分析氨基酸的方法及其所用的試劑的制作方法
【專利說明】分析氨基酸的方法及其所用的試劑
[0001]本發(fā)明涉及一種分析含氮化合物如氨基酸等的新型方法。本發(fā)明還提供了一種用于該方法中的試劑。
[0002]氨基酸是形成蛋白質(zhì)的組分，蛋白質(zhì)又在許多生物學(xué)過程中起關(guān)鍵作用。在許多情況下，在個(gè)體中存在或不存在特定氨基酸可嚴(yán)重影響其健康。例如，患遺傳代謝紊亂苯丙酮尿癥的個(gè)體不能代謝苯丙氨酸；苯丙氨酸的累積會嚴(yán)重影響其大腦發(fā)育。因此，用于檢測游離氨基酸或者測定蛋白質(zhì)的氨基酸組成的方法對正確的診斷和疾病管控是至關(guān)重要的。類似地，該類方法對商業(yè)藥品、食品和食物的分析以及蛋白質(zhì)和酶研究及開發(fā)是重要的。更一般地，含氮化合物的檢測和識別用于寬范圍的學(xué)科應(yīng)用中，包括農(nóng)業(yè)、生物化學(xué)、臨床、環(huán)境、食品、法醫(yī)、組織化學(xué)、微生物、醫(yī)療、營養(yǎng)、植物和蛋白質(zhì)科學(xué)。
[0003]目前，通常使用自動氨基酸分析儀檢測游離或水解釋放的氨基酸。Moore、Stein和Spackman在二十世紀(jì)五十年代開發(fā)了第一種自動化氨基酸分析方法(Spackman DH, SteinWH和 Moore S.， Automatic recording apparatus for use in the chromatography ofamino acids, Anal Chem, 1958, 30:1190-1206)。該多級方法包括借助離子交換液相色譜法分離氨基酸。由試劑池栗送茚三酮試劑，與離子交換柱的洗脫液混合，并使其通過鋼或塑料反應(yīng)盤管，并加熱至反應(yīng)所需的溫度。
[0004]茚三酮與所有氨基酸和相關(guān)的胺化合物反應(yīng)，從而形成高度顯色的反應(yīng)產(chǎn)物。特別地，由伯胺和伯氨基酸形成Ruhemann紫，且可通過570nm波長下的光吸收測定。由仲胺和許多仲氨基酸形成黃色反應(yīng)產(chǎn)物。這些反應(yīng)產(chǎn)物可通過其在440nm波長下的光吸收測定。所述顯色反應(yīng)產(chǎn)物的強(qiáng)度根據(jù)氨基酸濃度變化。
[0005]使氨基酸反應(yīng)產(chǎn)物通過光度計(jì)，其中在合適的波長、特別是在570nm和440nm下檢測染料化合物吸收的光?？赏ㄟ^色譜法確定不同氨基酸的存在。各種氨基酸的識別建立在其迀移特性以及因此其在色譜圖的位置的基礎(chǔ)上。氨基酸的濃度通過在光度計(jì)中借助特定波長下的吸光度檢測的顯色產(chǎn)物的強(qiáng)度確定。因此，該方法可用于定性和定量確定測試樣品中存在何種氨基酸以及各自的相對濃度。
[0006]茚三酮和氨基酸或胺之間的顯色反應(yīng)在室溫下非常緩慢。它在高溫下顯著更快，但仍消耗很多分鐘，即使是在130°C和更高的溫度下也如此。為了保持良好的色譜性能，所述顯色反應(yīng)必須在約I分鐘或更短的時(shí)間內(nèi)進(jìn)行。為了獲得該性能，發(fā)現(xiàn)還原茚三酮(即茚三酮的還原形式)是茚三酮試劑發(fā)揮作用所必需的，且提供了可接受的反應(yīng)速率。為了解釋還原茚三酮在高溫下加速形成顯色產(chǎn)物的能力，已提出了許多原因和機(jī)理。一種看法是還原茚三酮起一種反應(yīng)中間體的穩(wěn)定劑的作用。因此，它被視為促進(jìn)劑而非催化劑。
[0007]遺憾的是，存在于茚三酮試劑中的還原茚三酮是非常難處理的化合物。它在空氣存在下特別不穩(wěn)定，氧氣會將還原茚三酮快速氧化成茚三酮。僅需相對較少量的空氣就嚴(yán)重貧化所述試劑中的還原茚三酮，由此顯著降低光度分析中的顯色敏感度。在茚三酮試劑的制備和使用期間，可使用惰性氣氛，通常為氮?dú)?，以試圖降低還原茚三酮的氧化?？芍獣缘氖?，對于惰性氣氛的要求導(dǎo)致需要復(fù)雜的設(shè)備和處理程序，以確?？焖侔被岱治鏊匦璧倪€原茚三酮在其使用之前和/或期間不以不可接受的速率劣化。
