一種利用高效液相色譜法分離檢測蘭瑞肽的方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及肽化合物的檢測方法，具體涉及用高效液相色譜法分離檢測蘭瑞肽的方法。主要解決現(xiàn)有流動相為三氟乙酸體系對蘭瑞肽分離中，分離度較低的技術(shù)問題。本發(fā)明方法包括以下步驟：1、高效液相色譜法所用的色譜柱中，固定相為混合模式色譜柱；2、流動相A為：磷酸三乙胺緩沖鹽溶液:高氯酸鈉緩沖鹽溶液:乙腈溶液的體積比=0.1:0.1:1；流動相B為：磷酸三乙胺緩沖鹽溶液:高氯酸鈉緩沖鹽水溶液:水的體積比=0.1:0.1:1；3、流動相A梯度范圍為10?80%；4、所述蘭瑞肽溶液的濃度為0.5?3mg/mL；5、取蘭瑞肽溶液利用高效液相色譜進(jìn)行蘭瑞肽的分離和檢測。本發(fā)明可以檢測出三氟乙酸體系無法檢測到的雜質(zhì)，從而可以更好的控制蘭瑞肽原料藥的質(zhì)量。
【專利說明】
一種利用高效液相色譜法分離檢測蘭瑞肽的方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001]本發(fā)明涉及肽化合物的檢測方法，具體涉及用高效液相色譜法分離檢測蘭瑞肽的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]蘭瑞肽是一種新型的生長抑素(ST)八肽類似物，它是許多內(nèi)分泌、神經(jīng)內(nèi)分泌、夕卜分泌和旁分泌機(jī)能的肽抑制劑。其序列為H-D-2-NAL-CYS-TYR-D-TRP-LYS-VAL-CYS-THR-NH2。生長抑素(SomatoStain，ST)可以抑制生長激素的釋放，可用于肢端肥大癥和生長激素型垂體腺瘤的治療，但由于天然生長抑素體內(nèi)半衰期非常短(I?7min)，且無器官特異性，停藥后易引起生長激素等分泌過度，長期應(yīng)用ST可導(dǎo)致腸道吸收不良和葡萄糖耐受性降低，因此ST的臨床作用一直受到限制，妨礙了其在臨床上的應(yīng)用。肢端肥大癥是由于生長激素過度生成而導(dǎo)致的一種罕見的疾病，臨床呈慢性進(jìn)展，主要表現(xiàn)為軟弱乏力，通常是由于生長激素(GH)分泌性垂體細(xì)胞腺瘤所致。如果GH的過度生成發(fā)生在青春期之前，會導(dǎo)致巨大癥，若發(fā)生在青春期之后，則疾病表現(xiàn)得較為隱匿。易見的疾病特征性表現(xiàn)為漸進(jìn)性的骨骼生長，手足增大，皮膚增厚，顏面粗糙。而如心臟肥大、高血壓、惡性睡眠呼吸暫停等這些威脅病人生命的情況則相對不易觀察到。
[0003]因此，人們致力于研究合成生長抑素類似物(Somatostatinanalogue,STA)。與天然ST相比，SAT具有作用相對單一、血漿半衰期長、作用持久、使用方便等優(yōu)點(diǎn)。這些生長抑素類似物有數(shù)百種之多，幾乎均為多肽，依據(jù)殘基個數(shù)為六肽、七肽、八肽、十四肽等。目前臨床應(yīng)用的主要是八肽，包括奧曲肽和蘭瑞肽。
[0004]蘭瑞肽在制備過程中，由于化學(xué)合成的多肽常常含有大量的雜質(zhì)，由于小部分雜質(zhì)與目的產(chǎn)物在結(jié)構(gòu)和理化性質(zhì)上十分相近，這些雜質(zhì)會嚴(yán)重影響蘭瑞肽的產(chǎn)品質(zhì)量。為了去除這些雜質(zhì)，通常采用高效液相色譜進(jìn)行純化，常用體系為三氟乙酸的水和乙腈進(jìn)行梯度洗脫，但是分離度不夠無法滿足要求。所以需要尋求更合適的方法來分離檢測蘭瑞肽的純度。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的在于提供一種采用采高效液相色譜法分離檢測蘭瑞肽的方法，主要解決現(xiàn)有流動相為三氟乙酸體系對蘭瑞肽分離中，分離度較低的技術(shù)問題。
[0006]為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的技術(shù)方案如下:
