一種獼猴桃莖黃酮類hplc指紋圖譜建立及其指紋圖譜的制作方法
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明屬于食品藥品管理領域，尤其涉及一種獼猴桃莖黃酮類HPLC指紋圖譜建 立及其指紋圖譜。
【背景技術】
[0002] 中藥指紋圖譜特指中藥樣本經光譜或色譜等現代分析技術得到的中藥各組分群 體特征的圖譜或圖像。中藥指紋圖譜作為一種綜合的、可量化的質量控制手段，目前，已被 眾多國際性醫(yī)藥機構所承認，已成為中成藥、天然藥物質量控制最有效的方法之一。美國食 品藥品管理局在1996年制定的《FDA關于植物制品的指南》中，要求對植物原料、植物藥中 間品和植物藥產品提供相應的指紋圖譜。英國草藥典、印度草藥典以及加拿大藥用及芳香 植物學會、德國藥用植物學會也接受色譜指紋圖譜。中國國家藥品監(jiān)督管理部門于2000年 發(fā)布了《中藥注射劑的指紋圖譜研究的技術要求（暫行）》，明確要求對新申報的中藥注射 劑和已上市的中藥注射劑實行指紋圖譜標準。中藥指紋圖譜經過了數十年的研究，使用了 包括紫外、紅外、氣相、高效液相、薄層、核磁共振、掃描電子顯微鏡、計算機圖像分析、電泳 技術、同功酶分析法、分子生物學技術、聚類分析技術等許多現代分析測試手段，為中藥的 物質鑒定和成分分析積累了大量的數據。但從中藥全面質量控制的角度看，還遠未達到有 效地反映和控制中藥的整體質量的目的。高效液相色譜（HPLC)指紋圖譜在國際上容易獲 得認可，包括美國、英國、法國、加拿大、德國、日本和印度在內的許多國家更愿意接受HPLC 指紋圖譜。因此，為中藥材建立相應的HPLC指紋圖譜，是現階段控制中藥內在質量的有效 手段。四川是獼猴桃最大的主產區(qū)之一，其根，藤梨根，作為解毒抗癌藥材在《江西草藥》、 《湖南藥物志》、《浙江民間常用草藥》、《福建民間草藥》、《閩東本草》、《陜西中草藥》中都有記 載，報道根中先后分離出糖類、三萜、黃酮等化合物；另具調查，由于根資源有限，目前中藥 材市場購進的藤梨根90%以莖充根。從獼猴桃栽培看，每年入冬有大量修枝，莖葉、疏花廢 棄；因此建立枝條、葉、花有效成分指紋圖譜，是既解決質量評價方式單一，不足以系統(tǒng)、完 整地表明藥材的整體質量，亟需探索更先進、更有效的質量控制手段問題；又能使獼猴桃資 源充分利用。
[0003] 目前獼猴桃枝條、葉、花黃酮類指紋圖譜未見報道。

【發(fā)明內容】

[0004] 本發(fā)明的目的在于提供一種獼猴桃莖黃酮類HPLC指紋圖譜建立及其指紋圖譜， 旨在得到的獼猴桃枝條、葉、花、藥材標準指紋圖譜，彌補現有藥材質量控制技術不夠完善 和科學的不足。
[0005] 本發(fā)明是這樣實現的，一種獼猴桃莖黃酮類HPLC指紋圖譜建立方法，所述的獼猴 桃莖黃酮類HPLC指紋圖譜建立方法采用高效液相色譜法，具體的步驟如下：
[0006] 步驟一，供試品溶液的制備，采用粉碎的陰干獼猴桃莖葉、花蕾、美味根，加入甲 醇，過濾和清洗，取續(xù)濾液作為供試品溶液；
[0007] 步驟二，對照品溶液的制備，精密稱取蘆丁對照品和槲皮苷對照品，加50 %甲醇制 成每1ml各含0. 12mg的混合溶液，搖勻，即得；
[0008] 步驟三，以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；以乙腈為流動相A，以0. 2 %磷酸水 溶液為流動相B，進行梯度洗脫；檢測波長為254nm ;
[0009] 步驟四，分別精密吸取對照品溶液10 μ 1與供試品溶液10 μ 1，柱溫為35°C，注入 液相色譜儀，測定，即得，以蘆丁和槲皮苷分別計算出總黃酮含量，最終結果以平均值計。 [0010] 進一步，所述供試品溶液的制備方法具體包括：將陰干獼猴桃莖葉、花蕾、美味根， 粉碎為40目，分別稱取藥材粉各4.0克，加40ml甲醇，稱定重量，加熱回流提取60min，放 冷，用甲醇補齊重量，過濾，將容器和濾渣用甲醇分別清洗若干次，將濾液和清洗液合并，用 旋轉蒸發(fā)儀蒸干，再用3ml甲醇溶解并清洗容器，合并后過0. 45um孔徑微孔濾膜，取續(xù)濾液 作為供試品溶液。
[0011] 進一步，所述梯度洗脫以如下體積濃度配置進行：
[0012] 0分鐘時，流動相A為5 %的乙腈溶液，流動相B為95 %的0. 2 %磷酸水溶液；
[0013] 15分鐘時，流動相A為10%的乙腈溶液，流動相B為90%的0. 2%磷酸水溶液；
[0014] 40分鐘時，流動相A為20 %的乙腈溶液，流動相B為80 %的0. 2 %磷酸水溶液；
[0015] 45分鐘時，流動相A為90%的乙腈溶液，流動相B為10%的0. 2%磷酸水溶液；
[0016] 55分鐘時，流動相A為90%的乙腈溶液，流動相B為10%的0. 2%磷酸水溶液；
[0017] 56分鐘時，流動相A為5 %的乙腈溶液，流動相B為95 %的0. 2 %磷酸水溶液；
[0018] 68分鐘時，流動相A為5 %的乙腈溶液，流動相B為95 %的0. 2 %磷酸水溶液。
