度值可基于細(xì)胞面積和直徑來計(jì)算，如(4X面積)/(π X直徑2)。采用該式，對于不完全圓的細(xì)胞(例如具有伸長的長而薄的形狀)的檢測值可以是O或接近0，而在X，y平面完全變圓的細(xì)胞的檢測值是I。
[0060]具有可由腎近曲小管細(xì)胞毒素在細(xì)胞中誘導(dǎo)的形貌變化的同時(shí)，所述細(xì)胞的某些細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)成分的排列也可能有變化。例如，在本方法中，目前已發(fā)現(xiàn)肌動(dòng)蛋白纖維排列以及微管排列的變化與的PT特異性毒性相關(guān)。因此，可檢測F-肌動(dòng)蛋白或微管蛋白的排列。通過對F-肌動(dòng)蛋白或微管蛋白進(jìn)行特定染色，可觀察到肌動(dòng)蛋白纖維或微管和非聚合微管蛋白的圖案。所述細(xì)胞骨架變化可能與細(xì)胞面積和圓度的變化相關(guān)。多項(xiàng)特征的變化可通過多變量性能檢測手段(例如通過評估Haralick質(zhì)地特征)同時(shí)檢測。市售軟件程序可用于進(jìn)行所述檢測和計(jì)算。
[0061]PT特異性的腎毒性化合物還可減少測試群中完整細(xì)胞的數(shù)量。因此，可對細(xì)胞數(shù)量計(jì)數(shù)。例如，細(xì)胞數(shù)量可通過對細(xì)胞群中的完整細(xì)胞核計(jì)數(shù)，或基于對全細(xì)胞體的計(jì)數(shù)來確定。
[0062]由上述說明可見，計(jì)算機(jī)輔助檢測技術(shù)的應(yīng)用有助于檢測形貌特征、細(xì)胞骨架成分排列和細(xì)胞數(shù)量。因此，技術(shù)例如高內(nèi)涵篩選可用于觀察并檢測測試群的形貌特征、細(xì)胞骨架成分排列和細(xì)胞數(shù)量。高內(nèi)涵篩選技術(shù)是本領(lǐng)域中已知并應(yīng)用的。所述技術(shù)可涉及自動(dòng)化圖像分析，以評估表型，包括全細(xì)胞、細(xì)胞結(jié)構(gòu)和細(xì)胞核的表型，并通常涉及高分辨率顯微鏡和自動(dòng)化數(shù)據(jù)收集與分析。所述試驗(yàn)可采用機(jī)械手或自動(dòng)化裝置進(jìn)行，以加快速度?？赏瑫r(shí)評估給定細(xì)胞群的多重參數(shù)，進(jìn)一步加快所述試驗(yàn)的速度和通量。
[0063]一旦評估，將獲自測試群的所測形貌特征和/或細(xì)胞骨架特征和/或細(xì)胞數(shù)量和獲自相同條件下但不與測試化合物接觸的PTC對照群的值做比較。測試群相對于對照群的一項(xiàng)或多項(xiàng)這些特征的變化指示該測試化合物是對腎近曲小管細(xì)胞具有直接毒性的腎毒性物質(zhì)。由此可見，細(xì)胞數(shù)量下降、細(xì)胞面積減小、細(xì)胞圓度增加、F-肌動(dòng)蛋白和/或微管蛋白排列變化和核:全細(xì)胞比例的增大中的一項(xiàng)或多項(xiàng)可指示該測試化合物是對腎近曲小管細(xì)胞產(chǎn)生直接損傷的腎毒性物質(zhì)。
[0064]可能需要設(shè)定形貌參數(shù)和/或細(xì)胞數(shù)量各自的閾值水平。這可通過采用陽性對照群和陰性對照群和一組已知為無毒的化合物、一組已知具有腎毒性但是對腎近曲小管細(xì)胞不具有特異性毒性的化合物，以及一組已知對腎近曲小管細(xì)胞具有特異性毒性的化合物來進(jìn)行。可計(jì)算主要性能量度(performance metrics)，例如陽性預(yù)測值和陰性預(yù)測值?？苫谡骊栃?、假陽性、真陰性和假陰性的數(shù)量來確定選擇性和靈敏度，其通過檢測對照和各組化合物的形貌和細(xì)胞骨架特征以及細(xì)胞數(shù)量來確定。所述方法的可預(yù)測性還通過繪制受者操作特征曲線(ROC)并計(jì)算曲線下面積值來進(jìn)一步確定。所述ROC分析方法是本領(lǐng)域已知并應(yīng)用的。
