海洋生物源多肽的高效液相色譜和凝膠滲透色譜分離純化方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種海洋生物活性多肽的分離純化方法，尤其涉及海洋生物源多肽的 高效液相色譜和凝膠滲透色譜分離純化方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 單環(huán)刺婦（Urechisunicinctus)，俗名海腸、海腸子，屬于婦蟲動物門、婦綱、無 管縊目、刺縊科。體粗大，長約100-300mm，寬約25-27mm，長200mm-250mm，體表滿布大小 不等的粒狀突起，吻圓錐形；腹剛毛1對，粗大；肛門周圍有一圈9-13條褐色尾剛毛。分布 于俄羅斯、日本、朝鮮和我國黃渤海沿岸，是我國北方沿海泥沙岸潮間帶下區(qū)及潮下帶淺水 區(qū)底棲生物的常見種。它個體肥大，肉味鮮美，體壁肌富含蛋白質(zhì)和多種人體必需氨基 酸。自古以來，在我國、日本和朝鮮沿海均作為名貴的海鮮食品，有較高的經(jīng)濟價值。人 們的傳統(tǒng)做法只食用其體壁，而廢棄內(nèi)臟，菜肴俗稱海腸子。
[0003] 單環(huán)刺縊提取的多肽有一定的抗腫瘤及提高小鼠免疫功能的作用，腫瘤的發(fā)生 是多種原因作用的結(jié)果，但最終都要涉及到癌基因的表達調(diào)控。不同的腫瘤產(chǎn)生時所需要 的酶等調(diào)控因子不同，選擇特異性小肽作小于腫瘤發(fā)生時所需的調(diào)控因子等，封閉其活性 位點，可防止腫瘤發(fā)生?，F(xiàn)在已發(fā)現(xiàn)很多腫瘤相關(guān)基因及腫瘤產(chǎn)生調(diào)控因子，篩選與這些靶 點特異結(jié)合的多肽，已成為尋找抗癌藥物的新熱點，值得一提的是，傳統(tǒng)的抗腫瘤藥物由于 缺乏對癌細胞的選擇性，往往在治療的同時產(chǎn)生不良反應(yīng)?？鼓[瘤活性多肽與此不同，在殺 傷腫瘤細胞的同時對免疫系統(tǒng)起保護作用。已有實驗證明單環(huán)刺縊多肽在體外抑制人肝癌 細胞生長，并可以增強小鼠免疫力，抑制小鼠S180肉瘤的生長。但由于近幾年由于捕撈 強度過大，野生資源已顯不足?，F(xiàn)今，我國也陸續(xù)開展了單環(huán)刺縊人工培育苗種的生產(chǎn)性研 究。本發(fā)明專利涉及到對單環(huán)刺縊內(nèi)臟進行酶解獲得降壓活性多肽，為單環(huán)刺縊多肽類活 性物質(zhì)的開發(fā)提供重要參考。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是針對上述的技術(shù)現(xiàn)狀提供一種具有較好的ACE抑 制活性的、源自單環(huán)刺縊的采用高效液相色譜制備的活性多肽的制備方法。
[0005] 該采用高效液相色譜制備的活性多肽的制備方法如下： 1) 選取單環(huán)刺縊內(nèi)臟，破碎處理后，用丙酮脫脂過夜，離心棄去上清，沉淀在35°C至 40°C下干燥后粉碎后得到單環(huán)刺縊內(nèi)臟粉； 2) 取步驟1)所述的單環(huán)刺縊內(nèi)臟粉按比例加入蒸餾水，于80°C的恒溫水浴鍋內(nèi)加熱 4h后，離心取上清液，得到的上清液濃縮后為樣品； 3) 取步驟2)所述的樣品按比例加入蒸餾水，然后調(diào)節(jié)pH6. 8,加入木瓜蛋白酶，在60 °C水浴中加熱，后用100°C水浴加熱lOmin至15min滅酶，在離心機中4500rpm離心20 min后取上清液，將該上清液采用胰蛋白酶水解2-4h，控制提取溫度為60 °C，pH:10 ; 4) 步驟3)提取完成后調(diào)pH至中性后100 °C水浴加熱10至15min滅酶，以 4500~6000rpm離心后取上清液； 5) 將步驟4)處理得到的上清液濃縮后，使用95%乙醇沉淀，使乙醇終濃度約為 70%~80%，于4 °C靜置5h至20h，然后將上清液濃縮冷凍干燥得到單環(huán)刺縊蛋白酶解產(chǎn)物； 6) 生物活性肽的分離純化：將所述的單環(huán)刺縊蛋白酶解產(chǎn)物采用SephadexG-15凝膠 色譜柱層析，高效液相色譜分離純化得到Gln-Pro-Met-Thr-Phe。