[0019] 本發(fā)明的另一目的在于提供一種獼猴桃莖黃酮類HPLC指紋圖譜，獼猴桃莖黃酮 類HPLC指紋圖譜的建立，具體包括如下：
[0020] 步驟一，供試品溶液的制備，采用粉碎的陰干獼猴桃莖葉、花蕾、美味根，加入甲 醇，過濾和清洗，取續(xù)濾液作為供試品溶液；
[0021] 步驟二，對照品溶液的制備，精密稱取蘆丁對照品和槲皮苷對照品，加50 %甲醇制 成每1ml各含0. 12mg的混合溶液，搖勻，即得；
[0022] 步驟三，以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；以乙腈為流動相A，以0. 2 %磷酸水 溶液為流動相B，進行梯度洗脫；檢測波長為254nm ;
[0023] 步驟四，分別精密吸取對照品溶液10 μ 1與供試品溶液10 μ 1，柱溫為35°C，注入 液相色譜儀，測定，即得，以蘆丁和槲皮苷分別計算出總黃酮含量，最終結果以平均值計；
[0024] 確定了 17個共有特征峰；
[0025] 1號峰，平均保留時間RT為6. 6min，RSD為2%，峰面積為113, RSD為0. 57% ;
[0026] 2號峰，平均保留時間RT為8. 8min，RSD為9%，峰面積為825, RSD為4. 17% ;
[0027] 3號峰，平均保留時間RT為11. 3min，RSD為1%，峰面積為157, RSD為0· 79% ;
[0028] 4號峰，平均保留時間RT為16. lmin，RSD為1 %，峰面積為354, RSD為1. 79% ;
[0029] 5號峰，平均保留時間RT為17. lmin，RSD為3%，峰面積為320, RSD為L 62% ;
[0030] 6號峰，平均保留時間RT為21. 5min，RSD為0%，峰面積為1515, RSD為7. 66% ;
[0031] 7號峰，平均保留時間RT為24. 3min，RSD為6%，峰面積為530, RSD為2. 68% ;
[0032] 8號峰，平均保留時間RT為26. Omin，RSD為5%，峰面積為579, RSD為2. 92% ;
[0033] 9號峰，平均保留時間RT為29. Omin，RSD為5%，峰面積為231，RSD為L 17% ;
[0034] 10號峰，平均保留時間RT為30. 2min，RSD為4%，峰面積為831，RSD為4. 20% ;
[0035] 11號峰，平均保留時間RT為31. lmin，RSD為4%，峰面積為1044, RSD為5. 28%;
[0036] 12號峰，平均保留時間RT為32. 2min，RSD為1%，峰面積為201，RSD為1. 02% ;
[0037] 13號峰，平均保留時間RT為34. Omin，RSD為1 %，峰面積為54. 83, RSD為0· 27%;
[0038] 14號峰，平均保留時間RT為35. Omin，RSD為0%，峰面積為171，RSD為0. 86% ;
[0039] 15號峰，平均保留時間RT為36. 9min，RSD為5%，峰面積為1640, RSD為8. 29% ;
[0040] 16號峰，平均保留時間RT為43. Omin，RSD為5%，峰面積為304, RSD為1. 53% ;
[0041] 17號峰，平均保留時間RT為43. 7min，RSD為4%，峰面積為831，RSD為4. 20%。
[0042] 本發(fā)明具有如下優(yōu)點：
[0043] 獼猴桃根（藤梨根，軟棗獼猴桃根）用作敗毒抗癌、清熱消腫藥材，在我國已有上 千年歷史，但隨著野生資源的枯竭出現藥材斷層，中藥材市場常用獼猴桃枝條冒充根，魚目 混雜，質量難以保證。本項目指紋圖譜研究，可將不同品種、不同部位（枝條、花、根）與軟 棗獼猴桃根進行比較，通過比較其共有峰，證明枝條是根的延伸部位，具有同源同質屬性， 而花與枝條、根之間細微差異也能凸顯；通過獼猴桃黃酮類指紋圖譜建立，可以區(qū)分供替代 藤梨根作藥材的獼猴桃枝條與其它植物根的差別，為獼猴桃枝條替代藤梨根藥材質量標準 的制定奠定基礎。
[0044] 另外本發(fā)明的供試品制作簡便，色譜條件容易實現；方法的穩(wěn)定性和重現性較好； 適于對獼猴桃枝條、葉、花藥材真?zhèn)?、產地和品質的鑒別和控制。
【附圖說明】
[0045] 圖1是本發(fā)明實施例提供的獼猴桃莖黃酮類HPLC指紋圖譜建立方法流程圖；
[0046] 圖2是本發(fā)明實施例提供的枝條中黃酮類具十七個共峰示意圖；
[0047] 圖3是本發(fā)明實施例提供的軟棗獼猴桃根與8個品種枝條提取的黃酮類指紋圖譜 相似度示意圖。
【具體實施方式】
[0048] 為了使本發(fā)明的目的、技術方案及優(yōu)點更加清楚明白，以下結合實施例，對本發(fā)明 進行進一步詳細說明。應當理解，此處所描述的具體實施例僅僅用以解釋本發(fā)明，并不用于 限定本發(fā)明。
[0049] 下面結合附圖及具體實施例對本發(fā)明的應用原理作進一步描述。
[0050] 參閱圖1 :