一種預(yù)測非甾體抗炎藥類新型污染物對斑馬魚早期生活階段胚胎毒性的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于環(huán)境毒理學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種預(yù)測非留體抗炎藥類新型污染物對斑馬魚早期生活階段胚胎毒性的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]廣泛使用的非留體抗炎藥(NSAIDs)在為人類減輕病痛的同時(shí)，也帶來諸多環(huán)境污染和危害，較低濃度暴露即會對水生生物造成不良影響，而且還可能通過協(xié)同、相加等相互作用導(dǎo)致大量混存時(shí)的聯(lián)合毒性增強(qiáng)，潛在風(fēng)險(xiǎn)不容忽視。然而，目前有關(guān)非留體抗炎藥的毒理研究仍主要集中在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)模擬的短期高劑量暴露下的急性毒性方面，對其實(shí)際環(huán)境水平暴露時(shí)所可能引起的毒性則研究較少，但非留體抗炎藥的急性毒性數(shù)據(jù)往往遠(yuǎn)高于其實(shí)際檢出濃度(100-1000倍)，并且其在水體中通常是大量多種混存、共同作用，情況較為復(fù)雜，因此，為了避免高估甚至低估非留體抗炎藥的毒害風(fēng)險(xiǎn)，提高準(zhǔn)確度和有效性，應(yīng)重點(diǎn)加強(qiáng)對這類污染物的低劑量慢性毒性研究以及對更敏感生物體、生物體早期更敏感生活階段的致毒作用和潛在風(fēng)險(xiǎn)研究。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]本發(fā)明的目的是針對現(xiàn)有技術(shù)中常規(guī)理化指標(biāo)不能反映實(shí)際環(huán)境中低劑量非甾體抗炎藥類新型污染物的毒性的問題，提供一種預(yù)測非留體抗炎藥類新型污染物對斑馬魚早期生活階段胚胎毒性的方法，從而實(shí)現(xiàn)對非留體抗炎藥類新型污染物的毒性特征和毒性水平進(jìn)行分析測試和定量描述。
[0004]本發(fā)明的預(yù)測非留體抗炎藥類新型污染物對斑馬魚早期生活階段胚胎毒性的方法，包括以下步驟:
[0005]a.將待測的非留體抗炎藥類新型污染物配制成呈等對數(shù)間距濃度的試驗(yàn)溶液，將斑馬魚胚胎暴露于試驗(yàn)溶液中半靜態(tài)培養(yǎng)；
[0006]b.記錄暴露7天后斑馬魚胚胎的死亡率和畸變率；
[0007]c.根據(jù)步驟b得到的數(shù)據(jù)計(jì)算得到對應(yīng)的LC5。和致畸EC 50o
[0008]所述的步驟a的斑馬魚胚胎為受精后不超過Sh的斑馬魚胚胎。
[0009]所述的步驟a的斑馬魚胚胎暴露于試驗(yàn)溶液中半靜態(tài)培養(yǎng)，是在溫度為25±1°C、光照周期為14h光照:1h黑暗條件下培養(yǎng)，在暴露開始第二天每隔24h更換原試驗(yàn)溶液體積3/4的新鮮試驗(yàn)溶液。
[0010]所述的步驟b的死亡率，死亡情況判斷標(biāo)準(zhǔn)包括:靜止不動、無呼吸運(yùn)動、無心臟跳動、中樞神經(jīng)系統(tǒng)呈白色不透明或/和對機(jī)械刺激無任何反應(yīng)。
[0011]所述的步驟b的畸變率，畸變類型判斷標(biāo)準(zhǔn)包括:卵凝結(jié)、發(fā)育停滯、心包囊腫、卵黃囊腫、脊柱彎曲或/和尾部畸變(尾折)。
[0012]本發(fā)明方法采用斑馬魚早期生活階段胚胎的體內(nèi)試驗(yàn)方法，來測定評估非甾體抗炎藥類新型污染物對斑馬魚胚胎的毒性作用，判斷這類污染物對斑馬魚及其胚胎是否具有毒性的依據(jù)為:
[0013]1、利用半靜態(tài)實(shí)驗(yàn)方式，測定得到非留體抗炎藥類新型污染物在不同濃度水平不同暴露時(shí)間內(nèi)對斑馬魚及其胚胎的毒性效應(yīng)，具體包括致畸(卵凝結(jié)、發(fā)育停滯、心包囊月中、卵黃囊腫、脊柱彎曲或/和尾部畸變(尾折))和致死效應(yīng)，并通過計(jì)算半致死性濃度(50% Lethal concentrat1n, LC50)和半數(shù)致畸效應(yīng)濃度(50% Effect concentrat1n,EC5。)來對毒性進(jìn)行描述與表征；
