產(chǎn)生腎前體細(xì)胞的方法及含有腎前體細(xì)胞的藥物的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種由多能干細(xì)胞誘導(dǎo)分化腎前體細(xì)胞的方法。本發(fā)明還涉及一種含 有這樣得到的腎前體細(xì)胞的腎病治療劑。
【背景技術(shù)】
[0002] 腎臟為通過將由生物體內(nèi)的代謝活動產(chǎn)生的有害物質(zhì)等廢物從血液中過濾而除 去以謀求維持身體的健康而起作用的重要的器官之一。作為腎臟的疾病，可列舉腎功能不 全等，作為治療方法，可列舉人工透析。但是，由于該治療中需要的醫(yī)療費(fèi)用負(fù)擔(dān)大，因此， 不僅從醫(yī)學(xué)方面、而且從醫(yī)療經(jīng)濟(jì)面考慮，都依然為世界性問題。另外，作為其他治療方法， 可列舉腎移植，但卻是極其嚴(yán)重的供體器官不足狀態(tài)。
[0003] 另一方面，迄今為止，報導(dǎo)了通過向胚胎干細(xì)胞（ES細(xì)胞）或體細(xì)胞導(dǎo)入未分化細(xì) 胞特異性的基因而得到的誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞（iPS細(xì)胞）等具有多能性的細(xì)胞（專利文獻(xiàn) 1及2)。因此，作為腎功能不全的治療方法，研究了將由這些多能干細(xì)胞誘導(dǎo)分化成的腎細(xì) 胞進(jìn)行移植的治療方法。進(jìn)而，使用來自這些多能干細(xì)胞的均一的腎細(xì)胞進(jìn)行治療藥物的 開發(fā)也映入視野。
[0004] 哺乳動物的腎臟經(jīng)過前腎、中腎、后腎的3個階段而形成，其中，已知后腎在間介 中胚層的后方區(qū)域生成。迄今為止，研究了由小鼠多能干細(xì)胞向間介中胚層的誘導(dǎo)分化方 法用于腎形成（非專利文獻(xiàn)1)，作為間介中胚層的特征標(biāo)記物，確認(rèn)有0SR1。另外，使用細(xì) 菌人工染色體（BAC)載體將綠色熒光蛋白（GFP)基因通過與內(nèi)源性0SR1等位基因的同源 重組而導(dǎo)入，制備了人iPS細(xì)胞（0SR1-GFP報告基因人iPS細(xì)胞），通過使用該細(xì)胞的研究， 在使用激活素A、Wnt、BMP及各種低分子化合物的由人多能干細(xì)胞向間介中胚層的誘導(dǎo)分 化方面取得了成功（非專利文獻(xiàn)2、專利文獻(xiàn)3)。
[0005] 考慮針對腎組織的移植時，優(yōu)選誘導(dǎo)來自間介中胚層并進(jìn)一步向腎臟進(jìn)行分化的 腎前體細(xì)胞，作為對腎前體細(xì)胞賦予特征的因子之一，已知有SIX2 (非專利文獻(xiàn)4)。但是， 迄今為止，由間介中胚層向腎前體細(xì)胞人工誘導(dǎo)的方法沒有被確立。
[0006] 現(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn)
[0007] 專利文獻(xiàn)
[0008] 專利文獻(xiàn)1 :美國專利第5, 843, 780號
[0009] 專利文獻(xiàn)2 :國際公開第W02007/069666號
[0010] 專利文獻(xiàn)3 :國際公開第W02012/011610號
[0011] 非專利文獻(xiàn)
[0012] 非專利文獻(xiàn) 1:MaeS，etal. (2010)，BiochemBiophysResCommun. 393 :877-82
[0013] 非專利文獻(xiàn) 2:MaeS，etal. (2013)，NatCommun. 4 :1367
[0014] 非專利文獻(xiàn) 3 :0safuneK，etal· (2006)，Development. 133 :151-61
[0015] 非專利文獻(xiàn) 4:KobayashiA，etal· (2008)，CellStemCell. 3 :169-81

【發(fā)明內(nèi)容】

