813-818(2005))。一周后，將得到的細(xì)胞通過針對CDH6(腎小囊標(biāo)記物）、LTL、LAMININ、 ⑶HUPODOCALYXIN及WT1的免疫染色，確認(rèn)了各標(biāo)記物的陽性細(xì)胞（圖6D)。
[0184]進(jìn)而，在含有添加有 50ng/mlBMP7 (R&Dsystems)及 10μΜY-27632 (Wako)的UBC 培養(yǎng)上清液（參照以下）的紡錘底低吸附96孔板（LipidureCoat、N0F)上以1.0X105個 細(xì)胞/孔接種〇SRl+SIX2+細(xì)胞，在37°C、5%C0 2氛圍下培養(yǎng)24小時。接著，將培養(yǎng)基替換 為添加有50ng/mlΒΜΡ7、0·5μΜBlO(Wako)及ΙΟμΜY-27632的UBC培養(yǎng)上清液，培養(yǎng)2~ 3天后，回收細(xì)胞，移植到免疫缺陷小鼠（N0D.CB17-Prkdcseld/J(CharleSriver))的附睪脂 肪組織，30天后回收移植部位，結(jié)果為確認(rèn)了LTL及LAMININ陽性的腎小管近曲小管結(jié)構(gòu) (圖 6E)。
[0185] 進(jìn)而，將在實(shí)施例7的誘導(dǎo)工序中進(jìn)行了處理的培養(yǎng)第28天的各群體的細(xì)胞 (0SR1_SIX2_、0SR1+SIX2_、0SR1_SIX2+、及 0SR1+SIX2+)與E1L5 的小鼠胚胎輸尿管芽進(jìn)行 器官培養(yǎng)。詳細(xì)而言，在含有添加有50ng/mlBMP7(R&Dsystems)及10μΜY-27632(Wako) 的UBC培養(yǎng)上清液（參照以下）的紡錘底低吸附96孔板（LipidureCoat、N0F)上以 1.0X105個細(xì)胞/孔接種由iPS細(xì)胞衍生的細(xì)胞，在37°C、5%C02氛圍下培養(yǎng)24小時。接 著，將培養(yǎng)基替換為添加有50ng/mlΒΜΡ7、0· 5μΜBlO(Wako)、及10μΜY-27632的UBC培 養(yǎng)上清液，培養(yǎng)2~3天后，回收細(xì)胞，使用Accumax進(jìn)行分離。從ICR小鼠中提取Ell. 5的 小鼠胚胎輸尿管芽。將得到的5. 0X105個細(xì)胞的小鼠胚胎輸尿管芽與5. 0X105個細(xì)胞的所 述用Accumax進(jìn)行了分離的 0SR1_SIX2_、0SR1+SIX2_、0SR1_SIX2+及 0SR1+SIX2+的各細(xì) 胞組進(jìn)行混合，在紡錘底低吸附96孔板上、在添加有10μMY-27632、500U/ml青霉素/鏈霉 素及10%FBS的DMEM中培養(yǎng)一晝夜，以形成聚集體。將得到的聚集體在具有0. 4μπι孔的 聚碳酸酯過濾器（Millipore)上的空氣-培養(yǎng)液的界面、在37°C下進(jìn)行培養(yǎng)。在培養(yǎng)液側(cè) 使用添加有 500U/ml青霉素 / 鏈霉素及 10%FBS的DMEM(Nacalaitesque) (Uchino,S.et al.JAM294,813-818 (2005))。一周后，觀察得到的細(xì)胞聚集體，結(jié)果，僅在以0SR1+SIX2+ 細(xì)胞形成的聚集體中確認(rèn)了管結(jié)構(gòu)（圖6F左圖）。進(jìn)而，對以0SR1+SIX2+細(xì)胞形成的聚集 體進(jìn)行針對DBA(輸尿管芽標(biāo)記物）的免疫染色，結(jié)果確認(rèn)了來自小鼠輸尿管芽的分支（圖 6F右圖）。
[0186] 由以上顯示：用實(shí)施例7所述的方法誘導(dǎo)分化成的0SR1+SIX2+細(xì)胞為腎前體細(xì)胞。
[0187] [UBC培養(yǎng)上清液]