[0014]2、參照歐盟委員會所劃分的污染物對于水生生物的風(fēng)險(xiǎn)等級(EU Directive93/67/EEC，1996):EC50<lmg/L 表示非常有毒;lmg/L〈EC50〈10mg/L 表示有毒；llmg/L<EC50<100mg/L表示有害)進(jìn)一步對比評估非留體抗炎藥類新型污染物對斑馬魚及其胚胎的致毒級別，并推測這類污染物在低水平暴露環(huán)境下因生物累積和生物放大等效應(yīng)所可能導(dǎo)致的對水生生物的毒害作用及生態(tài)安全風(fēng)險(xiǎn)。
[0015]本發(fā)明方法可以對非留體抗炎藥類新型污染物的毒性特征和毒性水平進(jìn)行分析測試和定量描述，解決常規(guī)理化指標(biāo)不能反映的典型非留體抗炎藥污水生物毒性，同時(shí)可作為非留體抗炎藥污水生物毒性監(jiān)測和評價(jià)的指標(biāo)，可為水體中這類污染物的潛在生態(tài)毒性風(fēng)險(xiǎn)預(yù)測與評估提供參考。
【附圖說明】
[0016]圖1是經(jīng)雙氯芬酸染毒后的斑馬魚胚胎非致死性效應(yīng)。其中，A是尾部畸變(尾折)，B是脊柱彎曲，C是卵黃囊腫，D是心包囊腫。
[0017]圖2是經(jīng)雙氯芬酸染毒后的斑馬魚胚胎致死性效應(yīng)。其中，A是胚胎死亡，B是幼魚死亡。
【具體實(shí)施方式】
[0018]以下實(shí)施例是對本發(fā)明的進(jìn)一步說明，而不是對本發(fā)明的限制。
[0019]下列實(shí)例中未具體注明的實(shí)驗(yàn)方法，均可按照常規(guī)方法進(jìn)行，或按照所用產(chǎn)品生產(chǎn)廠商的使用說明。下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可通過商業(yè)途徑得到。
[0020]實(shí)施例1:三種典型非留體抗炎藥類新型污染物(雙氯芬酸、醋氨酚和布洛芬)對斑馬魚早期生活階段胚胎毒性效應(yīng)評估
[0021](I)預(yù)試驗(yàn)
[0022]實(shí)驗(yàn)前先挑選活潑健康的短尾斑馬魚雌雄成魚(I: I)放入曝氣24h后的自來水水槽中，保持水槽溫度26 ± I °C左右。為了防止魚自食其卵，放紗網(wǎng)于水槽中，然后蓋上紙箱避光。并于次日早晨撈出親魚，用虹吸的方法收集胚胎于大燒杯中。在解剖顯微鏡下挑選正常發(fā)育、形態(tài)完好的胚胎；分裂正常的胚胎不粘沉并且呈現(xiàn)透明，未受精胚胎粘沉呈乳白色，未受精胚胎不分裂或者分裂形狀明顯不規(guī)則(不均衡或水腫)或卵膜壞損或者黑色。
[0023]毒性效應(yīng)評估實(shí)驗(yàn)開展前先進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)以確定雙氯芬酸、醋氨酚和布洛芬三種目標(biāo)化合物對斑馬魚胚胎的全致死和全存活濃度范圍(加標(biāo)組5濃度2水平)，具體設(shè)置為:雙氯芬酸暴露濃度0.30、1.20,4.80、19.2,76.8mg/L ;醋氨酚暴露濃度0.05,0.20,0.80、3.20、12.8mg/L ;布洛芬暴露濃度0.20,0.80,3.20、12.8,51.2mg/L。此外，實(shí)驗(yàn)開始前會先繁殖斑馬魚數(shù)次，以便觀察正常胚胎發(fā)育并統(tǒng)計(jì)胚胎的孵化率，胚胎孵化率達(dá)到90%以上方可進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。胚胎暴露實(shí)驗(yàn)在恒溫光照培養(yǎng)箱中進(jìn)行，保持溫度為25土1°C左右，光照周期為14h光照:1h黑暗。選用玻璃平板(9cm培養(yǎng)皿)作為染毒實(shí)驗(yàn)容器，加入20mL試驗(yàn)試液和12枚胚胎。采用半靜態(tài)法，即在實(shí)驗(yàn)開始第二天每隔24h更換新鮮同等濃度溶液，更換體積可達(dá)容器容量的1/2。胚胎連續(xù)暴露7天，每隔24h進(jìn)行觀察和數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，并及時(shí)更換新鮮同等濃度溶液。每次所更換的實(shí)驗(yàn)溶液均由同一母液現(xiàn)配得到。在倒置顯微鏡下觀察并記錄斑馬魚胚胎暴露24、48、7