[0008]此外，還原茚三酮不溶于完全水性的介質(zhì)中。因此，其儲存和使用需要顯著量的有機(jī)溶劑。
[0009]在實(shí)踐中，在使用現(xiàn)有設(shè)備和技術(shù)下，在標(biāo)準(zhǔn)氨基酸分析儀上混合或使用含還原茚三酮的茚三酮試劑時(shí)不可能完全排除空氣。因此，所述試劑中的還原茚三酮濃度不可避免地穩(wěn)步降低，直至在色譜分析的時(shí)間框架內(nèi)不發(fā)生顯色反應(yīng)。實(shí)際上，包含還原茚三酮的典型茚三酮試劑具有不長于I個(gè)月且可短達(dá)2周的貯存期限。
[0010]自從Moore、Stein和Spackman發(fā)現(xiàn)需要還原弗三酮的弗三酮基分析以來，在最近60年內(nèi)很少變化。相反，該方法仍是目前最普遍使用的技術(shù)。然而，鑒于上述與使用還原茚三酮有關(guān)的問題，為了盡可能多地使劣化速率最小，已對該方法做了很小的改進(jìn)。Moore,Stein和Spackman的原創(chuàng)方法使用氯化亞錫作為還原劑。然而，產(chǎn)生足以導(dǎo)致合理快速反應(yīng)的還原茚三酮所需的氯化亞錫量會導(dǎo)致氫氧化錫化合物最終沉淀，這又會污染和堵塞流動管道。因此，很快放棄使用氯化亞錫，并研究了其它還原劑如氰化物、亞鈦鹽、硼氫化物和抗壞血酸。氰化物由于毒性問題且缺乏必要的穩(wěn)定性而無法商業(yè)應(yīng)用。
[0011]針對硼氫化鈉和抗壞血酸還原劑進(jìn)行了更認(rèn)真的研究。例如，US3，778，230和US4, 274，833分別公開了包含抗壞血酸和硼氫化鈉或氯化亞錫作為還原劑的茚三酮試劑。然而，這些試劑必須先在惰性容器中在環(huán)境溫度下制備以將還原茚三酮的氧化風(fēng)險(xiǎn)降至最低。特別參考US3，778，230和使用抗壞血酸作為還原劑，一個(gè)嚴(yán)重的缺點(diǎn)是產(chǎn)生不利影響結(jié)果精度的顯色副產(chǎn)物。
[0012]還提出了替代技術(shù)，一些使用不同的氨基酸分析設(shè)備。例如，US4，359，323涉及一種用于胺的液相色譜分析系統(tǒng)。所述系統(tǒng)由色譜柱、反應(yīng)柱和再循環(huán)流動相以再利用的環(huán)路構(gòu)成。該系統(tǒng)的主要和最顯著的特征是用于分離氨基酸樣品的液態(tài)流動相由如下組合構(gòu)成:洗脫液以及與胺反應(yīng)以產(chǎn)生可光度檢測的化合物的物質(zhì)。因此，該方法僅需一個(gè)栗進(jìn)行完整操作。以此方式，據(jù)推測降低了還原茚三酮在周圍空氣中暴露。然而，該發(fā)明仍存在反應(yīng)物干擾分離柱中的氨基酸樣品的顯著風(fēng)險(xiǎn)。
[0013]不同于Moore、Stein和Spackman方法，據(jù)認(rèn)為Hitachi在加熱反應(yīng)室之前將硼氫化鈉與茚三酮一起在線混合。因此，聲稱Hitachi試劑可使用高達(dá)12個(gè)月，而非混合試劑的I個(gè)月標(biāo)準(zhǔn)。然而，硼氫化鈉的穩(wěn)定性仍不足，且已知痕量的金屬可促進(jìn)其劣化。因此，在I年結(jié)束之前，可損失顯著量的硼氫化鈉。盡管在線制備還原茚三酮，然而需要額外的栗送系統(tǒng)或管線以將硼氫化鈉裝入分析設(shè)備中。這提高了系統(tǒng)的復(fù)雜性和成本，且Hitachi試劑不能用于其它生產(chǎn)商的儀器上，除非這些儀器裝備額外的栗送系統(tǒng)和供應(yīng)管線。
[0014]US3, 632，496公開了一種制備茚三酮試劑的替代技術(shù)。試劑產(chǎn)生器由具有從其中穿過的通道的長外殼形成，其包括位于一端的入口以接受試劑和位于另一端的出口以排出活化的試劑。所述通道由對茚三酮還原形成活化試劑具有催化活性的金屬材料表面限定。以此方式，呈其穩(wěn)態(tài)的茚三酮可在一個(gè)囊中儲存和活化。然而，該發(fā)明提供了過于復(fù)雜的活化茚三酮試劑制備機(jī)理和設(shè)備。如上所述，生產(chǎn)商后來回歸到使用簡單得多的方法，其中在氨基酸分析儀上使用之前，將分開儲存的茚三酮和還原茚三酮即時(shí)混合在一起。此外，為了用于紙色譜法領(lǐng)域應(yīng)用中，將US3，632，496的試劑反應(yīng)器并入試劑噴霧器中。因此，如果能在不使還原茚三酮暴露于周圍空氣下進(jìn)行，則將活化試劑從試劑反應(yīng)器轉(zhuǎn)移至氨基酸分析儀設(shè)備中以進(jìn)行使用可能是困難的。
