本發(fā)明涉及一種毒品大麻的檢測方法，尤其涉及一種唾液樣本中痕量大麻的檢測方法及其使用的spr芯片，屬于檢測技術(shù)領(lǐng)域。

本發(fā)明中下列表達(dá)式的意義為：

thc：四氫大麻酚

klh：血藍(lán)蛋白

ova：雞卵白蛋白

背景技術(shù)：

大麻，其主要有效化學(xué)成份為thc，在吸食或口服后有精神和生理的活性作用，被認(rèn)為是世界三大毒品之一，社會危害性非常嚴(yán)重。

目前，針對大麻的檢驗(yàn)方法主要包括常規(guī)化學(xué)法、毛細(xì)管電泳法、薄層色譜法、高效液相色譜法、氣相色譜法和氣相色譜/質(zhì)譜法、免疫檢測法和生物檢測法等。其中體內(nèi)檢材分析是當(dāng)下法庭科學(xué)研究的熱點(diǎn)，尿液是檢測分析濫用毒品應(yīng)用最為廣泛的體內(nèi)檢材。但是，現(xiàn)有的尿檢技術(shù)不能滿足犯罪現(xiàn)場快速檢測的需求，在此背景下，尋求一種可達(dá)到快速、準(zhǔn)確、靈敏、經(jīng)濟(jì)的犯罪現(xiàn)場檢測方法成為了科學(xué)工作者研究重點(diǎn)。

表面等離子共振技術(shù)(spr)是從20世紀(jì)90年代發(fā)展起來的一種新技術(shù)，其應(yīng)用spr原理檢測生物傳感芯片上配位體與分析物之間的相互作用情況，廣泛應(yīng)用于各個領(lǐng)域，已經(jīng)成為生命科學(xué)和制藥領(lǐng)域的一種重要的研究工具。與傳統(tǒng)檢測方法相比，具有高靈敏度、響應(yīng)快、體積小、機(jī)械強(qiáng)度大、檢測過程快、實(shí)時檢測、能動態(tài)地監(jiān)測生物分子相互作用的全過程和實(shí)時數(shù)據(jù)、無需標(biāo)記樣品、保持分子活性、對復(fù)合物的定量測定不干擾反應(yīng)的平衡等優(yōu)點(diǎn)，成為了檢測大麻的較優(yōu)選擇。目前，關(guān)于使用表面等離子共振技術(shù)快速檢測大麻的方法尚未見報(bào)道。中國發(fā)明專利(公開號：cn102057277a)公開了一種大麻使用的檢測，該專利采用的是基于結(jié)合伴侶的非競爭性同源性免疫測定的時間分辯熒光共振能量轉(zhuǎn)移(tr-fret)分析；應(yīng)用基因工程方法制備能夠結(jié)合四氫大麻酚(thc)和抗-thc-抗體之間的免疫復(fù)合物的抗體片段。結(jié)合伴侶均須進(jìn)行熒光標(biāo)記，以便實(shí)現(xiàn)熒光計(jì)的tr-fret熒光檢測，檢測靈敏。另外，中國發(fā)明專利(公開號：cn101580544a)公開了一種膠體金標(biāo)記大麻、四氫大麻酚單抗免疫檢測板，該專利描述了thc-klh的制備；以thc-klh為抗原，采用弗氏佐劑法(freund’sadjuvant)免疫balb/c小鼠；用單克隆抗體技術(shù)制備雜交瘤；用thc-klh包被的酶聯(lián)板(elisa法)篩選出抗thc的雜交瘤細(xì)胞。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是針對現(xiàn)有技術(shù)中存在的上述問題，提出了一種利用唾液樣本就可達(dá)到快速、準(zhǔn)確的痕量大麻的檢測方法。