[0188] 用改良了文獻(xiàn)（AmJPhysiol273,F757-767(1997))記載的方法的方法制備了 輸尿管芽（UretericBud)細(xì)胞（UBC)馴化培養(yǎng)基。將UBC(由DrSakurai提供、Proc NatlAcadSciUSA94,6279-6284(1997))在含有10%胎牛血清（FBS)的最小必需培養(yǎng) 基（MEM;Invitrogen)中進(jìn)行培養(yǎng)。在成為80 %匯合時，用PBS沖洗細(xì)胞，將培養(yǎng)基替換為 含有0·ImMMEMNEAA、500U/ml青霉素/鏈霉素及0· 55mM2-巰基乙醇、10%KSR的DMEM/ F12+Glutamax。接著，將細(xì)胞培養(yǎng)3天而產(chǎn)生培養(yǎng)上清液。培養(yǎng)上清液在使用前用0. 22μm 過濾器進(jìn)行過濾。
[0189][實(shí)施例 11]
[0190] [由人iPS衍生的腎前體細(xì)胞的治療效果]
[0191] 將用實(shí)施例7所述的方法進(jìn)行了誘導(dǎo)分化的第25天~第28天的人iPS衍生的 腎前體細(xì)胞（〇SRl+SIX2+細(xì)胞；也稱為RP-0S)或含有人iPS衍生的腎前體細(xì)胞的細(xì)胞組 (0SR1+SIX2_細(xì)胞及0SR1+SIX2+細(xì)胞；也稱為hiPSC-RP)用流式細(xì)胞儀進(jìn)行分離，在含有添 加有 50ng/mlBMP7(R&Dsystems)及ΙΟμΜY-27632(Wako)的UBC培養(yǎng)上清液（上述）的 紡錘底低吸附96孔板（LipidureCoat、N0F)上以1.OX105個細(xì)胞/孔接種，在37°C、5% C〇2氛圍下培養(yǎng)24小時。接著，將培養(yǎng)基替換為添加有50ng/mlΒΜΡ7、0. 5μΜBlO(Wako) 及10μΜY-27632的UBC培養(yǎng)上清液，進(jìn)一步培養(yǎng)24小時。作為對照，在含有添加有10μΜ Υ-27632的靈長類ES細(xì)胞培養(yǎng)基（R印roCELL)的紡錘底低吸附96孔板上以1. 0X105個細(xì) 胞/孔接種未分化的人iPS細(xì)胞（4A6C3-10)，在37°C、5%C02氛圍下培養(yǎng)48小時。用生 理鹽水洗滌培養(yǎng)后的各細(xì)胞，除去培養(yǎng)基。其后，如以下記載的那樣，將15個hiPSC-RP的 細(xì)胞團(tuán)塊移植在急性腎損傷（AKI)模型小鼠的腎臟被膜下。另外，作為確認(rèn)0SR1+SIX2+細(xì) 胞的組織分化的實(shí)驗(yàn)（圖7A及B)，如以下所記載的那樣，將5個RP-0S的細(xì)胞團(tuán)塊用吸量 管注入于AKI模型小鼠及慢性腎功能不全模型小鼠的腎臟實(shí)質(zhì)。
[0192][小鼠急性腎損傷（AKI)模型試驗(yàn)]
[0193]按照公知的方法（AgingCell8,192-200(2009)、JAmSocN印hrol20， 1544-1555(2009)、JAmSocN印hrol25,316-328(2014))制備小鼠缺血再灌注AKI模型。 通過異氟烷吸入麻醉6周齡的雌性免疫缺陷小鼠（NOD.CB17-Prkdcseld/J(Charlesriver))， 并維持在37°C。側(cè)腹切開而進(jìn)行右腎切除后，使用無創(chuàng)微血管夾鉗（夏目制作所、日本國） 閉塞左腎動脈45分鐘。取下夾鉗之后，移植RP-〇S、hiPSC-RP、或4A6C3-10(于對照小鼠注 入生理鹽水）。使用DRI-CHEM7000VZ(富士膠片、日本國）測定作為小鼠的外周血中的腎 功能標(biāo)記物的血中尿素氮（BUN)及血清肌酐（Cr)水平。就AKI狀態(tài)的確立而言，在缺血再 灌注后不伴有腎梗塞，通過在第2天BUN水平上升（>41mg/dl)而確認(rèn)。在腎組織的分析 中，在缺血再灌注后（I/R)第3天，用過碘酸-Schiff(PAS)或馬森氏三色（MT)染劑進(jìn)行染 色。
[0194][小鼠慢性腎功能不全模型試驗(yàn)]