[0006]SephadexG-15凝膠色譜柱層析含有如下步驟： 取所述的單環(huán)刺婦蛋白酶解產(chǎn)物，用蒸餾水溶解成1〇〇mg/ml溶液，SephadexG-15凝 膠色譜柱2.0cmX100cm進行分離純化，流動相為蒸餾水，洗脫速度為0.5ml/min，收集各 峰。
[0007] 高效液相色譜的分離純化具有如下步驟： 用高效液相色譜進一步分離純化。色譜條件如下：色譜柱采用規(guī)格為250mmX4. 6 _，5ym的反相C18鍵合硅膠柱；流動相：A水，B乙腈；收集主要色譜峰，凍干備用得到 Gln-Pro-Met-Thr-Phe。
[0008] 步驟2)所述的比例為質(zhì)量比1 :10至1 :50或質(zhì)量體積比50g:500mL至50g: 2500mL〇
[0009] 步驟3)所述的比例為質(zhì)量比1 :1至1 :5或質(zhì)量體積比50g:50mL至50g:2500mL。
[0010] 步驟3)所述的木瓜蛋白酶占樣品溶液質(zhì)量分數(shù)的2%。
[0011] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)點在于：提取、純化工藝較先進、快速、準確度高，制 得的多肽ACE抑制活性顯著。
[0012]
【附圖說明】
[0013]圖 1 是本發(fā)明Gln-Pro-Met-Thr-Phe的質(zhì)譜（ESI-MS)圖； 圖2是本發(fā)明Gln-Pro-Met-Thr-Phe的結(jié)構(gòu)式； 圖3是本發(fā)明凝膠純化圖； 圖4是本發(fā)明液相純化圖。
【具體實施方式】
[0014] 以下結(jié)合附圖實施例對本發(fā)明作進一步詳細描述。
[0015] 實施例：單環(huán)刺縊內(nèi)臟來源的生物活性肽，具體為具有如下序列的短肽： Gln-Pro-Met-Thr-Phe。
[0016] 其制備步驟如下：（1)內(nèi)臟剪碎后用組織攪碎器攪成勻漿。丙酮攪拌脫脂過夜，離 心棄去上清，沉淀在40°C的鼓風(fēng)干燥箱內(nèi)烘干過夜后粉碎。取單環(huán)刺縊內(nèi)臟粉按1:20 (質(zhì) 量體積比，50g:1000mL)加入蒸餾水，于80°C的恒溫水浴鍋內(nèi)加熱4h后，離心取上清液， 重復(fù)三次上述步驟，最終得到的上清液為實驗樣品，濃縮。將樣品按1:5 (質(zhì)量體積比，10 g:50mL)加入蒸餾水，然后調(diào)節(jié)pH6. 8,加入2% (質(zhì)量分數(shù)）木瓜蛋白酶在60 °C水浴中 加熱4h，后用100°C水浴加熱15min滅酶，在離心機中4500rpm離心20min后取上清 液。接著采用胰蛋白酶水解4h，提取溫度60 °C，pH:10,加酶量0.5% (質(zhì)量分數(shù))。提取 完成后調(diào)pH至中性后100°C水浴加熱15min滅酶，在離心機中4500rpm離心20min后取 上清液。減壓濃縮至原體積的1/20后，使用95%乙醇沉淀，使乙醇終濃度約為80%，于4°C 冰箱中放置過夜。上清濃縮冷凍干燥。
[0017] (2)生物活性肽的分離純化；將單環(huán)刺婦蛋白酶解產(chǎn)物采用Sephadex G-15凝膠 色譜柱層析，高效液相色譜分離純化得到一個新的五肽，體外活性顯示其具有較好的ACE 抑制活性。
[0018] 生物活性肽的分離純化包括如下步驟： (1)