[0016] 本發(fā)明的課題在于，提供一種由間介中胚層細(xì)胞誘導(dǎo)分化腎前體細(xì)胞的方法。更 具體而言，提供一種由間介中胚層細(xì)胞誘導(dǎo)分化腎前體細(xì)胞的方法，所述方法包括將由多 能干細(xì)胞誘導(dǎo)成的間介中胚層細(xì)胞進(jìn)一步誘導(dǎo)分化為腎前體細(xì)胞的工序。
[0017] 本發(fā)明人等為了解決上述的課題進(jìn)行了深入研究，結(jié)果最初發(fā)現(xiàn)：通過在含有 TGF0信號激活劑及BMP抑制劑的培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，可由間介中胚層細(xì)胞誘導(dǎo)分化腎前 體細(xì)胞。本發(fā)明是基于這樣的見解而完成的。
[0018]gp，本發(fā)明具有以下的特征：
[0019] [1]-種由間介中胚層細(xì)胞產(chǎn)生腎前體細(xì)胞的方法，所述方法包括：將間介中胚 層細(xì)胞在含有TGF0信號激活劑及BMP抑制劑的培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，由間介中胚層細(xì)胞誘 導(dǎo)腎前體細(xì)胞的工序。
[0020] [2]如[1]所述的方法，其中，所述腎前體細(xì)胞為SIX2陽性細(xì)胞。
[0021] [3]如[1]或[2]所述的方法，其中，所述間介中胚層細(xì)胞為0SR1陽性細(xì)胞。
[0022] [4]如[1]~[3]中任一項(xiàng)所述的方法，其中，所述TGF0信號激活劑為選自由 TGF0 1、TGF0 2、TGF0 3、IDE1及IDE2構(gòu)成的組中的1種以上的物質(zhì)。
[0023] [5]如[1]~[4]中任一項(xiàng)所述的方法，其中，所述BMP抑制劑為選自由 Dorsomorphin(卜'、；py乇；1^7 4 >)、頭蛋白（Noggin)、LDN193189 及DMH1 構(gòu)成的組中的 1 種以上的物質(zhì)。
[0024] [6]如[1]~[3]中任一項(xiàng)所述的方法，其中，所述TGF0信號激活劑為TGF0 1， 所述BMP抑制劑為DMH1。
[0025] [7]如[1]~[6]中任一項(xiàng)所述的方法，其中，所述間介中胚層細(xì)胞為由多能干細(xì) 胞誘導(dǎo)成的間介中胚層細(xì)胞。
[0026][8]如[7]所述的方法，其中，所述間介中胚層細(xì)胞為通過包括以下的工序⑴及 (ii)的方法所產(chǎn)生的間介中胚層細(xì)胞：
[0027] (j)將多能干細(xì)胞在含有選自由激活素（Activin)A、GSK-30抑制劑及視黃酸衍 生物構(gòu)成的組中的1種以上的物質(zhì)的培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)的工序；及
[0028](ii)將工序⑴中得到的細(xì)胞在含有選自由BMP7、GSK_3i3抑制劑及視黃酸衍生 物構(gòu)成的組中的1種以上的物質(zhì)的培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)的工序。
[0029] [9]如[8]所述的方法，其中，所述工序（ii)包括以下的工序（ii-Ι)及（ii-2):
[0030] (ii-Ι)將工序（i)中得到的細(xì)胞在含有選自BMP7及GSK-3β抑制劑中的1種以 上的物質(zhì)的培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)的工序；及
[0031] (ii-2)將工序（ii-Ι)中得到的細(xì)胞在含有選自TGF0信號激活劑及視黃酸衍生 物中的1種以上的物質(zhì)的培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)的工序。