[0065]或者或此外，為了采用閾值水平來確定毒性，可應(yīng)用比較來自測試群的結(jié)果和來自對照群的結(jié)果的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。被確定為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性的所述兩個(gè)群的結(jié)果之間的差異將指示陽性結(jié)果，即，測試化合物是特異性損傷PTC的腎毒性物質(zhì)。
[0066]對于任何給定的測試化合物而言，可通過測試遞增濃度下的化合物并將各濃度的結(jié)果與對照群結(jié)果做比較來計(jì)算劑量響應(yīng)曲線。通過該方法，可獲得發(fā)現(xiàn)對腎近曲小管細(xì)胞具有毒性的測試化合物的EC5tl或IC 5(|值。
[0067]因此，本文所述的方法可用于預(yù)測化合物在該化合物的臨床相關(guān)濃度下是否對人的PTC有毒性。如上所示，下文實(shí)施例中所述的化合物I?22 (參見圖8)顯示在基于先前已知研宄的已知臨床相關(guān)濃度下呈陽性PTC特異性毒性。這種預(yù)測強(qiáng)度可見于約I μ g/ml?1000 μ g/ml濃度范圍體外測試的化合物。
[0068]本文所述的方法通過下文非限制性實(shí)施例進(jìn)一步說明。
[0069]實(shí)施例
[0070]實(shí)施例1
[0071]觀察到當(dāng)用腎毒性物質(zhì)處理時(shí)，人原生腎近曲小管細(xì)胞(HPTC)顯示細(xì)胞形貌的顯著變化(參見圖1)。并且，觀察到因細(xì)胞死亡所致的細(xì)胞數(shù)量減少。該試驗(yàn)利用細(xì)胞核計(jì)數(shù)以及細(xì)胞形貌(例如細(xì)胞面積和圓度)的變化來評估對HPTC的毒性。
[0072]首先，將細(xì)胞接種進(jìn)入多孔板并培養(yǎng)3天。然后使其接觸測試化合物16小時(shí)。所用細(xì)胞是市售的HPTC(美國典型培養(yǎng)物保藏中心；“ATCC”)和由發(fā)明人從新鮮人腎樣品分離的HPTC。
[0073]細(xì)胞不受處理，或用0.2mg/ml的四環(huán)素(ATCC細(xì)胞)或慶大霉素(發(fā)明人分離物)處理。
[0074]然后，細(xì)胞經(jīng)固定并染色，采用和染色和F-肌動(dòng)蛋白檢測。采用這些腎毒性物質(zhì)的處理導(dǎo)致如下所示形貌變化:F-肌動(dòng)蛋白排列、細(xì)胞面積減小、細(xì)胞圓度增加和由細(xì)胞核數(shù)量減少指示的細(xì)胞數(shù)量減少(圖1)。
[0075]這些變化均可通過HCS定量并且進(jìn)行后續(xù)圖像分析。所述板用HCS篩選并進(jìn)行后續(xù)成像分析。
[0076]實(shí)施例2
[0077]該實(shí)施例采用市售HPTC(ATCC)進(jìn)行。
[0078]將細(xì)胞接種進(jìn)入多孔板并培養(yǎng)3天。然后，細(xì)胞不受處理，或用慶大霉素(2.5mg/ml)、CdCl2(10yg/ml)、馬兜鈴酸(100 μ g/ml)、順鉬(100 μ g/ml)或 DMSO (50 μ g/ml)處理。
[0079]24小時(shí)后，通過相差顯微術(shù)對細(xì)胞成像(圖2，慶大霉素圖像和DMSO圖像未顯示)O
[0080]實(shí)施例3
[0081]采用如下不同類型的腎近曲小管細(xì)胞:HPTC(ATCC)、LLC-PKl細(xì)胞和HK-2細(xì)胞。
[0082]細(xì)胞如實(shí)施例2中所述培養(yǎng)和處理，采用O?500 μ g/ml的CuCl2、CdCl2, K2Cr2O7或替諾福韋(圖3?5)或慶大霉素、四環(huán)素、5-氟尿嘧啶或As2O3 (圖6和7)處理。細(xì)胞經(jīng)染色、成像并計(jì)數(shù)。不同類型的PTC對化合物有差異響應(yīng)，并且HPTC最為敏感(圖3?5)。
