專利名稱：氨基酸診斷/測定試劑(盒)及氨基酸濃度測定方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種氨基酸診斷/測定試劑(盒)，同時本發(fā)明還涉及測定氨基酸濃度
的方法，屬于醫(yī)學(xué)/食品/環(huán)境檢驗測定技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
氨基酸含量的測定在醫(yī)學(xué)/食品/工業(yè)/農(nóng)業(yè)/環(huán)境中都是比較重要的測定項目。 現(xiàn)有的測定方法有色譜法、電化學(xué)法、儀器分析法(氨基酸分析儀)、分光光度計等方法，這 些方法或是操作方法較為繁雜、特異性差、或儀器設(shè)備成本較高等缺點。 氨基酸不是單純的一種物質(zhì)，用氨基酸分析儀可直接測定出17種氨基酸(儀器價 格昂貴，不能普遍使用)，對于醫(yī)學(xué)/食品/工業(yè)/農(nóng)業(yè)/環(huán)境中來說，多數(shù)情況下，都是很 多種氨基酸同時存在，所以需要測定總的氨基酸含量，它們不能以氨基酸百分率來表示，只 能以氨基酸中所含的氮(氨基酸氮)的百分率表示。 大量食肉或饑餓時尿中氨基酸氮增加，孕婦及新生兒尿液氨基酸氮也增加。氨基 酸代謝異常，造成某些氨基酸在體內(nèi)積累過多，使尿中氨基酸氮增高；急性肝萎縮、肝功能 衰竭、Reye綜合征、或某些因素造成蛋白質(zhì)分解加速的疾病，遺傳性疾病所導(dǎo)致的代謝異常 均可使尿中氨基酸氮增加。 酶法測定血、尿、體液、食品、土壤、工業(yè)產(chǎn)品中氨基酸氮含量具有特異性高、方法 簡便、成本低的特點。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提出一種利用酶比色法(EnzymaticColorimetric Method)及酶(偶)聯(lián)法(Couple Reaction)技術(shù)，監(jiān)測還原型煙酰胺輔酶(還原型輔酶) 在340nm波長處吸光度的變化，得以測定氨基酸濃度的方法，同時，本發(fā)明還將給出用以實 現(xiàn)該方法的氨基酸診斷/測定試劑(盒)，采用該試劑不僅可以在紫外/可見光分析儀或 半、全自動生化分析儀上進行氨基酸濃度測定，而且測定速度快、準確度高，因而可以得到 切實的推廣應(yīng)用。 本發(fā)明氨基酸濃度測定方法如下 氨基酸+水+氧氨某酸氧化酶氧代酸+氨+過氧化氫 過氧化氫+ 二氧化碳+乙酰輔酶A丙酮酸氧化酶丙酮酸+ 輔酶A+氧 丙酮酸+氨+還原型輔酶丙氨酸脫氡酶丙氨酸+水+輔酶這種方法應(yīng)用氨基酸氧化酶(amino-acid oxidase ;EC 1. 4. 3. 2 ;EC
1. 4.3.3)酶(偶)聯(lián)丙酮酸氧化酶(pyruvate oxidase ;EC 1. 2. 3. 6)、丙氨酸脫氫酶
(alaninedehydrogenase ;EC 1.4.1.1)酶促反應(yīng)比色法。氨基酸氧化酶酶解氨基酸反應(yīng)
產(chǎn)生過氧化氫，再通過(偶)聯(lián)合丙酮酸氧化酶、丙氨酸脫氫酶的作用，最終將還原型輔酶