[0032] [10]如[9]所述的方法，其中，所述工序（ii-Ι)為在含有BMP7及GSK-3I3抑制劑 的培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)的工序，所述工序（ii-2)為在含有TGF0信號激活劑及視黃酸衍生物 的培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)的工序。
[0033] [11]如[8]~[10]中任一項(xiàng)所述的方法，所述GSK3 0抑制劑為CHIR99021。
[0034] [12]如[8]~[11]中任一項(xiàng)所述的方法，其中，所述視黃酸衍生物為AM580或 TTNPBo
[0035] [13]如[7]~[12]中任一項(xiàng)所述的方法，其中，所述多能干細(xì)胞為誘導(dǎo)性多能干 (iPS)細(xì)胞。
[0036] [14]如[13]所述的方法，其中，所述iPS細(xì)胞為人iPS細(xì)胞。
[0037] [15]-種由多能干細(xì)胞產(chǎn)生腎前體細(xì)胞的方法，所述方法包括以下的工序⑴~ (iii)：
[0038] (i)將多能干細(xì)胞在含有選自由激活素A、GSK_3β抑制劑及視黃酸衍生物構(gòu)成的 組中的1種以上的物質(zhì)的培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)的工序；
[0039] (ii)將工序⑴中得到的細(xì)胞在含有選自由BMP7、GSK_3i3抑制劑及視黃酸衍生 物構(gòu)成的組中的1種以上的物質(zhì)的培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)的工序；及
[0040] (iii)將工序（ii)中得到的細(xì)胞在含有TGFβ信號激活劑及BMP抑制劑的培養(yǎng)基 中進(jìn)行培養(yǎng)的工序。
[0041] [16]如[15]所述的方法，其中，所述腎前體細(xì)胞為SIX2陽性細(xì)胞。
[0042] [17]如[15]或[16]所述的方法，其中，所述工序（ii)中得到的細(xì)胞為0SR1陽性 細(xì)胞。
[0043] [18]如[15]~[17]中任一項(xiàng)所述的方法，其中，所述TGF0信號激活劑為選自由 TGF0 1、TGF0 2、TGF0 3、IDE1及IDE2構(gòu)成的組中的1種以上的物質(zhì)。
[0044] [19]如[15]~[18]中任一項(xiàng)所述的方法，其中，所述BMP抑制劑為選自由 Dorsomorphin、Noggin、LDN193189及DMH1構(gòu)成的組中的1種以上的物質(zhì)。
[0045] [20]如[15]~[17]中任一項(xiàng)所述的方法，其中，所述TGF0信號激活劑為 TGFβ1，所述BMP抑制劑為DMH1。
[0046] [21]如[15]~[20]中任一項(xiàng)所述的方法，其中，所述工序（ii)包括以下的工序 (ii-Ι)及（ii-2):
[0047] (ii-Ι)將工序（i)中得到的細(xì)胞在含有選自BMP7及GSK-3β抑制劑中的1種以 上的物質(zhì)的培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)的工序；及
[0048] (ii-2)將工序（ii-Ι)中得到的細(xì)胞在含有選自TGF0信號激活劑及視黃酸衍生 物中的1種以上的物質(zhì)的培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)的工序。
[0049] [22]如[21]所述的方法，其中，所述工序（ii-Ι)為在含有BMP7及GSK-3I3抑制 劑的培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)的工序，所述工序（ii-2)為在含有TGF0信號激活劑及視黃酸衍生 物的培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)的工序。
