麥角硫因的檢測方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物化學(xué)技術(shù)、分析化學(xué)領(lǐng)域，涉及麥角硫因及其含量的測定方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 麥角硫因化-Ergothioneine，EGT)是一種稀有的天然手性氨基酸類強抗氧化劑， 是一種獨特的細胞生理保護劑，具有抗氧化，馨合金屬離子，防止紫外福射W及調(diào)節(jié)生物能 量、基因表達、免疫系統(tǒng)等諸多功能。由于麥角硫因特殊的生物學(xué)功能和藥理活性，如；對抗 炎癥，防御神經(jīng)組織退化，阻止銅引發(fā)DNA和蛋白質(zhì)發(fā)生氧化損傷，抑制發(fā)育性缺陷，保護 肝臟等，并且人和動物攝入后不會產(chǎn)生任何的毒副作用，屬于通常認為安全的（generally recognized as safe, GRAS)廣品，因此，麥角硫因在醫(yī)藥、食品、保健品和化妝品等打業(yè)具 有廣泛的應(yīng)用前景。
[0003] 麥角硫因的制備方法有化學(xué)合成法、天然生物提取法和生物合成法。食用覃菌深 層發(fā)酵生物合成麥角硫因具有產(chǎn)量高、成本低、易實現(xiàn)規(guī)?；a(chǎn)及產(chǎn)品安全等優(yōu)勢。覃菌 發(fā)酵合成的麥角硫因絕大部分積累于菌絲體內(nèi)，因此快速準確地檢測菌絲體和發(fā)酵液中的 麥角硫因，對于麥角硫因的研究和生產(chǎn)都至關(guān)重要。
[0004] 至今尚沒有麥角硫因檢測方法的標準。國內(nèi)外基本采用高壓液相色譜 技術(shù)測定麥角硫因，所用檢測柱普遍為反相Ci8柱?；痽nh N.D.Bao利用兩根串聯(lián) 的Symmet;ryaiield?Ci8柱（250mmX4. 6mm，5]im)定量測定從金針茹子實體中提 取的麥角硫因，使用的流動相是抑7. 3含有3%己膳和0. 1% H己胺的磯酸軸緩沖 液（Huynh N. D. Bao a,Yoichi Shinomiya b,Hiroaki Ikeda, et al.,Preventing discoloration and lipid oxidation in dark muscle of yellowtail by feeding an extract prepared from mushroom(Flammulina velutipes)cultured medium[J]. Aquaculture，2009,doi:10. 1016/j. aquaculture. 2009.06. 042. )。N. Joy Dubost 采 用兩根串聯(lián)的Econos地ere Ci8柱（250mmX4. 6mm，5]im)分離檢測從覃菌子實體中提 取的麥角硫因，使用的流動相是抑7. 3含有3%己膳和0. 1% H己胺的磯酸軸緩沖液 (N. Joy Dubost,BoxinOu,Robert B.Beelman. Quantification of polyphenols and ergothioneine in cultivated mushrooms and correlation to total antioxidant capacity[J]. Food Qiemistry, 2007, 105:727-735.)。周念波使用 Hypersil ODS Ci8 柱（2 50mm X 4. 6mm，5 y m )測定從雙抱茹子實體中提取的麥角硫因，所用流動相為己 膳-水（3 : 97, v/v)溶液(周念波，朱艷琴，殷勤紅.高效液相色譜法測定雙抱茹中 麥角硫因的含量[J].食品科技，2010, 35(10) : 271-272. )。