專利名稱：選擇性敲除小腸上皮細(xì)胞內(nèi)Myd88分子的雜交小鼠的構(gòu)建方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及細(xì)胞構(gòu)建領(lǐng)域，涉及一種選擇性敲除小腸上皮細(xì)胞內(nèi)Myd88分子的雜交小鼠的構(gòu)建方法。
背景技術(shù)：
眾所周知,樹突狀細(xì)胞(dendritic cell, DCs)—直以來被認(rèn)為是人體內(nèi)一種功能強(qiáng)大且多樣化的抗原遞呈細(xì)胞，它能將體內(nèi)外來源的抗原信息傳遞給多種免疫功能細(xì)胞，指揮調(diào)動機(jī)體免疫反應(yīng)進(jìn)而達(dá)到生理性抵御或病理性的加重?fù)p傷的反應(yīng)。而近來較多研究發(fā)現(xiàn)小腸上皮細(xì)胞不僅作為腸道機(jī)械屏障的主要內(nèi)容，同時其亦具有類似于抗原底層功能的免疫活性。正常人小腸粘膜的表面積達(dá)250平方米，同時腸腔內(nèi)存在100萬億個細(xì)菌。我們的前期研究發(fā)現(xiàn)腸粘膜下的免疫細(xì)胞可能在腸道細(xì)菌抗原的刺激下改變局部及全身的免疫狀態(tài)，然而新近的研究則提示腸上皮不僅構(gòu)筑了機(jī)械屏障，同時亦具有主動抑菌以及一定的免疫活性。其與腸內(nèi)大量致病菌的廣泛的頻繁的相互作用必定對維持正常的腸道菌群以及防御致病菌的侵犯具有具足輕重的地位。首先，在正常狀態(tài)下，腸上皮可通過以下抑制細(xì)胞免疫反應(yīng)的途徑維持小腸對腸內(nèi)致病菌的耐受狀態(tài):①表達(dá)MHC II分子，誘導(dǎo)調(diào)節(jié)性T的優(yōu)勢分化[9] 大量常駐菌分泌的LPS刺激腸上皮合成并分泌TGF-β，進(jìn)而促使腸粘膜下的樹突狀細(xì)胞誘導(dǎo)Th2型的淋巴細(xì)胞分化。然而當(dāng)各種原因?qū)е碌哪c內(nèi)菌群紊亂以及大量致病菌滋生的情況下，腸上皮亦可通過以下方式直接或間接地防御致病菌的侵犯:①合成并分泌以IL-8等細(xì)胞因子，促使以中性粒細(xì)胞聚集為特征的非特異性炎癥反應(yīng)[12，13];②誘導(dǎo)DCs活化，促進(jìn)T、B淋巴細(xì)胞的分化，增強(qiáng)細(xì)胞及體液免疫的能力。Yi Yang等發(fā)現(xiàn)腸上皮通過TLR2接受抗原刺激后通過Myd88分子介導(dǎo)的通路以分泌視黃醇(Retinoic acid, RA)的方式刺激DCs誘導(dǎo)Thl型的淋巴細(xì)胞分化常駐菌分泌的LPS刺激腸上皮并由Myd88通路介導(dǎo)合成并分泌能夠高效殺滅革蘭氏陽性菌的Reg III Y [15]。Katharina Brandl [16]等發(fā)現(xiàn)廣譜抗生素的使用正是通過抑制Reg III Y的合成進(jìn)而導(dǎo)致大量VRE的生長。但是腸上皮究竟是在何種狀態(tài)下由介導(dǎo)耐受向防御的轉(zhuǎn)變，以及參與這種轉(zhuǎn)變的確切分子生物學(xué)機(jī)制目前尚不明確。我們的前期研究發(fā)現(xiàn)致腸炎的G+球菌能夠造成腸上皮(caco2細(xì)胞)明顯的損傷,在對受損的caco2細(xì)胞進(jìn)行基因芯片分析(microarray)發(fā)現(xiàn)其決定胞漿內(nèi)MAPK家族分子以及NF-KB分子的基因的均出現(xiàn)了明顯的異常表達(dá)，而其上游的信號通路分子均為Myd88。