[0050] [23]如[15]~[22]中任一項(xiàng)所述的方法，其中，所述GSK3β抑制劑為 CHIR99021。
[0051][24]如[15]~[23]中任一項(xiàng)所述的方法，其中，所述視黃酸衍生物為ΑΜ580或 ΤΤΝΡΒο
[0052] [25]如[15]~[24]中任一項(xiàng)所述的方法，其中，所述多能干細(xì)胞為誘導(dǎo)性多能干 (iPS)細(xì)胞。
[0053] [26]如[25]所述的方法，其中，所述iPS細(xì)胞為人iPS細(xì)胞。
[0054] [27]-種腎前體細(xì)胞，所述腎前體細(xì)胞通過[1]~[26]中任一項(xiàng)所述的方法來產(chǎn) 生。
[0055] [28]-種藥物組合物，所述藥物組合物含有通過[1]~[26]中任一項(xiàng)所述的方法 產(chǎn)生的腎前體細(xì)胞。
[0056] [29] -種腎病治療劑，所述腎病治療劑含有通過[1]~[26]中任一項(xiàng)所述的方法 產(chǎn)生的腎前體細(xì)胞。
[0057] [30]-種治療腎病的方法，所述方法包括：將通過[1]~[26]中任一項(xiàng)所述的方 法產(chǎn)生的腎前體細(xì)胞施用于需要治療的患者的工序。
[0058] [31]-種腎前體細(xì)胞，所述腎前體細(xì)胞通過[1]~[22]中任一項(xiàng)所述的方法來產(chǎn) 生，所述腎前體細(xì)胞用于腎病的治療。
[0059] [32]通過[1]~[26]中任一項(xiàng)所述的方法產(chǎn)生的腎前體細(xì)胞在制備用于治療腎 病的藥物組合物中的用途。
[0060] 利用本發(fā)明能夠首次實(shí)現(xiàn)由間介中胚層向腎前體細(xì)胞的人工誘導(dǎo)。進(jìn)而，利用本 發(fā)明能夠首次實(shí)現(xiàn)由多能干細(xì)胞（例如iPS細(xì)胞）向腎前體細(xì)胞的人工誘導(dǎo)。另外，確認(rèn) 了通過本發(fā)明的方法產(chǎn)生的腎前體細(xì)胞具有對腎病模型動物的治療效果。通過本發(fā)明的方 法產(chǎn)生的腎前體細(xì)胞可用于腎功能不全等腎病的治療或再生醫(yī)療。
[0061] 本說明書包含作為本申請的優(yōu)先權(quán)的基礎(chǔ)的日本國專利申請2013-123072號（申 請日：2013年6月11日）以及2014-92108號（申請日：2014年4月25日）的說明書和/ 或附圖中所記載的內(nèi)容。
【附圖說明】
[0062] 圖1表不實(shí)施例2~4中的誘導(dǎo)分化后的SIX2陽性細(xì)胞的含有率。圖1A表不在 含有DMS0作為對照的培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)后的結(jié)果。圖1B表示利用誘導(dǎo)方法1(實(shí)施例2) 的結(jié)果。圖1C表示利用誘導(dǎo)方法2 (實(shí)施例3)的結(jié)果。圖1D表示利用誘導(dǎo)方法3 (實(shí)施 例4)的結(jié)果。圖中，tdTomato表示報告基因。
[0063] 圖2表示實(shí)施例5中的誘導(dǎo)分化后的SIX2陽性細(xì)胞的含有率。圖2A表示在含有 DMS0作為對照的培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)后的結(jié)果。圖2B、C及D表示在誘導(dǎo)方法1的階段3中 分別使用頭蛋白（~〇區(qū)區(qū);[11)、0)附93189及0]\1!11代替0〇『8〇1]1〇印11；[11(卜'、;1^> (：:￡;1^7 4>)時 的結(jié)果。圖2E及F表示在誘導(dǎo)方法1的階段3中分別使用IDE1及IDE2代替TGFβ1時的 結(jié)果。圖2G表示在誘導(dǎo)方法1的階段3中，使用TGFI3 2及LDN193189時的結(jié)果。圖2Η表 示在誘導(dǎo)方法1的階段3中，使用TGFI3 3及LDN193189時的結(jié)果。