Chih-Hung Liang 利用 化rospherlOOClS柱測定從杏鮑茹深層發(fā)酵的菌絲體中提取的麥角硫因，所用流動相為含 有 3% 己膳和 0. 1% H己胺的磯酸軸緩沖液（Oiih-Hung Liang, Ling-Yi Huang, Kung-Jui Ho, et al. Submerged cultivation of mycelium with high ergothioneine content from the culinary-medicinal king oyster mushroom Pleurotus eryngii (higher basidiomycetes)and its composition[J]. International Journal of Medicinal Mus虹ooms，2013, 15 (2) : 153-164,）。姜文俠、劉埼和周濤建立的反相高壓液相色譜檢測方 法是；色譜柱為Agilent Eclipse XDB-Cis柱，兩根串聯(lián)使用，流動相為甲醇-水（1 : 99， v/v)溶液(姜文俠，劉埼，周濤.麥角硫因的檢測方法[P]. CN201210392294.8.)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的是提供另一種麥角硫因的檢測方法，本方法基于與反相Ci8色譜不 同的分離機理。本發(fā)明技術(shù)方案的特點在于采用親水作用色譜（Hy化ophilic Interaction Liquid化romatography, HILIC)分析檢測麥角硫因，所述高壓液相檢測方法的色譜條件如 下：
[0006] 采用HILIC填料作為色譜分析的固定相，色譜柱規(guī)格250mmX4. 6mm ;檢測波長 250~260皿，優(yōu)選254皿；流動相為己膳-水溶液。
[0007] 上述麥角硫因的高壓液相檢測方法，其中所述流動相為（80~95) : (20~5)的己 膳-水（v/v)，使用lOmmol/L~40mmol/L的己酸饋緩沖液調(diào)節(jié)流動相的抑至5. 6~8. 0， 優(yōu)選（85~95) : (15~5)的己膳-水溶液（v/v)，lOmmol/L~25mmol/L的己酸饋緩沖液 調(diào)節(jié)流動相抑至6. 0~8. 0 ;柱溫為25~45C，優(yōu)選30~4(TC，最優(yōu)選4(TC ;進樣量及 流速分別根據(jù)樣品濃度和上樣量而定，記錄時間為40min，麥角硫因的出峰時間在19min~ 25min。
[000引本發(fā)明的麥角硫因的定量檢測方法中，標準曲線的繪制及待測樣中麥角硫因的定 量方法如下：
[0009] 1)麥角硫因?qū)φ掌返念A(yù)處理步驟，包括制備含不同濃度的麥角硫因?qū)φ掌返娜?液；
[0010] 2)對含不同濃度的麥角硫因?qū)φ掌返娜芤悍謩e進行本發(fā)明所述的高壓液相色譜 檢測；
[0011] 3)根據(jù)麥角硫因?qū)φ掌返臐舛扰c相應(yīng)的高壓液相色譜峰面積繪制標準曲線；和
[0012] 4)對麥角硫因待測樣品進行本發(fā)明所述的高壓液相色譜檢測，根據(jù)檢測結(jié)果的出 峰時間和峰面積，比照對照品的出峰時間和標準曲線，對待測樣品中的麥角硫因的含量進 行定量。
[0013] 其中，麥角硫因?qū)φ掌返念A(yù)處理步驟包括，精密稱取一定量的麥角硫因?qū)φ掌罚?純水配制成一定濃度梯度的麥角硫因?qū)φ掌啡芤?；?jīng)微孔濾膜過濾，即得含不同濃度的麥 角硫因?qū)φ掌返娜芤?。上述微孔濾膜過濾步驟中選擇孔徑0. 1~0. 45 y m的微孔濾膜，優(yōu) 選0. 22 y m孔徑的微孔濾膜。
[0014] 具體地，對含不同濃度的麥角硫因?qū)φ掌返娜芤哼M行高壓液相色譜檢測的條件， 與上述的麥角硫因樣品的高壓液相色譜檢測方法中使用的條件相同。