[0083]實(shí)施例4
[0084]評估不同濃度的測試化合物對HPTC、HK-2細(xì)胞和LLC-PKl細(xì)胞的活力的影響，并測定各化合物的IC5(I?；诓捎酶邇?nèi)涵篩選測定的細(xì)胞數(shù)量來計(jì)算IC5tl值。若在相關(guān)化合物的最高測試濃度(1000 μ g/ml)下的細(xì)胞活力高于50%，則賦予>1000 μ g/ml的值。在一些情況中未測定細(xì)胞數(shù)量(ND)。
[0085]結(jié)果見表1(圖8)?；衔?-41分別是:1、慶大霉素，2、托普霉素，3、利福平，4、四環(huán)素，5、嘌呤霉素，6、頭孢霉菌素C，7、5-氟尿嘧啶，8、順鉑，9、異環(huán)磷酰胺，10、百草枯，11、氧化砷(III)，12、氧化鉍(III)，13、氧化鎘(II)，14、氯化銅(II)，15、氧化鍺(IV)，16、氯化金(I)，17、乙酸鉛，18、重鉻酸鉀，19、他克莫司，20、環(huán)孢霉素A，21、橘霉素，22、替諾福韋，23、萬古霉素，24、非那西汀，25、醋氨酚，26、布洛芬，27、呋喃苯胺酸，28、氯化鋰，29、林丹，30、乙二醇，31、伐昔洛韋，32、林肯霉素，33、環(huán)丙沙星，34、利巴韋林，35、甘氨酸，36、地塞米松，37、褪黑素，38、左旋多巴(DOPA)，39、三碘甲狀腺氨酸，40、阿卡波糖和41、阿托伐他汀?；衔颕?22對人體具有腎毒性，并且直接損傷腎近曲小管?；衔?3?33對人體具有腎毒性，但不直接損傷腎近曲小管?；衔?4?41對人體無腎毒性。
[0086]實(shí)施例5
[0087]評估HPTC接觸氧化鉍(III)或10% DMSO(陽性對照)之后的細(xì)胞變圓和細(xì)胞面積減小。水用作陰性載體對照。
[0088]使細(xì)胞接觸水(載體對照)、125 μ g/ml氧化鉍(III)、500 μ g/ml氧化鉍(III)或10% DMSO12小時(shí)。細(xì)胞用DAPI (藍(lán)色)染色和全細(xì)胞染劑(綠色；Cellomics)染色(圖9)，然后檢測圓度和細(xì)胞面積。
[0089]實(shí)施例6
[0090]細(xì)胞經(jīng)培養(yǎng)并如實(shí)施例2和3所述處理，其中一些不受處理，而另一些用圖10?13中所示化合物處理。細(xì)胞針對F-肌動(dòng)蛋白(紅色；圖10和11)和微管蛋白(綠色；圖12和13)染色。用DAPI對細(xì)胞核進(jìn)行染色(藍(lán)色)。
[0091]本說明書引用的所有發(fā)表物和專利申請通過引用納入本文，就好像各發(fā)表物或?qū)＠暾執(zhí)囟ê蛦为?dú)地通過引用納入本文那樣。任何出版物的引用針對提交日之前的公開而不應(yīng)解釋為承認(rèn)本發(fā)明不具有通過在先發(fā)明先于這些出版物的權(quán)利。
[0092]在本說明書和權(quán)利要求書中所用的單數(shù)形式“一個(gè)”、“一種”和“該”包括多個(gè)指示物，除非上下文中有明顯的表示。在本說明書和所附權(quán)利要求書中所用的術(shù)語“包含”、“含有”、“包括”以及其它這些術(shù)語的形式意味著非限制性包含的意義，即，包括具體引用的元素或成分，但不排除任何其它元素或成分。如本說明書和所附權(quán)利要求中所用，給出的全部范圍或隊(duì)列均意在表述任何中間值或范圍或其中所含的任何子隊(duì)列。除非另有說明，本文所用的所有科技術(shù)語與本發(fā)明所屬領(lǐng)域普通技術(shù)人員所理解的通常含義相同。
[0093]雖然出于闡明目的已經(jīng)通過說明和舉例的方式對本發(fā)明有所描述，但本領(lǐng)域普通技術(shù)人員根據(jù)本發(fā)明的教導(dǎo)不難了解，可以對本發(fā)明作出某些改變和修改而不背離所附權(quán)利要求書的構(gòu)思和范圍。
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