一種利用高效液相色譜法分離檢測蘭瑞肽的方法，其中包括:
1)高效液相色譜法所用的色譜柱中，固定相為混合模式色譜柱；
2)流動相A為:磷酸三乙胺緩沖鹽溶液:高氯酸鈉緩沖鹽溶液:乙腈溶液=0.1:0.1:1(V/V);流動相B為:磷酸三乙胺緩沖鹽溶液:高氯酸鈉緩沖鹽水溶液:水=0.1:0.1: 1CV/V);
3)流動相A梯度范圍為10-80%;
4)所述蘭瑞肽溶液的濃度為0.5-3mg/mL; 5)取蘭瑞肽溶液利用高效液相色譜進(jìn)行蘭瑞肽的分離和檢測。
[0007]更為優(yōu)選的方案是:所述固定相混合模式色譜柱為C18SAX、C18SCX、C18WCX中的一種。
[0008]更為優(yōu)選的方案是:所述高效液相色譜進(jìn)行蘭瑞肽的分離和檢測的方法，固定相混合模式為RPLC/IEX。
[0009]更為優(yōu)選的方案是:所述磷酸三乙胺緩沖鹽溶液摩爾濃度100M/L，pH2.9;高氯酸鈉緩沖鹽溶液摩爾濃度1M/L。
[0010]更為優(yōu)選的方案是:所述色譜柱，其流速為ImL /min，檢測波長為214nm，柱溫為40。。。
[0011]本發(fā)明的有益效果是:本發(fā)明采用采高效液相色譜法分離檢測蘭瑞肽的方法，
【申請人】在研究中意外發(fā)現(xiàn)，采用本發(fā)明的流動相體系，分離度大于1.5，而采用三氟乙酸流動相體系，分離度只有1.2左右，本發(fā)明可以檢測出三氟乙酸體系無法檢測到的雜質(zhì)，從而可以更好的控制蘭瑞肽的質(zhì)量，樣品純度可以達(dá)到大于99%。
【附圖說明】
[0012]圖1實施例1的高效液相色譜圖。
[0013]圖2實施例2的高效液相色譜圖。
[0014]圖3實施例3的高效液相色譜圖。
[0015]圖4實施例4的高效液相色譜圖。
【具體實施方式】
[0016]實施例1
儀器與條件:
采用賽默飛UltiMate 3000 RSLC高效液相色譜系統(tǒng);色譜柱為C18SCX(4.6*250mm)，柱溫為40°C ;檢測波長為214nm;流動相A為:磷酸三乙胺緩沖鹽溶液:高氯酸鈉緩沖鹽溶液:乙腈溶液=0.1:0.1:1 (V/V);流動相B為:磷酸三乙胺緩沖鹽溶液:高氯酸鈉緩沖鹽水溶液:水=0.1:0.1:1(V/V);所述磷酸三乙胺緩沖鹽溶液摩爾濃度100M/L，pH 2.9;高氯酸鈉緩沖鹽溶液摩爾濃度1M/L。流動相々%系統(tǒng)梯度為Omin時為20%，25min時為45%，35min時為80%，進(jìn)樣體積為10μ1。
[0017]實驗步驟:
取雜質(zhì)A適量，用水溶解制成lmg/ml樣品溶液，做為待測溶液。取待測溶液，按照上述色譜條件進(jìn)行高效液相色譜分析，其分析結(jié)果見圖1。由圖1可知雜質(zhì)A的色譜保留時間為25.12min0
[0018]實施例2
采用賽默飛UltiMate 3000 RSLC高效液相色譜系統(tǒng);色譜柱為C18SCX(4.6*250mm)，柱溫為40°C ;檢測波長為214nm;流動相A為:磷酸三乙胺緩沖鹽溶液:高氯酸鈉緩沖鹽溶液:乙腈溶液=0.1:0.1:1 (V/V);流動相B為:磷酸三乙胺緩沖鹽溶液:高氯酸鈉緩沖鹽水溶液:水=0.1:0.1:1(V/V);所述磷酸三乙胺緩沖鹽溶液摩爾濃度100M/L，pH 2.9;高氯酸鈉緩沖鹽溶液摩爾濃度1M/L。流動相々%系統(tǒng)梯度為Omin時為20%，25min時為45%，35min時為80%，進(jìn)樣體積為ΙΟμΙ。
[0019]實驗步驟:
取雜質(zhì)B適量，用水溶解制成lmg/ml樣品溶液，做為待測溶液。取待測溶液，按照上述的條件進(jìn)行高效液相色譜分析，其分析結(jié)果見圖2。
[0020]圖2可知雜質(zhì)B的色譜保留時間為13.44min。
[0021]實施例3 儀器與條件:
