一種半合成藥物中間體的質(zhì)量檢測方法【
技術(shù)領(lǐng)域：
】[0001]本發(fā)明涉及藥物檢測領(lǐng)域，具體涉及一種半合成藥物中間體的質(zhì)量檢測方法。【
背景技術(shù)：
】[0002]半合成藥物是指在天然藥物提取物的基礎(chǔ)上，進行化合結(jié)構(gòu)改造，所獲得藥物的統(tǒng)稱。而天然藥物提取物的質(zhì)量對最后成藥的質(zhì)量至關(guān)重要。[0003]天然藥物指紋圖譜是一種綜合的，可量化的鑒定手段，它是建立在天然藥物化學(xué)成分系統(tǒng)研究的基礎(chǔ)上，主要用于評價天然藥物及其提取物質(zhì)量的真實性、優(yōu)良性和穩(wěn)定性。[0004]天然藥物及其提取物均為多組分復(fù)雜體系，因此評價其質(zhì)量應(yīng)采用與之相適應(yīng)的，能提供豐富鑒別信息的檢測方法，建立天然藥物指紋圖譜將能較為全面地反映天然藥物及其提取物中所含化學(xué)成分的種類與數(shù)量，進而對藥品質(zhì)量進行整體描述和評價。天然藥物指紋圖譜的研究和建立，對于有效控制天然藥物的質(zhì)量具有重要意義。[0005]近年來，現(xiàn)代中醫(yī)學(xué)研究表明，天然植物藥中的黃酮類化合物具有降血糖和血脂、降低心肌耗氧量、軟化血管、抗心律不齊、使冠脈和腦血管流量增加等功能，植物中總黃酮測定有高效液相色譜法、毛細(xì)管電泳法、紫外分光光度法、氣相色譜法等方法，目前，一般采用高效液相色譜法對天然藥物中的總黃酮含量進行測定。[0006]本申請發(fā)明人對高效液相色譜法測定天然藥物中的黃酮類化合物進行研究，發(fā)現(xiàn)了一種便捷，靈敏度高的，能夠?qū)Χ喾N天然藥物中的黃酮類化合物進行測定，為產(chǎn)品的質(zhì)量得到更好的控制奠定基礎(chǔ)。[0007]【
發(fā)明內(nèi)容】[0008]本發(fā)明涉及的是一種半合成藥物中間體的質(zhì)量檢測方法，能全面的分析藥物中的黃酮類化合物成分，用以有效的控制產(chǎn)品的質(zhì)量。[0009]本發(fā)明首先公開了一種半合成藥物中間體的質(zhì)量檢測方法，采用HPLC指紋圖譜法進行檢測，具體步驟如下：1)取中間體粉末樣品和對照品粉末，精密稱定并以甲醇或乙醇為溶劑溶解、定容后，得供試品洛液和對照品洛液；2)精密吸取供試品溶液或?qū)φ掌啡芤鹤⑷敫咝б合嗌V儀，采用反相色譜柱進行HPLC分析，HPLC指紋圖譜法的條件為：柱溫20~30°C，流動相為乙腈-水-磷酸系統(tǒng)，梯度洗脫，流速為〇·7~I.5ml/mim，檢測波長為370nm。[0010]較優(yōu)的，步驟1)中所述溶劑為30~ΙΟΟv/v%甲醇水溶液或50v/v%乙醇水溶液；最優(yōu)的，步驟1)中溶解藥物樣品的溶劑為50v/v%甲醇水溶液；溶解對照品的溶劑為100v/v%甲醇溶液。[0011]較優(yōu)的，步驟1)所述溶解為超聲溶解。更優(yōu)的，步驟1)超聲溶解的時間為5~30min。最優(yōu)的，步驟1)超聲溶解的時間為lOmin。[0012]較優(yōu)的，步驟1)供試品溶液還需要經(jīng)0.22μπι微孔濾膜過濾。[0013]較優(yōu)的，步驟3)所述反相色譜柱為AgilentZORBAXSB-C18色譜柱。[0014]較優(yōu)的，步驟3)所述乙腈-水-磷酸系統(tǒng)中，流動相A為乙腈，流動相B為0.05v/v%磷酸溶液。[0015]更優(yōu)的，步驟3)所述梯度洗脫程序以及流動相的組成為：洗脫時間(T35min，磷酸溶液：乙腈=95:5，流速為1.〇1111/1^11，洗脫時間35~551^11，磷酸溶液：乙腈=85:15，流速為1.51111/111；[11，洗脫時間55~70111；[11，磷酸溶液：乙腈=45:55，流速為0.71111/111；[11。[0016]優(yōu)選的，步驟3)精密吸取供試品溶液或參照物溶液5~15ul，優(yōu)選IOul注入高效液相色譜儀，進行測定。