(在340nm處有吸收峰)氧化成為輔酶(在340nm處沒有吸收峰)，從而得以測定還原型輔酶在340nm處吸光度下降的程度，通過測量340nm處吸光度下降的程度，可以測算氨基酸的濃度大小。 實驗表明，從測定結(jié)果的準確性和配制成本的經(jīng)濟性兩方面綜合考慮，無論是單劑、雙劑還是三劑，如下成分關(guān)系的本發(fā)明氨基酸診斷/測定試劑(盒)較為理想 本發(fā)明的氨基酸診斷/測定試劑(盒)可以是單劑，包括 緩沖液、穩(wěn)定劑、還原型輔酶、氨基酸氧化酶、丙酮酸氧化酶、丙氨酸 脫氫酶、碳酸氫鈉(二氧化碳)、乙酰輔酶A、氯化氨。 試劑(盒)可以是干粉狀態(tài)，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液體試劑，
直接使用。
也可以將上述單劑試劑配成如下雙劑試劑
試劑1 緩沖液、穩(wěn)定劑、還原型輔酶、碳酸氫鈉(二氧化碳)、乙酰輔酶A、氯化氨。
試劑2 緩沖液、穩(wěn)定劑、氨基酸氧化酶、丙酮酸氧化酶、丙氨酸脫氫酶。 還原型輔酶、氨基酸氧化酶、丙酮酸氧化酶、丙氨酸脫氫酶、碳酸氫鈉(二氧化碳)、乙酰輔酶A、氯化氨在試劑1或試劑2中的位置可以不限。試劑(盒)可以是干粉狀態(tài)，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液體試劑，直接使用。
還可以將上述單劑試劑配成如下三劑試劑
試劑1 緩沖液、穩(wěn)定劑、還原型輔酶、碳酸氫鈉(二氧化碳)、乙酰輔酶A、氯化氨。
試劑2 緩沖液、穩(wěn)定劑、丙酮酸氧化酶、丙氨酸脫氫酶。
試劑3 緩沖液、穩(wěn)定劑、氨基酸氧化酶。 還原型輔酶、氨基酸氧化酶、丙酮酸氧化酶、丙氨酸脫氫酶、碳酸氫鈉(二氧化碳)、乙酰輔酶A、氯化氨在試劑1、試劑2或試劑3中的位置可以不限。試劑(盒)可以是干粉狀態(tài)，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液體試劑，直接使用。
無論是單劑、雙劑還是三劑，本發(fā)明測定氨基酸濃度的方法，其還原型輔酶可以是NADPH、 NADH或thio-NADH中的一種。
緩沖液
穩(wěn)定劑
還原型輔酶
氨基酸氧化酶
丙酮酸氧化酶
丙氨酸脫氫酶
碳酸氫鈉
乙酰輔酶A
氯化氨
6000U/L8000U/L10000U/L
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丙酮酸氧化酶
具體實施例方式
下面結(jié)合實施例子對本發(fā)明作進一步的說明。 實施例一
本實施例的氨基酸診斷/測定試劑為單試劑，包括 三(羧甲基)氨基甲烷-鹽酸緩沖液 100mmol/L 穩(wěn)定劑 500mmol/L 還原型輔酶 0. 25mmol/L
' 6000U/L
8000U/L 10000U/L 6mmol/L
乙酰輔酶A 9mmol/L 氯化氨 15,1/L
試劑全部溶解配好后，分裝入瓶，進行冷凍干燥，制成干粉試劑；使用前，加入純凈 水，復(fù)溶后使用。 在全自動生化分析儀上設(shè)定溫度37t:，反應(yīng)時間IO分鐘，起始吸光度I. 8±0. 7，
測試主波長340nm，測試副波長405nm，被測氨基酸樣品與試劑的體積比例為1/25，反應(yīng)方
向為負反應(yīng)(下降反應(yīng))，延遲時間大約0分鐘左右，檢測時間5分鐘左右。 加入樣品和試劑后，使之混合并發(fā)生反應(yīng)，最終將反應(yīng)物置于生化分析儀下，檢測
主波長340nm吸光度下降的程度，從而測算出氨基酸的濃度大小。 實施例二 本實施例的氨基酸診斷/測定試劑為雙試劑，包括
試劑1 三(羧甲基)氨基甲烷-鹽酸緩沖液 lOOmmol/L
穩(wěn)定劑 50mmol/L
還原型輔酶 0. 25mmol/L 碳酸氫鈉 6mmol/L
乙酰輔酶A 9mmol/L
tH七氨 15mmol/L
試劑2三(羧甲基)氨基甲烷-鹽酸緩沖液 lOOmmol/L