采用賽默飛UltiMate 3000 RSLC高效液相色譜系統(tǒng);色譜柱為C18SCX(4.6*250mm)，柱溫為40°C ;檢測波長為214nm;流動相A為:磷酸三乙胺緩沖鹽溶液:高氯酸鈉緩沖鹽溶液:乙腈溶液=0.1:0.1:1 (V/V);流動相B為:磷酸三乙胺緩沖鹽溶液:高氯酸鈉緩沖鹽水溶液:水=0.1:0.1:1(V/V);所述磷酸三乙胺緩沖鹽溶液摩爾濃度100M/L，pH 2.9;高氯酸鈉緩沖鹽溶液摩爾濃度1M/L。流動相々%系統(tǒng)梯度為Omin時為20%，25min時為45%，35min時為80%，進(jìn)樣體積為ΙΟμΙ。
[0022]實驗步驟:
取雜質(zhì)C適量，用水溶解制成lmg/ml樣品溶液，做為待測溶液。取待測溶液，按照上述色譜條件進(jìn)行高效液相色譜分析，其分析結(jié)果見圖3。由圖3可知雜質(zhì)C的色譜保留時間為25.12min0
[0023]實施例4 儀器與條件:
采用賽默飛UltiMate 3000 RSLC高效液相色譜系統(tǒng);色譜柱為C18SCX(4.6*250mm)，柱溫為40°C ;檢測波長為214nm;流動相A為:磷酸三乙胺緩沖鹽溶液:高氯酸鈉緩沖鹽溶液:乙腈溶液=0.1:0.1:1 (V/V);流動相B為:磷酸三乙胺緩沖鹽溶液:高氯酸鈉緩沖鹽水溶液:水=0.1:0.1:1(V/V);所述磷酸三乙胺緩沖鹽溶液摩爾濃度100M/L，pH 2.9;高氯酸鈉緩沖鹽溶液摩爾濃度1M/L。流動相々%系統(tǒng)梯度為Omin時為20%，25min時為45%，35min時為80%，進(jìn)樣體積為ΙΟμΙ。
[0024]實驗步驟:
取蘭瑞肽適量，用水溶解制成lmg/ml樣品溶液，做為待測溶液。取待測溶液雜質(zhì)Α、雜質(zhì)B、雜質(zhì)C及蘭瑞肽樣品，按照上述色譜條件進(jìn)行高效液相色譜分析，其分析結(jié)果見圖4。由圖4可知雜質(zhì)六、雜質(zhì)8、雜質(zhì)(:及蘭瑞肽樣品的色譜保留時間分別為25.2311^11、13.601^11、8.31min、23.29min。本方法條件可以很好的分離檢測雜質(zhì)和蘭瑞肽樣品，從而有效的控制蘭瑞肽的質(zhì)量。
【主權(quán)項】
1.一種利用高效液相色譜法分離檢測蘭瑞肽的方法，其特征在于:包括以下步驟: 1)高效液相色譜法所用的色譜柱中，固定相為混合模式色譜柱； 2)流動相A為:磷酸三乙胺緩沖鹽溶液:高氯酸鈉緩沖鹽溶液:乙腈溶液的體積比=0.1:0.1:1；流動相B為:磷酸三乙胺緩沖鹽溶液:高氯酸鈉緩沖鹽水溶液:水的體積比=0.1:0.1:1； 3)流動相A梯度范圍為10-80%; 4)所述蘭瑞肽溶液的濃度為0.5-3mg/mL; 5)取蘭瑞肽溶液利用高效液相色譜進(jìn)行蘭瑞肽的分離和檢測。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種利用高效液相色譜法分離檢測蘭瑞肽的方法，其特征在于:所述固定相混合模式色譜柱為C18SAX、C18SCX、C18WCX中的一種。3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種利用高效液相色譜法分離檢測蘭瑞肽的方法，其特征在于:所述固定相混合模式為RPLC/IEX。4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種利用高效液相色譜法分離檢測蘭瑞肽的方法，其特征在于:所述磷酸三乙胺緩沖鹽溶液摩爾濃度為100 M/L，pH 2.9;高氯酸鈉緩沖鹽溶液摩爾濃度1M/L。5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種利用高效液相色譜法分離檢測蘭瑞肽的方法，其特征在于:所述色譜柱，流速為I mL /min,檢測波長為214nm，柱溫為40°C。
【文檔編號】G01N30/02GK105842362SQ201610189425
【公開日】2016年8月10日
【申請日】2016年3月30日
【發(fā)明人】徐紅巖, 秦敬國
【申請人】吉爾生化（上海）有限公司, 上海吉爾多肽有限公司