本發(fā)明的目的可通過下列技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)：一種唾液樣本中痕量大麻的檢測方法，所述檢測方法為利用spr芯片在spr儀上檢測待測樣本中的thc含量，所述spr芯片為抗thc抗體spr芯片，所述抗thc抗體spr芯片通過以下方法制得：

s1、將thc分別偶聯(lián)于klh和ova，得到thc-klh和thc-ova；

s2、用上述thc-klh和快速免疫佐劑免疫balb/c小鼠，用thc-ova檢測免疫小鼠抗thc的抗血清效價(jià)；

s3、取抗血清elisa效價(jià)在6k以上的小鼠，取脾臟的b淋巴細(xì)胞與小鼠骨髓瘤細(xì)胞sp2/0融合，經(jīng)單克隆篩選獲得抗血清elisa效價(jià)在10k以上的抗thc抗體雜交瘤細(xì)胞株；

s4、將上述雜交瘤細(xì)胞株接種至balb/c小鼠腹腔，從腹水中制備純化抗體；

s5、用本瓜蛋白酶將上述純化抗體水解成fc段和fab段，將fab段包被于3d環(huán)氧spr芯片，獲得抗thc抗體spr芯片。

在上述的一種唾液樣本中痕量大麻的檢測方法中，步驟s2中所述的快速免疫佐劑為quickantibody-mouse5w。

在上述的一種唾液樣本中痕量大麻的檢測方法中，步驟s2中所述的thc-ova檢測在thc-klh和快速免疫佐劑免疫balb/c小鼠5周后進(jìn)行，進(jìn)一步優(yōu)選5-8周后進(jìn)行，以便獲得更高效的亞克隆細(xì)胞株。

在上述的一種唾液樣本中痕量大麻的檢測方法中，步驟s3中所述的抗thc抗體雜交瘤細(xì)胞株的靈敏度為0.3-3ng。靈敏度為0.3-3ng的抗thc抗體雜交瘤細(xì)胞株通過以下方法篩選得到：將thc-ova點(diǎn)樣偶聯(lián)于spri羧基芯片，thc-ova的量分別為30ng、3ng、0.3ng、0.03ng；另外，同樣ova點(diǎn)樣，作為陰性對照。用表面等離子共振spri高通量生物分子間相互作用儀分析抗血清elisa效價(jià)在10k以上的株雜交瘤細(xì)胞株的抗體與芯片上的樣品結(jié)合反應(yīng)情況，篩選出檢測靈敏度能達(dá)到0.3ng-3ng的抗體雜交瘤細(xì)胞株。這個靈敏度使該抗體可應(yīng)用于檢測至少1周內(nèi)吸食大麻毒品人員的唾液樣品。

在上述的一種唾液樣本中痕量大麻的檢測方法中，步驟s4中所述的從腹水中制備純化抗體的具體過程為：從腹水中獲取抗體，然后用proteina柱吸附純化得到純化抗體。

本發(fā)明步驟s5在步驟s4用proteina柱吸附純化洗脫前，直接用本瓜蛋白酶將proteina-抗體柱上的抗體水解成fc段和fab段。由于proteina是和抗體的fc段特異性的，因而酶切后，fab段即可游離純化出來，收集、超濾脫鹽濃縮此抗thc的fab，凍干保存。

本發(fā)明將抗thc的fab段包被于3d環(huán)氧spr芯片，同時以正常小鼠igg的fab片段為對照，獲得抗thc抗體spr芯片，芯片上包括抗thc的fab段和正常小鼠igg的fab片段(陰性對照)。由于fab段的分子是完整抗體分子大小的1/3，加上沒有y空間位阻，可以大大提高fab段在芯片上包被的密度，至少比完整抗體提高3-5倍的有效密度，對于像毒品這類小分子可大大提高其檢測靈敏度。

本發(fā)明利用該抗thc的fab抗體spr芯片，在spr儀上檢測吸食大麻人員唾液樣本中的thc，取樣、檢測等操作更快速、方便，可在1-2分鐘左右得知檢測結(jié)果，檢測靈敏度至少可達(dá)到0.3-3ng/ml，具有快速、準(zhǔn)確、靈敏的效果。與目前常規(guī)的尿檢方法相比，本發(fā)明的優(yōu)勢在于：