穩(wěn)定劑 500mmol/L
氨基酸氧化酶 6000U/L
丙酮酸氧化酶 8000U/L
丙氨酸脫氫酶 10000U/L 試劑全部溶解配好后，分裝入瓶，制成液體雙試劑，可以直接使用。
在全自動生化分析儀上設(shè)定溫度37t:，反應(yīng)時間IO分鐘，起始吸光度I. 8±0. 7， 測試主波長340nm，測試副波長405nm，被測氨基酸樣品與試劑1、試劑2的體積比例為 2/20/5，反應(yīng)方向為負反應(yīng)(下降反應(yīng))，延遲時間大約O分鐘左右，檢測時間5分鐘左右。
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加入樣品和試劑后，使之混合并發(fā)生反應(yīng)，最終將反應(yīng)物置于生化分析儀下，檢效主波長340nm吸光度下降的程度，從而測算出氨基酸的濃度大小。
實施例三
本實施例的氨基酸診斷/測定試劑為三試劑，包括試劑l
三(羧甲基)氨基甲烷-鹽酸緩沖液穩(wěn)定劑還原型輔酶

乙酰輔酶A
試劑2
三(羧甲基)氨基甲烷穩(wěn)定劑
丙酮酸氧化酶
鹽酸緩沖液
100,1/L50mmol/L0. 25,1/L6mmol/L9mmol/L15mmol/L
100,1/L500,1/L8000U/L10000U/L
試劑3
三(羧甲基)氨基甲烷穩(wěn)定劑
鹽酸緩沖液
100,1/L500,1/L6000U/L
試劑全部溶解配好后，分裝入瓶，制成液體三試劑，可以直接使用。測定氨基酸濃度時，在全自動生化分析儀上設(shè)定溫度37t:，反應(yīng)時間IO分鐘，起始吸光度1. 8±0. 7，測試主波長340nm，測試副波長405nm，被測氨基酸樣品與試劑1、試劑2、試劑3的體積比例為4/40/5/5，反應(yīng)方向為負反應(yīng)(下降反應(yīng))，延遲時間大約0分鐘左右，檢測時間5分鐘左右。 加入樣品和試劑后，使之混合并發(fā)生反應(yīng)，最終將反應(yīng)物置于生化分析儀下，檢測主波長340nm吸光度下降的程度，從而測算出氨基酸的濃度大小。 申請人:經(jīng)過實驗驗證，采用以上發(fā)明內(nèi)容中記載的其他測定方法均能達到本發(fā)明的目的，鑒于測定步驟等情況與以上實施例類同，不另一一例舉。 總之，實驗證明采用本發(fā)明的測定方法完全可以通過一般生化分析儀器得出所需的測定結(jié)果——空白試劑吸光度變化(AA/min)《0. 0008 ;吸光度時間反應(yīng)曲線應(yīng)呈下降曲線直至終點；試劑可測有效(R > 0. 99)線形范圍可達40mmol/L ;試劑測試的不準確度，其相對偏差不超過±4% ;試劑測試的精密度(重復(fù)性)的變異系數(shù)(CV)《2% ;試劑的靈敏度可達O. 002±0. 001 AA/mmol/L ;試劑在2-8。C下保存，活性可以穩(wěn)定一年；——本發(fā)明靈敏度高、精確度好，線形范圍寬廣，穩(wěn)定期長，足以便于推廣應(yīng)用。
權(quán)利要求
一種利用酶比色法及酶聯(lián)法技術(shù)的氨基酸濃度測定方法，其方法如下氨基酸+水+氧氨基酸氧化酶氧代酸+氨+過氧化氫過氧化氫+二氧化碳+乙酰輔酶A 丙酮酸氧化酶丙酮酸+輔酶A+氧丙酮酸+氨+還原型輔酶丙氨酸脫氫酶丙氨酸+水+輔酶將最終反應(yīng)物置于紫外/可見光分析儀或半、全自動生化分析儀下，檢測主波長340nm吸光度下降的程度，測算出氨基酸的濃度大小測定結(jié)果。
