一種熒光探針在過氧化氫分子檢測中的應用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設及一種巧光探針在過氧化氨分子檢測中的應用,屬于分析化學技術(shù)領(lǐng) 域。
【背景技術(shù)】
[0002] 活性氧(R0S)是生物體內(nèi)在很多生理和病理過程起著非常重要作用的一些含氧自 由基(哲基自由基和超氧陰離子自由基等)和非自由基(過氧化氨和次氯酸等)的總稱。生物 體內(nèi)在氧化應激、炎癥等生理和病理情況下通過酶促和非酶促反應產(chǎn)生各種R0S。近代的生 物醫(yī)學研究表明,體內(nèi)產(chǎn)生的R0S與一些疾病的發(fā)生、發(fā)展和機體的老化有著密切的關(guān)系。 過氧化氨(&〇2)作為信號分子參與各種各樣的信號傳導過程,也是氧化應激等相關(guān)疾病的 標記物,抵抗病原物的侵害,W及介導細胞死亡等。在細胞內(nèi),細胞因子,生長因子和神經(jīng)遞 質(zhì)等激活白細胞氧化酶(NADPH氧化酶),催化細胞周圍環(huán)境中的氧生成&〇2。體內(nèi)適量水平 的&〇2對生物正常的生理過程是有益的,它們參與細胞內(nèi)蛋白質(zhì)的可逆氧化,調(diào)節(jié)蛋白質(zhì) 的磯酸化到基因表達等細胞過程。然而,體內(nèi)&〇2濃度的異常變化也與人類的許多疾病密 切相關(guān),例如癌癥,糖尿病,屯、血管疾病和神經(jīng)系統(tǒng)性疾病。因此,檢測生物體系中&化的產(chǎn) 生與動態(tài)變化對于調(diào)查研究相關(guān)疾病的發(fā)生、發(fā)展與研究&〇2的功能是非常重要的。
[0003] 然而目前對&〇2的檢測缺少祀向性,不能對細胞內(nèi)某一特定的細胞器內(nèi)的過氧化 氨進行檢測,特別缺少對細胞內(nèi)溶酶體祀向的過氧化氨探針,從而缺少研究細胞病變過程 中對溶酶體中過氧化氨濃度變化情況的檢測工具。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0004] 針對目前過氧化氨分子巧光探針檢測所面臨的問題現(xiàn)狀,本發(fā)明通過分子設計, 合成出一種具有響應時間快W及溶酶體祀向性的過氧化氨分子巧光探針,簡記為Lys-&化,可W檢測細胞溶酶體中的過氧化氨,與商業(yè)化溶酶體紅進行共定位實驗其共定位系數(shù) 為 0.94。
[0005] 本發(fā)明采用W下技術(shù)方案: 一種如式I所示的巧光探針在過氧化氨分子檢測中的應用,其特征在于,所述巧光探 針用于水環(huán)境和細胞溶酶體中過氧化氨的含量傳感檢測;所述的傳感檢測包含巧光檢測, 目視定性檢測,細胞成像檢測;
[0006] 上述過氧化氨分子巧光探針的合成路線如下:
上述過氧化氨分子巧光探針的制備方法如下: 1) 將leq的4-漠-1,8-蒙二甲酸酢與leq的N-(2-氨基己基)嗎咐溶于己醇中,氮 氣保護,100°C加熱回流,反應5h,用T化板檢測反應,反應完全后,用己酸己醋萃取,無水硫 酸鋼干燥,旋干,并用硅膠柱進行分離,得到化合物1,其結(jié)構(gòu)式如下:
2) 將leq化合物1,1. 5eq聯(lián)棚酸頻哪醇醋與3eq己酸鐘溶于1,4-二氧六環(huán)中,再加 入0.leq的雙(二苯基磯基)二茂鐵氯化鈕,氮氣保護,加熱回流,反應10h,用T化板檢測 反應,反應完全后,用己酸己醋萃取,無水硫酸鋼干燥,旋干,并用硅膠柱進行分離,得到目 標探針化合物Lys-Hg化。
[0007] 所述步驟1)中硅膠柱分離洗脫劑配比為甲醇;二氯甲燒=1:40。
[0008] 所述步驟2)中硅膠柱分離洗脫劑配比為己酸己醋甫油離=1: 1。
[0009] 本發(fā)明的優(yōu)點;(1)本發(fā)明實現(xiàn)了 &〇2分子探針的選擇性快速檢測,并且選擇性 好,抗其他分子干擾能力強。此外,用肉眼就可W觀察到溶液顏色的變化,伴隨著紫外燈下 同樣可W觀察到巧光顏色變化,是一種具有生色傳感功能的巧光探針。(2)此探針可W應 用于檢測細胞內(nèi)溶酶體中的過氧化氨的檢測,通過與商業(yè)化溶酶體染料進行比較其對溶酶 體內(nèi)過氧化氨成像的重合率高,兩種染料的共定位系數(shù)為0.94,說明此探針可W作為細胞 內(nèi)溶酶體內(nèi)過氧化氨檢測探針。基于此探針的特異性且顯著的顏色變化,該試劑也可作為 顯示水溶液中過氧化氨分子存在的專一性指示劑,可進行實時定性及定量的目視比色法檢 巧。。故而,本發(fā)明是一種簡單,快速,靈敏的過氧化氨分子特異性檢測試劑,在生物分子檢測 領(lǐng)域具有廣闊的應用前景。