(1)取樣方便，不受場地限制、降低被檢人員的不配合度并避免其作弊的可能性，使毒駕臨檢成為可能。

(2)可在1-2分鐘內(nèi)判讀陰性和陽性結(jié)果(尿檢至少3-8分鐘)。

(3)檢測準(zhǔn)確、靈敏度高，檢測閾值至少可達(dá)0.3-3ng/ml，可應(yīng)用于唾液快速實(shí)時檢測。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明同樣以thc-klh為抗原，但采用優(yōu)于傳統(tǒng)弗氏佐劑的新型快速免疫佐劑(quickantibody-mouse5w)法免疫balb/c小鼠；在篩選單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株時采用表面等離子共振spri高通量分析選株：將thc-ova點(diǎn)樣偶聯(lián)于spri羧基芯片，同樣ova點(diǎn)樣，作為陰性對照。用表面等離子共振spri高通量生物分子間相互作用儀分析抗血清elisa效價(jià)在10k以上的株雜交瘤細(xì)胞株的抗體與芯片上的樣品結(jié)合反應(yīng)情況，篩選出檢測靈敏度能達(dá)到0.3ng-3ng/ml的抗體雜交瘤細(xì)胞株。具有如下優(yōu)勢：1)以thc-klh為抗原免疫，用thc-ova篩選保證了抗thc特異性雜交瘤細(xì)胞株的篩選；2)spri篩選不僅可實(shí)現(xiàn)高通量、快速、準(zhǔn)確，而且更重要的是可以實(shí)時得到結(jié)合速率常數(shù)ka、解離速率常數(shù)kd、平衡解離常數(shù)kd等熱動力學(xué)參數(shù)，以及靈敏度，可快速得到高質(zhì)量的單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株。

而在檢測原理上，本發(fā)明采用的是不同的spr原理檢測，該法快速、靈敏、可實(shí)現(xiàn)無標(biāo)記檢測，不受復(fù)雜樣本中熒光雜質(zhì)的干擾，既可實(shí)現(xiàn)非競爭性免疫測定，也可實(shí)現(xiàn)非競爭性免疫測定。采用的抗體可以用高親和力的單抗直接用酶切獲得的fab片段。

本發(fā)明另一個目的在于提供上述唾液樣本中痕量大麻的檢測方法中使用的spr芯片，所述的spr芯片為抗thc抗體spr芯片，所述抗thc抗體spr芯片通過以下方法制得：

s1、將thc分別偶聯(lián)于klh和ova，得到thc-klh和thc-ova；

s2、用上述thc-klh和快速免疫佐劑免疫balb/c小鼠，用thc-ova檢測免疫小鼠抗thc的抗血清效價(jià)；

s3、取抗血清elisa效價(jià)在6k以上的小鼠，取脾臟的b淋巴細(xì)胞與小鼠骨髓瘤細(xì)胞sp2/0融合，經(jīng)單克隆篩選獲得抗血清elisa效價(jià)在10k以上的抗thc抗體雜交瘤細(xì)胞株；

s4、將上述雜交瘤細(xì)胞株接種至balb/c小鼠腹腔，從腹水中制備純化抗體；

s5、用本瓜蛋白酶將上述純化抗體水解成fc段和fab段，將fab段包被于3d環(huán)氧spr芯片，獲得抗thc抗體spr芯片。

在上述的一種唾液樣本中痕量大麻的檢測方法中使用的spr芯片中，步驟s2中所述的快速免疫佐劑為quickantibody-mouse5w。

在上述的一種唾液樣本中痕量大麻的檢測方法中使用的spr芯片中，步驟s2中所述的thc-ova檢測在thc-klh和快速免疫佐劑免疫balb/c小鼠5周后進(jìn)行，進(jìn)一步優(yōu)選5-8周后進(jìn)行。

在上述的一種唾液樣本中痕量大麻的檢測方法中使用的spr芯片中，步驟s3中所述的抗thc抗體雜交瘤細(xì)胞株的靈敏度為0.3-3ng。

在上述的一種唾液樣本中痕量大麻的檢測方法中使用的spr芯片中，步驟s4中所述的從腹水中制備純化抗體的具體過程為：從腹水中獲取抗體，然后用proteing柱吸附純化得到純化抗體。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明制備的spr傳感芯片是表面偶聯(lián)了抗thc的特異性抗體，可特異性結(jié)合復(fù)雜樣本中的thc分子，因而可應(yīng)用于唾液樣本中痕量大麻的檢測。同時，利用本發(fā)明制備的抗thc抗體spr芯片在spr儀上檢測吸食大麻人員唾液樣本中的甲基苯丙胺時，可達(dá)到快速、準(zhǔn)確、靈敏的效果，其檢測靈敏度至少可以達(dá)到0.3-3ng/ml，滿足犯罪現(xiàn)場快速檢測的需求。

附圖說明

圖1為篩選出檢測靈敏度能達(dá)到0.3ng的抗體雜交瘤細(xì)胞株的spr結(jié)果圖。

具體實(shí)施方式

以下是本發(fā)明的具體實(shí)施例，并結(jié)合附圖說明對本發(fā)明的技術(shù)方案作進(jìn)一步的描述，但本發(fā)明并不限于這些實(shí)施例。