記錄60~90min，優(yōu)選70分鐘的色譜圖。[0017]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明由于對色譜條件進行合理設(shè)置，使得本發(fā)明半合成藥物中間體的質(zhì)量檢測方法更為簡便、易行、重復(fù)性好，通過HPLC指紋圖譜檢測半合成藥物中間體中總黃酮的含量，更利于其質(zhì)量控制，有助于提高藥劑的安全性和穩(wěn)定性。[0018]【具體實施方式】[0019]下面結(jié)合實施例進一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，實施例僅用于說明本發(fā)明，而非限制本發(fā)明的范圍。[0020]實施例11.儀器與試劑儀器：Agilent1100型高效液相色譜儀，四元泵，全自動進樣儀；二極管陣列檢測器（DAD);色譜柱：AgilentZORBAXSB-C18StableBondAnalytical4.6*150mm5-Micron〇[0021]試藥：蘆丁；槲皮素；金絲桃苷；金銀花總黃酮2.實驗方法樣品洛液的制備1)供試品溶液的制備：取金銀花總黃酮0.5g，精密稱定，置25ml容量瓶中，加50%甲醇適量，超聲提取lOmin，冷卻后加50%甲醇定容至刻度，用0.22μm微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液作為供試品溶液，即得。[0022]2)對照品溶液的制備：精密稱取蘆丁、槲皮素、金絲桃苷對照品適量，置于25ml容量瓶中，加100%甲醇超聲溶解，制成每1ml含蘆丁0.060mg、槲皮素0.320mg、金絲桃苷0·200mg的混合對照品。[0023]色譜條件色譜柱：AgilentZORBAXSB-C18StableBondAnalytical4.6*150mm5-Micron;檢測波長為370nm;柱溫為25°C;洗脫流速及流動相梯度如下表1，圖譜記錄時間為70min。此條件下對照品蘆丁、槲皮素、金絲桃苷的保留時間分別為20.091min，23.160,26.320min，。[0024]表1乙腈-0·05v/v%磷酸溶液梯度洗脫表流動相的確定實驗過程中選擇了4種流動相系統(tǒng)：①甲醇-水（22:78)固定配比；②甲醇-水的梯度洗脫；③乙腈-〇.5%磷酸梯度洗脫；④乙腈-0.05%磷酸梯度洗脫。[0025]結(jié)果表明，以乙腈-0.05%磷酸系統(tǒng)，即如表1所示的梯度洗脫條件為最佳，譜圖上各個色譜峰的分離度較好，色譜峰多，保留時間適中，故選乙腈-水-磷酸系統(tǒng)作為HPLC指紋圖譜檢測流動相。[0026]提取溶劑的考察精密稱定金銀花提取物5份，每份0.2g，分別置于25ml容量瓶中；對上述5分粉末分別用適量100%甲醇、70%甲醇、50%甲醇、30%甲醇、50%乙醇五種溶劑(有機溶劑的水溶液）進行超聲提取l〇min，冷卻后用相同的溶劑定容至刻度，用0.22μπι微孔濾膜過濾，獲得不同溶劑提取的濾液作為供試品溶液。[0027]不同提取溶劑制備的提取物樣品進行測定，由HPLC結(jié)果可知，上述溶劑提取后，均能獲得正確分離的HPLC圖譜；其中，50%甲醇提取液色譜圖中色譜峰分離最好，故選用50%甲醇作為樣品制備優(yōu)選溶劑。[0028]提取方式的考察取金銀花提取物5份，每份0.2g，精密稱定，置于25ml容量瓶中，采用50%甲醇作為溶劑對金銀花粉末超聲提取進行溶解，分別檢驗超聲處理5min、10min、15min、20min、30min的提取效果，超聲后冷卻、定容，0.22μm微孔濾膜過濾后進樣分析。[0029]結(jié)果表明當(dāng)提取時間大于lOmin，提取時間對提取效率產(chǎn)生的影響降低，考慮到實驗的快捷、簡便，故樣品提取超聲時間定為lOmin。[0030]精密度實驗取供試品溶液，按照上述色譜條件，連續(xù)進樣6次，記錄色譜圖。結(jié)果表明，各共有峰的相對保留時間和相對峰面積比值基本一致，各峰保留時間比值的RSD在0.00%~0.46%，峰面積比值的RSD在0.20%~2.83%，RSD均小于3%，符合指紋圖譜技術(shù)要求。