一種快速檢測羊肚菌菌絲活力的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種檢測酶活的方法，更具體的說是一種檢測食藥用菌菌絲活力的方 法，屬于生理活性物質(zhì)檢測領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 羊肚菌（MorchellaesculentaL.)又名美味羊肚菌，俗稱羊雀菌、包谷菌等，按 Ainsworth分類系統(tǒng)隸屬于子囊菌亞門（Ascomycotina)、盤菌綱（Discomycetes)、盤菌目 (Pezizales)、羊肚菌科（Morchellaceae)、羊肚菌屬（Morchella)。由于其菌蓋是一個布滿 凹陷和棱脊的網(wǎng)狀體，形狀似羊肚而得名。羊肚菌具有極高的營養(yǎng)價值和藥用價值，是一類 大型的食用兼藥用真菌。據(jù)測定，羊肚菌的蛋白質(zhì)含量為22. 1%，含19種氨基酸以及鋅、 硒、鐵、鍺、銅等多種微量元素和維生素&、B2、B12、煙酸、泛酸、生物素等多種維生素，其中包 括8種人體必需氨基酸，占氨基酸總量的47. 5% ( -般食用菌為25%~40% )，高于玉米、 小麥、大豆和肉類食品，有些營養(yǎng)成分的含量超過了 "冬蟲夏草"?，F(xiàn)代醫(yī)學研宄表明，羊肚 菌有降血脂，調(diào)節(jié)免疫功能，抗疲勞、抗輻射、抗腫瘤作用，并能減輕癌癥患者放化療引起的 毒副作用。
[0003] 羊肚菌在國際市場上供不應(yīng)求，且價格居高不下。因此，人工栽培羊肚菌一直是食 用菌界最感興趣的課題之一。我國目前已經(jīng)成功栽培出羊肚菌，云南利用椴木栽培羊肚菌， 四川是利用耕地栽培羊肚菌。
[0004] 羊肚菌菌種與其它食藥用菌一樣，屬于真菌，遺傳變異顯著，優(yōu)良性狀不能完全穩(wěn) 定遺傳，且易老化或退化，給批量栽培帶來了極大風險，也是比較棘手的問題。
[0005] 如何選擇優(yōu)良的生產(chǎn)種是栽培成功的關(guān)鍵，傳統(tǒng)的方法是依據(jù)形態(tài)特征、生理生 態(tài)特性和栽培習性進行選種，但是羊肚菌菌種要求外界條件嚴格，受外界因素影響明顯，導(dǎo) 致該法不準確，且費時費力。如果能在羊肚菌菌絲生長階段快速、準確的檢測菌種活力將大 大提高選種效率，同時節(jié)省成本。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的在于提供一種快速檢測羊肚菌菌絲活力的方法。
[0007] 為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案為：一種快速檢測羊肚菌菌絲活力的方 法，包括如下步驟：
[0008] 1)菌絲培養(yǎng)：將待測菌株于母種平板培養(yǎng)基中培養(yǎng)后，切取平板上的菌塊，轉(zhuǎn)至 液體深層培養(yǎng)基中震蕩培養(yǎng)，得菌液。
[0009] 優(yōu)選的，將待測菌株于母種平板培養(yǎng)基中，23°C下培養(yǎng)10d后，切取平板上的菌 塊，轉(zhuǎn)至液體深層培養(yǎng)基中，23°C下150rpm震蕩培養(yǎng)6d，得菌液。
[0010] 優(yōu)選的，所述的母種平板培養(yǎng)基是：按重量百分比，去皮馬鈴薯20%，葡萄糖2%， 蛋白胨0.3%，腿 2?04 0.3%，]\%504.71120 0.15%，口11值7，水余量。
[0011] 優(yōu)選的，所述的液體深層培養(yǎng)基是：按重量百分比，去皮馬鈴薯20%，葡萄糖2%， 蛋白胨 0.3%，KH2P04 0.3%，MgS04.7H20 0.15%，維生素BJOmg/L，水余量。
[0012] 2)樣品前處理：取菌液于離心管中，離心，去除上清液，提取菌絲，以生理鹽水沖 洗菌絲。
[0013] 優(yōu)選的，取菌液于離心管中，4°C12000rpm離心5min，去除上清液，取菌絲，以生理 鹽水沖洗菌絲。