實(shí)施例1：

將thc通過酚羥基分別偶聯(lián)于蛋白載體klh和ova，得到thc-klh和thc-ova。

用thc-klh和快速免疫佐劑quickantibody-mouse5w免疫balb/c小鼠15只，5周后用thc-ova檢測免疫小鼠抗甲基苯丙胺的抗血清效價(jià)；取能產(chǎn)生高特異性和高親和力抗體(抗血清elisa效價(jià)在6k以上)的小鼠5只。

分別取脾臟的b淋巴細(xì)胞與小鼠骨髓瘤細(xì)胞sp2/0融合，經(jīng)單克隆篩選獲得高特異性和高親和力的抗甲基苯丙胺抗體雜交瘤細(xì)胞株，elisa效價(jià)在10k以上100株。然后將thc-ova點(diǎn)樣偶聯(lián)于spri羧基芯片，thc-ova的量分別為30ng、3ng、0.3ng、0.03ng；另外，同樣ova點(diǎn)樣，作為陰性對照。用表面等離子共振spri高通量生物分子間相互作用儀分析初篩所得的100株雜交瘤細(xì)胞株的抗體與芯片上的樣品結(jié)合反應(yīng)情況，篩選出如圖1所示的檢測靈敏度能達(dá)到0.3ng的抗體雜交瘤細(xì)胞株。

將上述靈敏度能達(dá)到0.3ng的抗體雜交瘤細(xì)胞株接種至balb/c小鼠腹腔，從腹水中大量獲取抗體，并用proteing柱吸附純化。在洗脫前，直接用本瓜蛋白酶將proteing-抗體柱上的抗體水解成fc段和fab段。由于proteing是和抗體的fc段特異性的，因而酶切后，fab段即可游離純化出來，收集、超濾脫鹽濃縮此抗thc的fab段，并包被于3d環(huán)氧spr芯片，同明以正常小鼠igg的fab片段為對照，獲得抗thc抗體spr芯片。

應(yīng)用實(shí)施例1-5：

將實(shí)施例1制備得到的抗thc抗體spr芯片用于在spr儀上檢測4個分別吸食大麻1天、3天、5天、和7天后的人員、1個正常人員唾液樣本中的thc。

應(yīng)用對比例1-5：

將上述應(yīng)用實(shí)施例1-5同時進(jìn)行常規(guī)尿檢。

將應(yīng)用實(shí)施例1-5和應(yīng)用對比例1-5的檢測結(jié)果進(jìn)行對比，如表1所示。

表1：本發(fā)明與常規(guī)尿檢比較

從表1可知，與常規(guī)尿檢比，本發(fā)明更快速、準(zhǔn)確、靈敏。

在實(shí)施例及其替換方案中，篩選出的抗ma抗體雜交瘤細(xì)胞株的靈敏度還可以為0.4ng、0.5ng、0.6ng、0.7ng、0.8ng、0.9ng、1ng、1.1ng、1.2ng、1.3ng、1.4ng、1.5ng、1.6ng、1.7ng、1.8ng、1.9ng、2ng、2.1ng、2.2ng、2.3ng、2.4ng、2.5ng、2.6ng、2.7ng、2.8ng、2.9ng、3ng。

鑒于本發(fā)明方案實(shí)施例眾多，各實(shí)施例實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)龐大眾多，不適合于此處逐一列舉說明，但是各實(shí)施例所需要驗(yàn)證的內(nèi)容和得到的最終結(jié)論均接近。故而此處不對各個實(shí)施例的驗(yàn)證內(nèi)容進(jìn)行逐一說明，僅以實(shí)施例1和應(yīng)用實(shí)施例1-5作為代表說明本發(fā)明申請優(yōu)異之處。

本文中所描述的具體實(shí)施例僅僅是對本發(fā)明精神作舉例說明。本發(fā)明所屬技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員可以對所描述的具體實(shí)施例做各種修改或補(bǔ)充或采用類似的方式替代，但并不會偏離本發(fā)明的精神或者超越所附權(quán)利要求書所定義的范圍。

盡管對本發(fā)明已作出了詳細(xì)的說明并引證了一些具體實(shí)施例，但是對本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員來說，只要不離開本發(fā)明的精神和范圍可作各種變化或修正是顯然的。