[0195]按照公知的方法（N印hrolDialTransplant26,832-838(2011))制備小鼠慢 性腎功能不全模型（5/6腎切除模型）。通過異氟烷吸入麻醉6周齡的雌性免疫缺陷小鼠 (N0D.CB17-Prkd(^ld/J)，并維持在37°C。進(jìn)行右腎切除后，切除左腎臟的上下兩極。在術(shù) 后2周移植RP-0S的細(xì)胞團(tuán)塊。在移植3天后或2周后處死小鼠，對腎組織切片進(jìn)行免疫 染色試驗(yàn)。
[0196] [結(jié)果]
[0197] 在RP-0S的腎實(shí)質(zhì)移植后第2周的AKI模型（圖7A)及慢性腎功能不全模型（圖 7B)的兩種模型中，一些移植的RP-0S并入宿主的腎臟，已分化為腎小管近曲小管標(biāo)記物 LTL及AQP1陽性細(xì)胞。但是，RP-0S的腎實(shí)質(zhì)移植在兩種模型中沒有顯示針對腎功能的明 確的效果（數(shù)據(jù)未顯示）。報道了與靜脈內(nèi)注射進(jìn)行比較，通過向腎臟被膜下進(jìn)行移植直 接遞送至損傷了許多間充質(zhì)干細(xì)胞的腎臟（TransplantProc41，947-951 (2009))，因此， 本發(fā)明人等試驗(yàn)了hiPSC-RP的對腎臟被膜下的移植引起的治療效果。其結(jié)果，在缺血再 灌注后第2、4、6天，與對照組及未分化的人iPS細(xì)胞移植組進(jìn)行比較，在hiPSC-RP移植組 中BUN水平及血清Cr水平顯著地降低（圖7C)。通過組織學(xué)的分析確認(rèn)：與對照組進(jìn)行比 較，腎實(shí)質(zhì)區(qū)域中具有管型的擴(kuò)張腎小管在hiPSC-RP移植組中顯著地減小，纖維化區(qū)域也 在hiPSC-RP移植組中較?。▓D7D及E)。hiPSC-RP沒有并入宿主的腎臟，因此，表明本方 案中所確認(rèn)的hiPSC-RP的治療效果主要基于旁分泌作用（A7夕7Ο効果）。
[0198] 工業(yè)上的可利用性
[0199] 如以上詳述的那樣，本發(fā)明提供由間介中胚層細(xì)胞誘導(dǎo)分化腎前體細(xì)胞的方法。 由此，用本方法產(chǎn)生的腎前體細(xì)胞可在腎功能不全等腎病的再生醫(yī)療中使用。
[0200] 將本說明書中引用的全部的刊行物、專利及專利申請直接作為參考引入本說明書 中。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種由間介中胚層細(xì)胞產(chǎn)生腎前體細(xì)胞的方法，所述方法包括：將間介中胚層細(xì)胞 在含有TGF0信號激活劑及BMP抑制劑的培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，由間介中胚層細(xì)胞誘導(dǎo)腎前 體細(xì)胞的工序。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述腎前體細(xì)胞為SIX2陽性細(xì)胞。3. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其中，所述間介中胚層細(xì)胞為0SR1陽性細(xì)胞。4. 根據(jù)權(quán)利要求1~3中任一項(xiàng)所述的方法，其中，所述TGFβ信號激活劑為選自由 TGF0 1、TGF0 2、TGF0 3、IDE1及IDE2構(gòu)成的組中的1種以上的物質(zhì)。5. 根據(jù)權(quán)利要求1~4中任一項(xiàng)所述的方法，其中，所述BMP抑制劑為選自由 Dorsomorphin、Noggin、LDN193189及DMH1構(gòu)成的組中的1種以上的物質(zhì)。6. 根據(jù)權(quán)利要求1~3中任一項(xiàng)所述的方法，其中，所述TGFβ信號激活劑為TGFβ1， 所述BMP抑制劑為DMH1。7. 根據(jù)權(quán)利要求1~6中任一項(xiàng)所述的方法，其中，所述間介中胚層細(xì)胞為由多能干細(xì) 胞誘導(dǎo)成的間介中胚層細(xì)胞。