[0014] 3)配制待測菌液：稱量菌絲重量，加入水，配成待測菌液。
[0015] 優(yōu)選的，待測菌液的濃度為0. 1-0. 2g/mL。更優(yōu)選的，待測菌液的濃度為0. 15g/ mL〇
[0016] 4)與TTC反應(yīng)：準確移取待測菌液、Tris-HCl緩沖液和TTC(2,3,5-氯化三苯基四 氮唑）溶液至離心管中反應(yīng)。
[0017] 優(yōu)選的，準確移取待測菌液、Tris-HCl緩沖液和TTC溶液至離心管中，于37°C下反 應(yīng) 2-4h。
[0018] 優(yōu)選的，所述的Tris-HCl緩沖液的pH值為8. 4。
[0019] 5)終止反應(yīng)：反應(yīng)后，立即將反應(yīng)液放置冰上，4°C離心，得細胞沉淀，于離心后的 細胞沉淀中加入萃取劑，得萃取液。
[0020] 優(yōu)選的，所述的萃取劑是無水乙醇。
[0021] 6)測定萃取液0D485:將萃取液離心，取上清液，于485nm波長下測定吸光度值。
[0022] 優(yōu)選的，將萃取液于12000rpm離心5min，取上清液，于485nm波長下測定吸光度值 0D485〇
[0023] 本發(fā)明的有益效果是：
[0024] 1.本發(fā)明測定結(jié)果穩(wěn)定可靠、重現(xiàn)性好、準確度高。酶是非常有效和特異性高的生 物催化劑。由于酶對環(huán)境條件的影響非常敏感，因此酶活性測定的影響因素較多，包括酶的 濃度、緩沖液類型、pH值、溫度、時間等，而且不同生物體不同酶活性的測定條件并不一致。 本發(fā)明根據(jù)羊肚菌的特性，使TTC不易擴散進入細胞中的特點，經(jīng)過反復(fù)試驗，優(yōu)化出最佳 試驗方案，各種條件準確可控，測定結(jié)果準確度高、重現(xiàn)性好，并且穩(wěn)定可靠。
[0025] 2.本發(fā)明所用藥品、儀器種類少，試驗步驟簡單，便于操作，易于學習和掌握。
[0026] 3.本發(fā)明反應(yīng)速度快，測定吸光度值簡單、快速，整個檢測過程時間短。
[0027] 4.本發(fā)明所用藥品、試劑便宜，用量少，試驗成本低。
[0028] 5.通過本發(fā)明的方法可以快速檢測出羊肚菌菌種的優(yōu)劣，再應(yīng)用于擴大化生產(chǎn) 中，提高了成品的優(yōu)質(zhì)產(chǎn)率。
【具體實施方式】
[0029] 實施例一種快速檢測羊肚菌菌絲活力的方法
[0030] (一）供試菌株：所用供試菌株見表1。
[0031] 表1供試菌株
[0032]
[0033] (二）試劑：
[0034] Tris-HCl緩沖液：pH8. 4 ;隨用隨配。
[0035] TTC溶液：重量百分濃度為0. 5 % ;隨用隨配。
[0036] 生理鹽水：重量百分濃度為0. 85% ;
[0037] 母種平板培養(yǎng)基：按重量百分比，去皮馬鈴薯20%，葡萄糖2%，蛋白胨0. 3%， 腿丨04 0.3%，]^04,71120 0.15%邛11值7，水余量。
[0038] 液體深層培養(yǎng)基：按重量百分比，去皮馬鈴薯20%，葡萄糖2%，蛋白胨0. 3%， KH2P04 0? 3%，MgS04 ? 7H20 0? 15%，維生素BilOmg/L，水余量。
[0039] (三）快速檢測羊肚菌菌絲活力的方法
[0040] 1)菌絲培養(yǎng)
[0041] 將待測菌株于母種平板培養(yǎng)基中，23 °C下培養(yǎng)10d后，切取平板上的菌塊(lcmXlcm) 2塊，轉(zhuǎn)至液體深層培養(yǎng)基中，23°C下150rpm震蕩培養(yǎng)6d，得菌液。
[0042] 2)樣品前處理
[0043] 取2mL菌液于離心管中，4°C12000rpm離心5min，去除上清液，取菌絲，以1ml生理 鹽水沖洗菌絲，4°C12000rpm離心5min，去除上清液，重復(fù)4次。
[0044