較低。
[0063] 3、由于本發(fā)明首次以人流感嗜血桿菌所獨(dú)有的外膜蛋白P6作為抗原標(biāo)靶，而該 抗原不僅存在于所有類型的流感嗜血桿菌細(xì)胞表面，包括有莢膜及無(wú)莢膜型，且保守性高 (菌株間蛋白質(zhì)保守性為100% )，屬于流感嗜血桿菌特異性抗原，因此該檢測(cè)卡可高度特 異性的檢測(cè)所有類型人流感嗜血桿菌的感染。而市場(chǎng)上目前未見(jiàn)任何一種與本檢測(cè)卡一樣 能快速檢測(cè)所有類型人流感嗜血桿菌的工具存在。
[0064] 4、本發(fā)明檢測(cè)方法簡(jiǎn)單，檢測(cè)快速，易于判定，結(jié)果判定在20分鐘內(nèi)完成，既可以 用紫外檢測(cè)儀進(jìn)行定性檢測(cè)，亦可結(jié)合CCD掃描等技術(shù)進(jìn)行定量檢測(cè)，檢測(cè)成本低廉，克服 了現(xiàn)有技術(shù)（如ELISA)檢測(cè)成本高、操作復(fù)雜繁瑣、耗時(shí)長(zhǎng)、且必需專業(yè)人員才能操作的不 足。
[0065] 5、由于檢測(cè)卡檢測(cè)的是人流感嗜血桿菌抗原而非抗體（抗體的出現(xiàn)需要感染幾 天至幾周以后），故該方法在人流感嗜血桿菌的早期臨床診斷和防治、病原體亞型鑒別、流 行病學(xué)調(diào)查等方面具有很高的實(shí)用價(jià)值。
[0066] 6、本發(fā)明檢測(cè)方法所用的臨床樣本為呼吸道分泌物如痰液等，而非血液，可免除 嬰幼兒患者抽血檢查的痛苦與家長(zhǎng)的心理負(fù)擔(dān)，故較易于推廣。
【附圖說(shuō)明】
[0067] 圖1是本發(fā)明所提供檢測(cè)卡的縱向剖面結(jié)構(gòu)示意圖；
[0068] 圖2是本發(fā)明所提供檢測(cè)卡的在完成組裝后的結(jié)構(gòu)示意圖；
[0069] 其中：
[0070] 1-樣品塾；2_結(jié)合塾；3_檢測(cè)層；4_檢測(cè)線；5_質(zhì)控線；6_吸水塾；7_底板。
【具體實(shí)施方式】
[0071] 本發(fā)明的工作原理是：本發(fā)明是在免疫層析測(cè)定法（雙抗體夾心）的前提下，以 多克隆抗體為基礎(chǔ)，采用量子點(diǎn)標(biāo)記探針技術(shù)，通過(guò)量子點(diǎn)標(biāo)記技術(shù)研制檢測(cè)人流感嗜血 桿菌抗原的量子點(diǎn)免疫層析檢測(cè)卡。首先是兔抗人流感嗜血桿菌P6蛋白多克隆抗體和鼠 抗人流感嗜血桿菌P6蛋白多克隆抗體的制備、純化以及量子點(diǎn)標(biāo)記，其次為噴膜，然后將 檢測(cè)卡各組成成分進(jìn)行組裝，最后制備人流感嗜血桿菌量子點(diǎn)免疫層析檢測(cè)卡。本發(fā)明所 提供的檢測(cè)卡具有敏感、快速和特異性好等特點(diǎn)，并且可定量檢測(cè)，能進(jìn)行樣品的高通量篩 查，具有較好的市場(chǎng)應(yīng)用前景。
[0072] 如附圖1所示，本發(fā)明所提供了一種人流感嗜血桿菌量子點(diǎn)免疫層析檢測(cè)卡，包 括樣品墊1、結(jié)合墊2、檢測(cè)層3、吸水墊6及底板7組成。結(jié)合墊2上包被有量子點(diǎn)標(biāo)記的 抗人流感嗜血桿菌納米探針；檢測(cè)層3是噴有檢測(cè)線4以及質(zhì)控線5的固相硝酸纖維素膜 簡(jiǎn)稱NC膜；檢測(cè)線4包被有鼠抗人流感嗜血桿菌P6蛋白多克隆抗體；質(zhì)控線5包被有抗 兔IgG;量子點(diǎn)為羧基化兩親聚合物修飾的水溶性CdSe/ZnS量子點(diǎn)；吸水墊6材質(zhì)為吸水 濾紙；底板7材質(zhì)為PVC。
[0073] 其具體結(jié)構(gòu)是：檢測(cè)層長(zhǎng)2cm，檢測(cè)層粘貼在長(zhǎng)度是6. 6-7. 7cm的底板表面中間 段；檢測(cè)層與粘貼在檢測(cè)層以及底板上的且長(zhǎng)度是2. 5-3cm的吸水墊重疊0. 2-0. 4cm;檢測(cè) 層與粘貼在檢測(cè)層以及底板上的且長(zhǎng)度是0. 5-0. 8cm的結(jié)合墊重疊0. 2-0. 4cm;結(jié)合墊與 粘貼在結(jié)合墊以及底板上的長(zhǎng)度是2. 5cm的樣品墊重疊0. 2-0. 4cm;檢測(cè)線與質(zhì)控線間距 是0. 5-〇. 8cm;底板的寬度是0. 3-〇. 5cm。