【附圖說明】
[0010] 圖1是實施例1中探針Lys-H2〇2的電NMR圖譜; 圖2是探針Lys-H2〇2隨過氧化氨的加入巧光譜圖的變化情況; 圖3是探針Lys-H2〇2對不同離子和分子的選擇性巧光譜圖; 圖4是探針Lys-H2化對不同離子和分子的選擇性柱狀圖數(shù)據(jù),其中1.空白;2.谷脫 甘膚;3.過氧叔了醇;4.過氧叔了離;5.Mn(V; 6.S2-; 7.畑2畑2; 8.畑3; 9.S〇32-; 10.SO42-; 圖5是探針Lys-H2〇2溶液在過氧化氨加入前后溶液顏色的變化圖; 圖6是探針Lys-H2〇2溶液在過氧化氨加入前后溶液用紫外燈照射后巧光顏色的變化 圖; 圖7是探針Lys-H2〇2檢測外源性過氧化氨巧光成像圖,圖中a)過氧化氨加入前巧光成 像圖,b)探針濃度為5yM加入到Si化細胞中培養(yǎng)30min后明場圖,C)過氧化氨20yM加 入后5min后的綠通道巧光成像圖,d)明場與巧光成像圖重合圖片; 圖8是Lys-H2化巧光探針檢測外源性過氧化氨巧光成像圖與商業(yè)化染料溶酶體紅的共 定位成像圖,圖中a)探針濃度為5yM與溶酶體紅加入到Si化細胞中培養(yǎng)30min后明場 圖,b)加入雙氧水后綠通道巧光成像圖,C)商業(yè)染料溶酶體紅巧光成像圖,d)明場、綠通 道與紅通道疊加圖,e)綠通道與紅通道疊加圖,f)綠通道與紅通道疊加箭頭部分巧光強 度比較,g)綠通道與紅通道疊加畫圈部分強度散點圖。
【具體實施方式】
[0011] 下面結(jié)合具體實施例和附圖對本發(fā)明做進一步的詳細說明。
[001引實施例1 1)化合物1的合成:
將4-漠-l,8-蒙二甲酸酢(2.77g,10mmol,leq)與N-(2-氨基己基)嗎咐a.3mg, 10mmol,leq)溶于50血己醇中,氮氣保護,100°C加熱回流,反應5h。用TCL板檢測反應, 反應完全后,用己酸己醋萃取,無水硫酸鋼干燥,濃縮,并用硅膠柱進行分離,硅膠顆粒大小 為200-300目,洗脫劑配比為甲醇/二氯甲燒=1:40,產(chǎn)率為80%。
[001引 2 )化合物Lys-H202的合成:
將化合物 1 (500mg,1.29mmol,leq),聯(lián)棚酸頻哪醇醋(688mg,1.93mmol, 1.5eq) 與己酸鐘(378mg,3. 86mmol, 3eq)溶于20mL1,4-二氧六環(huán)中,再加入雙(二苯基磯基) 二茂鐵氯化鈕(94. 4mg,0.013mmol,O.leq),氮氣保護,加熱回流,反應10h,用TCL板檢 測反應,反應完全后,用己酸己醋萃取,無水硫酸鋼干燥,濃縮,并用硅膠柱進行分離,硅膠 顆粒大小為200-300目,洗脫劑配比為己酸己醋/石油離=1: 1,產(chǎn)率為76%。其核磁譜圖如 圖 1 所示。iH-NMR(400MHz,DMS0) 5 9. 15 (dd, /= 8. 5,1.0Hz, 1H), 8. 59 化 / =7. 3Hz,IH), 8. 33 (d, /= 7. 3Hz,IH), 7.81 (dd, /= 8.4,7.4Hz,IH), 4. 38 (s, 2H), 3.71 (s, 4H), 2.69 (d, / = 43.0Hz, 6H), 1.47 (s,IIH). 實施例2 化合物Lys-H202過氧化氨巧光探針隨過氧化氨加入當量的增加巧光譜圖的變化 取實施例1制備的Lys-H202過氧化氨巧光探針溶于N,N-二甲基甲酯胺(DMF)中,制成Immol/L儲備液。從儲備液中取出30yL加入到5血的離屯、管當中,加入不同當量(0-80 eq)的過氧化氨標準溶液,用PBS緩沖溶液(0.lmol/l,pH=7. 5)與DMF體積比為1:1的溶液 稀釋至3mU測量其巧光性質(zhì)。,W410nm為激發(fā)光,巧光光譜如圖2所示。由圖2可見, 隨著過氧化氨加入當量的增加巧光逐漸增強。