8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其中，所述間介中胚層細(xì)胞為通過包括以下的工序（i) 及（ii)的方法所產(chǎn)生的間介中胚層細(xì)胞： (i) 將多能干細(xì)胞在含有選自由激活素A、GSK-3i3抑制劑及視黃酸衍生物構(gòu)成的組中 的1種以上的物質(zhì)的培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)的工序；及 (ii) 將工序⑴中得到的細(xì)胞在含有選自由BMP7、GSK-3i3抑制劑及視黃酸衍生物構(gòu) 成的組中的1種以上的物質(zhì)的培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)的工序。9. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其中，所述工序（ii)包括以下的工序（ii-Ι)及 (?-2)： (ii-1)將工序（i)中得到的細(xì)胞在含有選自BMP7及GSK-3 0抑制劑中的1種以上的 物質(zhì)的培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)的工序；及 (ii-2)將工序（ii-Ι)中得到的細(xì)胞在含有選自TGF0信號激活劑及視黃酸衍生物中 的1種以上的物質(zhì)的培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)的工序。10. 根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其中，所述工序（ii-Ι)為在含有BMP7及GSK-3 0抑 制劑的培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)的工序，所述工序（ii-2)為在含有TGF0信號激活劑及視黃酸衍 生物的培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)的工序。11. 根據(jù)權(quán)利要求8~10中任一項(xiàng)所述的方法，其中，所述GSK30抑制劑為 CHIR99021。12. 根據(jù)權(quán)利要求8~11中任一項(xiàng)所述的方法，其中，所述視黃酸衍生物為AM580或 TTNPBo13. 根據(jù)權(quán)利要求7~12中任一項(xiàng)所述的方法，其中，所述多能干細(xì)胞為誘導(dǎo)性多能干 (iPS)細(xì)胞。14. 根據(jù)權(quán)利要求13所述的方法，其中，所述iPS細(xì)胞為人iPS細(xì)胞。15. -種由多能干細(xì)胞產(chǎn)生腎前體細(xì)胞的方法，所述方法包括以下的工序（i)~ (iii)： (i)將多能干細(xì)胞在含有選自由激活素A、GSK-3i3抑制劑及視黃酸衍生物構(gòu)成的組中 的1種以上的物質(zhì)的培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)的工序； (ii) 將工序⑴中得到的細(xì)胞在含有選自由BMP7、GSK-3i3抑制劑及視黃酸衍生物構(gòu) 成的組中的1種以上的物質(zhì)的培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)的工序；及 (iii) 將工序（ii)中得到的細(xì)胞在含有TGF0信號激活劑及81^抑制劑的培養(yǎng)基中進(jìn) 行培養(yǎng)的工序。16. 根據(jù)權(quán)利要求15所述的方法，其中，所述腎前體細(xì)胞為SIX2陽性細(xì)胞。17. 根據(jù)權(quán)利要求15或16所述的方法，其中，所述工序（ii)中得到的細(xì)胞為0SR1陽 性細(xì)胞。18. 根據(jù)權(quán)利要求15~17中任一項(xiàng)所述的方法，其中，所述TGFβ信號激活劑為選自 由TGF0 1、TGF0 2、TGF0 3、IDE1及IDE2構(gòu)成的組中的1種以上的物質(zhì)。19. 