[0015]GB1349941涉及一種熒光測定伯氨基的早期方法，該方法使用與茚三酮組合的特定芳基烷基醛，從而獲得顯示出高熒光的配合物。
[0016]更近一些，CN102618621A描述了一種檢測工業(yè)循環(huán)水中的異養(yǎng)細(xì)菌的方法。
[0017]盡管在尋找替代茚三酮試劑、特別是替代還原劑方面進(jìn)行了相當(dāng)?shù)难芯?，然而仍需要改進(jìn)的方法，從而提供有效、簡單和廉價(jià)的氨基酸等的分析方式。如果替代方法能使用寬范圍的茚三酮試劑，則是特別有利的。
[0018]因此，在第一方面中，本發(fā)明提供了一種分析一種或多種含氮化合物的方法，其中使所述一種或多種含氮化合物與還原茚三酮在高溫下在接觸區(qū)中接觸，所述方法進(jìn)一步包括:
[0019]使茚三酮與一種或多種還原劑在加熱區(qū)中在第一高溫下接觸，從而制得含還原茚三酮的混合物；和
[0020]將所述含還原茚三酮的混合物引入接觸區(qū)中，并使所述含還原茚三酮的混合物與所述含氮化合物在第二高溫下接觸。
[0021]本發(fā)明的方法可用于使含氮化合物可視化，更特別地用于定量和定性分析氨基酸和胺。所述方法基于廣為人知的用于商購氨基酸分析儀中的氨基酸和茚三酮的反應(yīng)。如上所述，商購系統(tǒng)通常借助離子交換液相色譜法將測試樣品分離成其氨基酸成分。然后將洗脫的氨基酸在反應(yīng)盤管中與包含還原茚三酮的茚三酮試劑混合并加熱，從而形成以已知方式進(jìn)行光度測定的顯色反應(yīng)產(chǎn)物。
[0022]茚三酮是本領(lǐng)域所已知的且可商購獲得。本發(fā)明方法中所用的茚三酮試劑可包含本領(lǐng)域已知用于還原茚三酮和氨基酸分析中的還原劑。然而，更優(yōu)選所述茚三酮試劑包含一種或多種在本文稱為“溫度依賴性還原劑”的化合物。適用于該方法中的溫度依賴性還原劑和用于評價(jià)其適用性的測試的更詳細(xì)解釋提供在下文的本發(fā)明第二方面中。下文描述涉及包含一種或多種溫度依賴性還原劑的茚三酮試劑。然而，應(yīng)理解的是，本發(fā)明的方法也可用于包含其它可為本領(lǐng)域所已知的還原劑的茚三酮試劑。
[0023]如上所述，在本發(fā)明的方法中，使茚三酮與一種或多種還原劑在第一高溫下接觸，從而制得包含還原茚三酮的混合物，然后在第二高溫下引入接觸區(qū)中以與被分析的含氮化合物反應(yīng)。自從開發(fā)了用于測定氨基酸和相關(guān)胺的Moore、Stein和Spackman色譜法以來，所有儀器開發(fā)均僅在接觸區(qū)或反應(yīng)盤管中包括一個(gè)加熱段。已發(fā)現(xiàn)以此方式預(yù)熱茚三酮和一種或多種溫度依賴性還原劑改進(jìn)了所述還原劑的反應(yīng)性，這相應(yīng)地改善了所述分析方法的總體操作和效率?？赡芨匾氖?，已發(fā)現(xiàn)加熱時(shí)間的延長不會影響氨基酸分析儀儀器的色譜性能。實(shí)際上，已發(fā)現(xiàn)茚三酮和一種或多種溫度依賴性還原劑的預(yù)熱顯著提高了隨后氨基酸分析的敏感度。進(jìn)一步地，已發(fā)現(xiàn)預(yù)熱段的應(yīng)用提高了可在茚三酮還原成還原茚三酮中用作溫度依賴性還原劑的化合物數(shù)量和化合物類型，這將在下文更詳細(xì)地討論。
[0024]本發(fā)明的方法使用加熱區(qū)如預(yù)熱盤管或柱，從而在將所述試劑提供給接觸區(qū)之前，將所述一種或多種溫度依賴性還原劑預(yù)熱至第一高溫。所述加熱區(qū)如預(yù)熱盤管或柱用于預(yù)熱溫度依賴性還原劑和茚三酮，從而在不存在含氮化合物下且在與被分析的