[0064] 圖3表示由人iPS細(xì)胞產(chǎn)生0SR1+SIX2+腎前體細(xì)胞的方法的一個實(shí)例。圖3Α表 示使用EB(擬胚體）三維培養(yǎng)的向0SR1+SIX2+腎前體細(xì)胞的分化方法。圖3B表示利用流 式細(xì)胞儀的〇SRl+SIX2+細(xì)胞的隨時間推移的分化模式分析，具體而言，表示細(xì)胞群的二維 分布的結(jié)果（η= 5)。圖3C表示針對分化細(xì)胞群中的表示的各基因的mRNA表達(dá)的時間過 程分析。圖表表示第1天~第28天中的相對于β肌動蛋白表達(dá)的相對表達(dá)量（η= 3)。 圖3D表示實(shí)施例7中的利用流式細(xì)胞儀的0SR1+SIX2+細(xì)胞的隨時間推移的分化模式分 析，具體而言，表示該細(xì)胞群的時間過程分析的結(jié)果（η= 5)。圖3D中，dl表示第1天中 的iPS細(xì)胞，d3表示在含有CHIR99021和激活素（Activin)A的培養(yǎng)基（階段1)中產(chǎn)生 的EB(第3天）的結(jié)果。圖3D中，d6~d28表示至第6天~第28天的DMS0組（記載為 DMS0)及TGFβ1+TTNPB處理組（記載為Tx)的結(jié)果。在階段2 (第3天~第6天）中，在含 有CHIR99021和ΒΜΡ7的培養(yǎng)基中培養(yǎng)3天后，在第6天分為DMS0組和Τχ組，進(jìn)行在階段3 及階段4的培養(yǎng)。需要說明的是，在DMSO組中，在階段3中，取代TGFβ1及TTNPB，在含有DMS0的培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，（在第8天，交換為相同的培養(yǎng)基），在階段4中，取代TGFβ1及 DMH1，在含有DMS0的培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)（每3天1次交換為相同的培養(yǎng)基）。圖3Ε表示由 培養(yǎng)第28天的4A6C3-10分化成的0SR1+SIX2+腎前體細(xì)胞中的腎前體細(xì)胞標(biāo)記物表達(dá)。
[0065] 圖4表示TGF0信號激活劑及BMP抑制劑的各組合用于由人iPS細(xì)胞誘導(dǎo) 0SR1+SIX2+細(xì)胞的效果。數(shù)據(jù)用平均值土S.E.Μ表示（η= 5)。
[0066] 圖5表示通過利用各種人iPS細(xì)胞及人ES細(xì)胞的誘導(dǎo)方法4的分化誘導(dǎo)的結(jié) 果（0SR1表達(dá)量（圖5A)及SIX2表達(dá)量（圖5B))。表示各細(xì)胞中的0SR1及SIX2相對于 4A6C3-10中的表達(dá)量的的相對表達(dá)量。
[0067] 圖6表示腎前體細(xì)胞的評價試驗(yàn)的結(jié)果。圖6A表示將0SR1+SIX2+細(xì)胞在REGM培 養(yǎng)基中培養(yǎng)7天后的免疫染色圖像。圖中，NEPHRIN表示腎小球足細(xì)胞的標(biāo)記物，AQP1及 MEGALIN表示腎小管近曲小管的標(biāo)記物，且UR0MUC0ID表示亨利氏環(huán)的標(biāo)記物。對該各標(biāo)記 物和核分別被染色為粉紅色和藍(lán)色。比例尺表示50μm。圖6B表示將0SR1+SIX2+細(xì)胞的細(xì) 胞團(tuán)塊與表達(dá)Wnt4的NIH3T3共培養(yǎng)7天后的顯微鏡圖像（左圖）及免疫染色圖像（3個 右圖）。圖6C表示將0SR1+SIX2+細(xì)胞的細(xì)胞團(tuán)塊與E11. 5的小鼠胚脊髓共培養(yǎng)7天后的顯 微鏡圖像（左圖）及免疫染色圖像（3個右圖）。圖6D表示將0SR1+SIX2+細(xì)胞的細(xì)胞團(tuán)塊 與E11. 5的小鼠胚胎后腎細(xì)胞器官培養(yǎng)后的免疫染色圖像。圖6E表示對將0SR1+SIX2+細(xì)胞 的細(xì)胞團(tuán)塊向NOD.CB17-Prkdcsel