結(jié)果表明，儀器等整個檢測系統(tǒng)的精密度良好。[0031]穩(wěn)定性實驗取供試品溶液，按照上述色譜條件，分別于0、2、4、6、8、22、24h進行檢測，記錄色譜圖。結(jié)果表明，樣品在24h內(nèi)，各共有峰的相對保留時間和相對峰面積比值基本一致，各峰相對保留時間比值的RSD在0.09%~0.47%;各峰相對面積比值的RSD在0.28%~2.81%;RSD均小于3%，符合指紋圖譜的技術(shù)要求。結(jié)果表明供試品24h內(nèi)指紋圖譜穩(wěn)定。[0032]對比實施例1采用現(xiàn)有技術(shù)中的GC-MS檢測方法對半合成藥物中間體中的黃酮類化合物進行檢測分析，進一步驗證本發(fā)明所采用方法的準(zhǔn)確度和靈敏度。[0033]色譜柱：DB_1毛細(xì)管柱（3〇mXO.25mm，0.25Mm);溶劑：正己烷；載氣：氦氣；進樣口：分流，溫度200°C;柱溫：程序升溫l〇〇°C保持3分鐘后以15°C每分鐘升溫到180°C保持5分鐘；柱流速：2.Oml/min;分流進樣：分流比10:1;進樣模式：頂空進樣；頂空進樣器：爐溫KKTC保溫10分鐘，針溫度KKTC，進樣量Iml;MS參數(shù)：采用全掃描模式；采集質(zhì)量數(shù)范圍：40-510。[0034]供試品溶液：稱取金銀花總黃酮樣品適量，精密稱定，先用少量水溶解，加乙醇適量并超聲提取IOmin,再用乙醇定容制成10mg/ml溶液；對照品溶液：分別精密稱取蘆丁、槲皮素、金絲桃苷對照品適量，精密稱定，用乙醇溶解并稀釋配成〇·〇2mg/ml溶液。[0035]分別取對照品、供試品溶液，依法頂空進樣，記錄色譜圖，計算色譜峰面積。[0036]結(jié)果顯示金銀花總黃酮中各黃酮類化合物的含量與采用本發(fā)明的HPLC法測定的含量相符。【主權(quán)項】1.一種半合成藥物中間體的質(zhì)量檢測方法，采用HPLC指紋圖譜法進行檢測，具體步驟如下：1)取中間體的粉末樣品和對照品粉末，精密稱定并以甲醇或乙醇為溶劑溶解、定容后，得供試品溶液和對照品溶液；2)精密吸取供試品溶液或?qū)φ掌啡芤鹤⑷敫咝б合嗌V儀，采用反相色譜柱進行HPLC分析，HPLC指紋圖譜法的條件為：柱溫20~30°C，流動相為乙腈-水-磷酸系統(tǒng)，梯度洗脫，流速為〇?7~I.5ml/mim，檢測波長為370nm。2.如權(quán)利要求1所述的檢測方法，其特征在于，步驟1)中所述溶劑為30~lOOv/v%甲醇水溶液或50v/v%乙醇水溶液。3.如權(quán)利要求1所述的檢測方法，其特征在于，步驟1)所述溶解為超聲溶解，超聲溶解的時間為5~30min。4.如權(quán)利要求1所述的檢測方法，其特征在于，步驟2)所述反相色譜柱為AgilentZ0RBAXSB-C18色譜柱。5.如權(quán)利要求1所述的檢測方法，其特征在于，步驟2)所述乙腈-水-磷酸系統(tǒng)包括流動相A和流動相B，其中流動相A為乙腈，流動相B為0.05v/v%磷酸溶液。6.如權(quán)利要求1所述的檢測方法，其特征在于，步驟2)所述梯度洗脫程序以及流動相的組成為：洗脫時間〇~35min，磷酸溶液：乙腈=95:5,流速為1.0ml/min，洗脫時間35~551^11，磷酸溶液：乙腈=85:15，流速為1.51111/1^11，洗脫時間55~7〇1^11，磷酸溶液：乙腈=45:55,流速為0.71111/1]1；[11〇【專利摘要】本發(fā)明涉及的是一種半合成藥物中間體的質(zhì)量檢測方法，采用HPLC指紋圖譜法進行檢測，其中以乙腈-水-磷酸系統(tǒng)為流動相進行梯度洗脫，能全面的分析提取物中的黃酮類化合物成分，能夠有效的控制產(chǎn)品的質(zhì)量。【IPC分類】G01N30/89【公開號】CN105092767【申請?zhí)枴緾N201410214812【發(fā)明人】嚴(yán)潔,李軒【申請人】天津市漢康醫(yī)藥生物技術(shù)有限公司【公開日】2015年11月25日【申請日】2014年5月21日