根據(jù)權(quán)利要求15~18中任一項(xiàng)所述的方法，其中，所述ΒΜΡ抑制劑為選自由 Dorsomorphin、Noggin、LDN193189及DMH1構(gòu)成的組中的1種以上的物質(zhì)。20. 根據(jù)權(quán)利要求15~17中任一項(xiàng)所述的方法，其中，所述TGF0信號激活劑為 TGFβ1，所述BMP抑制劑為DMH1。21. 根據(jù)權(quán)利要求15~20中任一項(xiàng)所述的方法，其中，所述工序（ii)包括以下的工序 (ii-Ι)及（ii-2): (ii-Ι)將工序（i)中得到的細(xì)胞在含有選自BMP7及GSK-3 0抑制劑中的1種以上的 物質(zhì)的培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)的工序；及 (ii-2)將工序（ii-Ι)中得到的細(xì)胞在含有選自TGF0信號激活劑及視黃酸衍生物中 的1種以上的物質(zhì)的培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)的工序。22. 根據(jù)權(quán)利要求21所述的方法，其中，所述工序（ii-Ι)為在含有BMP7及GSK-3 0抑 制劑的培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)的工序，所述工序（ii-2)為在含有TGF0信號激活劑及視黃酸衍 生物的培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)的工序。23. 根據(jù)權(quán)利要求15~22中任一項(xiàng)所述的方法，其中，所述GSK30抑制劑為 CHIR99021。24. 根據(jù)權(quán)利要求15~23中任一項(xiàng)所述的方法，其中，所述視黃酸衍生物為AM580或 TTNPBo25. 根據(jù)權(quán)利要求15~24中任一項(xiàng)所述的方法，其中，所述多能干細(xì)胞為誘導(dǎo)性多能 干（iPS)細(xì)胞。26. 根據(jù)權(quán)利要求25所述的方法，其中，所述iPS細(xì)胞為人iPS細(xì)胞。27. -種腎前體細(xì)胞，所述腎前體細(xì)胞通過權(quán)利要求1~26中任一項(xiàng)所述的方法來產(chǎn) 生。28. -種藥物組合物，所述藥物組合物含有通過權(quán)利要求1~26中任一項(xiàng)所述的方法 產(chǎn)生的腎前體細(xì)胞。29. -種腎病治療劑，所述腎病治療劑含有通過權(quán)利要求1~26中任一項(xiàng)所述的方法 產(chǎn)生的腎前體細(xì)胞。30. -種治療腎病的方法，所述方法包括：將通過權(quán)利要求1~26中任一項(xiàng)所述的方 法產(chǎn)生的腎前體細(xì)胞施用于需要治療的患者的工序。31. -種腎前體細(xì)胞，所述腎前體細(xì)胞通過權(quán)利要求1~26中任一項(xiàng)所述的方法來產(chǎn) 生，所述腎前體細(xì)胞用于腎病的治療。
【專利摘要】本發(fā)明提供一種由間介中胚層細(xì)胞產(chǎn)生腎前體細(xì)胞的方法，所述方法包括將間介中胚層細(xì)胞在含有TGFβ信號激活劑及BMP抑制劑的培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)的工序；以及通過該方法所產(chǎn)生的腎前體細(xì)胞；含有該細(xì)胞的藥物組合物及含有該細(xì)胞的腎病治療劑。
【IPC分類】A61P13/12, C12N5/074, A61L27/00, A61K35/22, C12N5/071
【公開號】CN105283542
【申請?zhí)枴緾N201480033367
【發(fā)明人】長船健二, 豐原敬文, 山岸幸子
【申請人】國立大學(xué)法人京都大學(xué), 安斯泰來制藥株式會社
【公開日】2016年1月27日
【申請日】2014年6月11日
【公告號】CA2915085A1, EP3020803A1, US20160137985, WO2014200115A1