2. —種氨基酸診斷/測定試劑(盒)，主要成分包括緩沖液穩(wěn)定劑還原型輔酶丙酮酸氧化酶乙酰輔酶A-50mmol/L_50mmol/L1-1-50mmol/L試劑成分的濃度不一定只限于上述范圍；在此范圍內(nèi)效果較好，在此范圍外，試劑仍會反應(yīng)作用。其特征在于試劑(盒)可以是干粉狀態(tài)，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液體試劑，直接使用。氯化氨也可以用其他氨鹽取代。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述氨基酸診斷/測定試劑(盒)，其特征在于由緩沖液、穩(wěn)定劑、還原型輔酶、氨基酸氧化酶、丙酮酸氧化酶、丙氨酸脫氫酶、碳酸氫鈉(二氧化碳)、乙酰輔酶A、氯化氨組成單劑試劑。
4. 根據(jù)權(quán)利要求2所述氨基酸診斷/測定試劑(盒)，其特征在于由緩沖液、穩(wěn)定劑、還原型輔酶、氨基酸氧化酶、丙酮酸氧化酶、丙氨酸脫氫酶、碳酸氫鈉(二氧化碳)、乙酰輔酶A、氯化氨組成雙劑試劑；試劑1，由緩沖液、穩(wěn)定劑、還原型輔酶、碳酸氫鈉(二氧化碳)、乙酰輔酶A、氯化氨組成；試劑2，由緩沖液、穩(wěn)定劑、氨基酸氧化酶、丙酮酸氧化酶、丙氨酸脫氫酶組成。還原型輔酶、氨基酸氧化酶、丙酮酸氧化酶、丙氨酸脫氫酶、碳酸氫鈉(二氧化碳)、乙酰輔酶A、氯化氨在試劑1或試劑2中的位置可以不限。
5. 根據(jù)權(quán)利要求2所述氨基酸診斷/測定試劑(盒)，其特征在于由緩沖液、穩(wěn)定劑、還原型輔酶、氨基酸氧化酶、丙酮酸氧化酶、丙氨酸脫氫酶、碳酸氫鈉(二氧化碳)、乙酰輔酶A、氯化氨組成多劑試劑；試劑1，由緩沖液、穩(wěn)定劑、還原型輔酶、碳酸氫鈉(二氧化碳)、乙酰輔酶A、氯化氨組成；試劑2，由緩沖液、穩(wěn)定劑、丙酮酸氧化酶、丙氨酸脫氫酶組成；試劑3，由緩沖液、穩(wěn)定劑、氨基酸氧化酶組成。還原型輔酶、氨基酸氧化酶、丙酮酸氧化酶、丙氨酸脫氫酶、碳酸氫鈉(二氧化碳)、乙酰輔酶A、氯化氨在試劑1、試劑2或試劑3中的位置可以不限。
6. 根據(jù)權(quán)利要求2所述氨基酸診斷/測定試劑(盒)，其特征在于還包括穩(wěn)定劑l-4000mmol/L或0. 1 % _100%體積比。所述穩(wěn)定劑為甘油(Glycerol)、丙二醇(PropyleneGlycol)、乙二醇(Ethylene glycol)及防腐劑中的至少一種。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種利用酶比色法及酶聯(lián)法技術(shù)的氨基酸診斷/測定試劑(盒)，同時本發(fā)明還涉及測定氨基酸濃度的方法、試劑的組成及成分，屬于醫(yī)學(xué)/食品/環(huán)境檢驗測定技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明的試劑(盒)主要成分包括緩沖液、還原型輔酶、碳酸氫鈉(二氧化碳)、乙酰輔酶A、氯化氨、氨基酸氧化酶、丙酮酸氧化酶、丙氨酸脫氫酶及穩(wěn)定劑；通過將樣品與試劑按一定的體積比混合，使之發(fā)生一系列的酶促反應(yīng)，再將反應(yīng)物置于紫外/可見光分析儀下，檢測主波長340nm處吸光度下降的程度，從而測算出氨基酸的濃度大小。
文檔編號G01N21/17GK101750346SQ20081023599
公開日2010年6月23日 申請日期2008年12月10日 優(yōu)先權(quán)日2008年12月10日
發(fā)明者王爾中 申請人:蘇州艾杰生物科技有限公司