[0014] 實施例3 化合物Lys-H2〇2過氧化氨巧光探針對不同分子或離子的選擇性 從實施例2中巧光探針儲備液中取出30uL加入到5mL的離屯、管當中,分別加入等 摩爾量的競爭分子標準溶液,其中一個加入等摩爾量的過氧化氨標準溶液,30min后W410 nm為激發(fā)光檢測溶液的巧光發(fā)射光譜變化,由圖3和圖4可W發(fā)現(xiàn),其他金屬離子對化 合物Lys-H2化的巧光幾乎沒有影響,而過氧化氨溶液的加入使化合物Lys-H2化的巧光顯著 增強。
[0015] 實施例4 化合物Lys-H2〇2巧光探針對過氧化氨的可視化檢測 從實施例2中巧光探針儲備液中取出30UL加入到5mL的樣品管當中,加入80摩爾 量的過氧化氨標準溶液,如圖5所示,過氧化氨可W使合物Lys-&化巧光探針的PBS;DMF體 積比為1:1的緩沖溶液發(fā)生明顯的顏色變化,溶液顏色從無色變成黃色。伴隨著紫外燈下 肉眼可視的過氧化氨誘導巧光探針發(fā)出明亮的黃色巧光(圖6),說明是一種具有生色傳感 功能的夾光換針。
[001引 實施例5 化合物Lys-H202過氧化氨巧光探針對細胞外源性過氧化氨巧光成像 我們將本發(fā)明探針用于SiHa細胞中對外源性的過氧化氨進行巧光成像應用(圖7)。具 體操作步驟如下:將5yMLys-H202過氧化氨探針DMF溶液加入到育有Si化細胞的培養(yǎng)液 中在二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)30min后用共聚焦顯微鏡進行成像。首先進行明場成像,可W 看到細胞大致的輪廓。然后用藍光進行激發(fā)觀察在未加入過氧化氨前的巧光成像情況,此 時觀察不到巧光發(fā)射。向體系中加入20yM的過氧化氨水溶液后,等待5min后在用藍光進 行激發(fā)可W觀察到有綠光發(fā)出,說明此巧光探針可W對外源性的過氧化氨進行巧光成像。 [0017]實施例6 化合物Lys-H2〇2過氧化氨巧光探針對細胞外源性過氧化氨巧光成像與商業(yè)溶酶體染 料共定位比較 我們將本發(fā)明探針應用于Si化細胞中與商業(yè)化的溶酶體染料進行共定位實驗,說明 本探針可W定位到溶酶體中,并對溶酶體內(nèi)的外源性的過氧化氨進行巧光成像應用(圖8)。 具體操作步驟如下;將5yM Lys-H2〇2過氧化氨探針DMF溶液和商業(yè)化溶酶體染料-溶酶 體紅5uM加入到育有Si化細胞的培養(yǎng)液中在二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)30min后,向體系中 加入20yM的過氧化氨水溶液后,再等待10min后用共聚焦顯微鏡進行成像,此時用藍光 (Ex=488nm)進行激發(fā)可W觀察到有綠光發(fā)出,此為Lys-H2〇2過氧化氨探針與過氧化氨響 應后發(fā)射的光,用綠光(Ex=561nm)進行激發(fā)可W觀察到有綠光發(fā)出,此為商業(yè)化染料溶酶 體紅發(fā)出的紅光,用軟件進行處理可W得出兩種染料的共定位系數(shù)為0. 94。
【主權(quán)項】
1. 一種如式I所示的熒光探針在過氧化氫分子檢測中的應用,其特征在于,所述熒光 探針用于水環(huán)境和細胞溶酶體中過氧化氫的含量傳感檢測;所述的傳感檢測包含熒光檢 測丨_曰細由株始-遍丨-細梅檢測J;
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種熒光探針在過氧化氫分子檢測中的應用,所述熒光探針用于水環(huán)境和細胞溶酶體中過氧化氫的含量傳感檢測;所述的傳感檢測包含熒光檢測,目視定性檢測,細胞成像檢測。本發(fā)明實現(xiàn)了H2O2分子探針的選擇性快速檢測,并且選擇性好,抗其他分子干擾能力強。此外,用肉眼就可以觀察到溶液顏色的變化,伴隨著紫外燈下同樣可以觀察到熒光顏色變化,是一種具有生色傳感功能的熒光探針。此探針可以應用于檢測細胞內(nèi)溶酶體中的過氧化氫的檢測,通過與商業(yè)化溶酶體染料進行比較其對溶酶體內(nèi)過氧化氫成像的重合率高,兩種染料的共定位系數(shù)為0.94。
【IPC分類】G01N21/29, G01N21/64
【公開號】CN104949946
【申請?zhí)枴緾N201510307821
【發(fā)明人】林偉英, 任明光, 鄧貝貝
【申請人】濟南大學
【公開日】2015年9月30日
【申請日】2015年6月8日