[0074] 其中，上述參數(shù)優(yōu)選方案是：檢測(cè)層3長(zhǎng)2cm，粘貼在底板7長(zhǎng)7. 3cm表面中間段， 此檢測(cè)層右端與粘貼在底板7右末端的吸水墊6長(zhǎng)3cm重疊0.2cm，其另一端與結(jié)合墊2長(zhǎng) 0. 6cm重疊0. 3cm;結(jié)合墊2則與粘貼在底板7左端的樣品墊（1)長(zhǎng)2. 5cm重疊0. 3cm;檢 測(cè)層3上的檢測(cè)線4及質(zhì)控線5間距0. 7cm。整條檢測(cè)卡的寬度為0. 4cm。
[0075] 制備上述人流感嗜血桿菌量子點(diǎn)免疫層析檢測(cè)卡的方法，其主要步驟包括：
[0076]一、結(jié)合墊的制備
[0077] (1)重組P6_His融合蛋白的制備、純化：
[0078] 對(duì)人流感嗜血桿菌P6蛋白進(jìn)行生物信息學(xué)分析，獲取人流感嗜血桿菌P6蛋白胞 外結(jié)構(gòu)域中抗原表位最為豐富的肽段，找到其對(duì)應(yīng)的基因序列；在此二基因序列的5'端及 3'端分別引入酶切位點(diǎn)并分別化學(xué)合成全基因序列，同時(shí)標(biāo)記記為P6。其基因序列參見(jiàn)序 列表。將該基因序列按常規(guī)方法克隆入表達(dá)載體pET-28a(+)后表達(dá)重組P6-His融合蛋白。 此融合蛋白以可溶性表達(dá)形式存在于基因工程菌體中。用鎳柱純化基因工程菌菌體中的重 組P6-His融合蛋白，SDS-PAGE檢測(cè)其純度后，再以Bradford法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度，調(diào)整蛋白 濃度為〇·2mg/mL后備用；
[0079](2)兔及鼠抗人流感嗜血桿菌P6蛋白多克隆抗體IgG的制備：
[0080] 以純化的重組P6_His融合蛋白為完全抗原，按常規(guī)方法免疫新西蘭大白兔及豚 鼠，分別制備兔抗人流感嗜血桿菌P6蛋白抗血清及鼠抗人流感嗜血桿菌P6蛋白抗血清。 該二種抗血清的間接ELISA效價(jià)均大于1X105,用ProteinG親和層析柱分別純化二種抗 血清中的多克隆抗體IgG，用凱基Braford蛋白含量檢測(cè)試劑盒測(cè)定抗體濃度并均調(diào)整為 3mg/mL后備用。其中兔抗人流感嗜血桿菌P6蛋白多克隆抗體IgG用作量子點(diǎn)標(biāo)記試驗(yàn)； 鼠抗人流感嗜血桿菌P6蛋白多克隆抗體IgG用作檢測(cè)線的包被。
[0081] (3)量子點(diǎn)標(biāo)記的抗人流感嗜血桿菌納米探針的制備與純化
[0082] 其操作步驟如下：向微量離心管中依次加入2nmol量子點(diǎn)、300nmolN-羥基琥拍 酰亞胺（sulfo-NHS)和300nmol碳二亞胺（EDC)，以磷酸鹽緩沖液（2.9g/L磷酸氫二鈉， 0. 295g/L磷酸二氫鈉，2g/L氯化鈉，pH7. 3)定容為2ml，于旋轉(zhuǎn)混合儀中，以15rpm/min, 37°C反應(yīng)30min后，透析去除過(guò)量的活化劑（sulfo-NHS與EDC)。在活化的量子點(diǎn)中，加入 4-12nmol(優(yōu)選為6nmol)的步驟（2)所制備的兔抗人流感嗜血桿菌P6蛋白多克隆抗體 IgG，避光反應(yīng)2h，加入端氨基化聚乙二醇（PEG2000-NH2)至終濃度為1.5%，封閉未反應(yīng)的 活化羧基位點(diǎn)，繼續(xù)避光反應(yīng)lh。用0. 2μmPES濾器過(guò)濾除去抗體聚集物，然后將濾液轉(zhuǎn) 移到50000MW超濾離心管中，以8000g離心力在4°C下離心15min，除去未發(fā)生偶聯(lián)反應(yīng)的 抗體和反應(yīng)中的副產(chǎn)物。收集超濾管濾膜上層量子點(diǎn)-抗體偶聯(lián)物溶液，溶于2ml磷酸鹽 洗滌液（2. 9g/L磷酸氫二鈉，0. 295g/L磷酸二氫鈉，2g/L氯化鈉，5ml/L吐溫-20,lg/L疊 氮鈉，ρΗ7· 3)中，再將此溶液轉(zhuǎn)移到50000MW超濾離心管中，以8000g離心力在4°C下離心 15min，收集超濾管濾膜上層量子點(diǎn)-抗體偶聯(lián)物溶液，溶于lml磷酸鹽保存液（2. 9g/L磷 酸氫二鈉，0. 295g/L磷酸二氫鈉，2g/L氯化鈉，10g/LBSA，lg/L疊氮鈉，pH7. 3)中，制得量 子點(diǎn)標(biāo)記的抗人流感嗜血桿菌納米探針。
[0083] (4)量子點(diǎn)標(biāo)記抗體的負(fù)載
[0084] 將聚酯纖維膜浸入步驟（3)所得到的量子點(diǎn)標(biāo)記的抗人流感嗜血桿菌納米探針 溶液中l(wèi)h，取出，25°C干燥后裁成4cm*0. 6cm的規(guī)格后4°C密封保存?zhèn)溆?，至此?