[0015] 所述的系統(tǒng)適應(yīng)性試驗按照常規(guī)方法進行，包括檢測限、定量限、精密度、重復(fù)性、 穩(wěn)定性、回收率的考察。
[0016]本發(fā)明的優(yōu)勢在于；首次采用HILIC色譜柱分析和檢測麥角硫因，由于親水色譜 是一種用來改善在反相色譜中保留較差的強極性物質(zhì)保留行為的色譜技術(shù)，通過采用強極 性固定相一高純硅膠鍵合中性親水醜胺基團，同時結(jié)合高比例有機相/低比例水相組成 的流動相來實現(xiàn)對強極性化合物的保留和分離的目的，尤其適用于普通反相色譜難W保留 的物質(zhì)的分離檢測。
[0017] 應(yīng)用本發(fā)明的方法分析檢測麥角硫因，達到了理想的保留及洗脫效果，麥角硫因 與雜質(zhì)有效分離，目的峰明顯。本發(fā)明中的檢測條件穩(wěn)定、通用性強，適用于不同的HILIC 分析柱W及對不同的麥角硫因樣品進行分析測定。
【附圖說明】
[0018] 圖1是實施例6中W V冊10525BXN0068分析柱檢測的麥角硫因樣品溶液的HPLC 圖譜；
[0019] 圖2是實施例7中W V冊10525BXN0095分析柱檢測的麥角硫因樣品溶液的HPLC 圖譜；
[0020] 圖3是實施例7中W V冊10525BXN0096分析柱檢測的麥角硫因樣品溶液的HPLC 圖譜；
[0021] 圖4是實施例9中麥角硫因的HPLC標準曲線。
【具體實施方式】
[0022] 本發(fā)明的W下實施例僅用來說明實現(xiàn)本發(fā)明的【具體實施方式】，該些實施方式不能 理解為是對本發(fā)明的限制。相反，本發(fā)明不僅要包括該些實施方式，而且還要涵蓋其它的任 何在未背離本發(fā)明的精神實質(zhì)與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡化。
[0023] 主要儀器：高壓液相色譜儀（Agela LC-10F)和HILIC分析色譜柱 (V冊10525BXN0068、V冊10525BXN0095、V冊10525BXN0096)均為天津博納艾杰爾科技有限公 司生產(chǎn)；中空纖維超濾膜（4kDa，天津愛生膜過濾技術(shù)有限公司）；微孔濾膜（0.22ym，天津 博納艾杰爾科技有限公司）；水?。═W20型，化1油0);數(shù)字式加熱磁力攬拌器（MIX Control 20型，WIGGENS);高速臺式冷凍離也機（T化-16M型，湘儀離也機儀器有限公司）；超聲機 (SB-5200D型，寧波新芝生物科技股份有限公司）。
[0024] 主要試劑：麥角硫因?qū)φ掌罚兌?gt; 98%, Biomol International Inc.);己膳、甲 醇、丙麗、己醇等試劑均為市售色譜純。化學(xué)試劑K&PCV M拆〇4 ? 7&0、化OH、化2冊〇4、巧樣 酸、己酸饋等，購自國藥集團化學(xué)試劑有限公司。玉米粉購自梅河口市興達米業(yè)有限責任 公司，豆稍粉購自北京中棉紫光生物科技有限公司，a -淀粉酶購自北京索萊寶科技有限公 司，甘油購自天津市風船化學(xué)試劑科技有限公司，酪蛋白腺購自偃師市百家工貿(mào)有限公司。 [00巧]實施例1 ;趟皮側(cè)耳（Pleurotus ostrea1:us)CGMCC No. 6232菌絲體發(fā)酵液的制備
[0026] 斜面培養(yǎng)基；PDA 培養(yǎng)基（Becton, Dickinson and Company)。
[0027] 液體種子培養(yǎng)基（g/L);玉米粉30g/L、豆稍粉15g/L、a -淀粉酶54U/L、KH2P〇43g/ L、M拆〇4.7&01. 5g/L，其余為水，于12rC滅菌20min，在500血H角瓶中的裝液量為150血。 [002引液體發(fā)酵培養(yǎng)基（g/L);甘油50g/L、酪蛋白腺35g/L、KH2P043g/L、M拆04 '7&01. 5g/ 以其余為水，其余為水，12rC滅菌20min，500mLH角瓶中裝液量為1