因Myd88分子可能參與多種細(xì)胞因子、RA以及Reg III Y的合成，我們推斷在致腸炎的VRE與小腸上皮的相互作用的分子生物學(xué)機(jī)制中，與Myd88分子相關(guān)的TLR受體及信號通路可能 起著重要的作用，故如能培育出的腸上皮Myd88基因條件性敲出的小鼠，將對該領(lǐng)域的深入的研究起到重要作用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的正是要克服上述技術(shù)的不足，而提供一種選擇性敲除小腸上皮細(xì)胞內(nèi)Myd88分子的雜交小鼠的構(gòu)建方法。本發(fā)明解決其技術(shù)問題采用的技術(shù)方案:。這種選擇性敲除小腸上皮細(xì)胞內(nèi)Myd88分子的雜交小鼠的構(gòu)建方法，包括步驟如下:(I)、選擇CD 11 c-cr e與條件性My d88基因敲除小鼠；構(gòu)建引物，分別對兩種小鼠通過PCR技術(shù)進(jìn)行基因型鑒定；(2)、將上述兩種小鼠進(jìn)行雜交；(3)、對雜交的小鼠后代進(jìn)行基因型鑒定，篩選得到小腸上皮胞內(nèi)Myd88分子選擇性敲除的雜交小鼠 myd88Flra￡/F1()X; Neurog3-cre0對上述兩種基因型的小鼠的雜交后代進(jìn)行基因型鑒定，以引物I和引物2，引物4、引物5、引物6和引物7同時陽性的小鼠即為myd88FWF1°x; Neurog3-cre小鼠；其中引物I的DNA 序列為 GTT GTG TGT GTC CGA CCG T，引物 2 的 DNA 序列為 GTC AGA AAC AAC CACCACCAT GC，引物 4 的 DNA 序列為 GCG GTC TGG CAG TAA AAA CTA TC，引物 5 的 DNA 序列為 GTGAAA CAG CAT TGC TGT CAC TT，引物 6 的 DNA序列為 CTA GGC CAC AGA ATT GAAAGA TCT，引物 7 的 DNA 序列為 GTA GGT GGA AAT TCT AGC ATC ATC C。本發(fā)明有益的效果是:本發(fā)明構(gòu)建的小腸上皮細(xì)胞內(nèi)Myd88分子選擇性敲除的雜交小鼠的生物學(xué)特征為小腸上皮細(xì)胞不表達(dá)Myd88分子，其可較好地應(yīng)用于小腸上皮免疫效應(yīng)及分子機(jī)制的活體研究。


圖1是本發(fā)明鑒定野生型和myd88FWF1°x小鼠示意圖；圖2是本發(fā)明鑒定野生型和Neurog3_cre轉(zhuǎn)基因小鼠不意具體實(shí)施例方式為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案及優(yōu)點(diǎn)更加清楚明白，下面結(jié)合舉例，對本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步詳細(xì)說明。應(yīng)當(dāng)理解，此處所描述的舉例僅僅用以解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明。這種選擇性敲除小腸上皮細(xì)胞內(nèi)Myd88分子的雜交小鼠的構(gòu)建方法，包括步驟如下:I)自美國 jackson 公司購得 CDllc-cre (Β6.FVB(Cg)-Tg(Neurog3_cre)ClAble/J)與條件性Myd88(B6.129P2-Myd88tmlDefr/J)基因敲除小鼠；根據(jù)公司提供的信息構(gòu)建引物，分別對兩種小鼠進(jìn)行基因型鑒定(PCR技術(shù))。2)將上述兩種小鼠進(jìn)行雜交；

3)對雜交的小鼠后代進(jìn)行基因型鑒定，篩選得到小腸上皮胞內(nèi)Myd88分子選擇性敲除的雜交小鼠(myd88FWF1°x; Neurog3-cre)。(一 )小鼠基因組DNA的制備1、剪15天內(nèi)小鼠尾巴尖約0.5cm放入Eppendorf管中。
2、每管加入裂解緩沖液 500ul DNAiso (takara DNAiso Lot:B101_l)。3、放置在常溫250rpm震蕩過夜。4、待組織溶解完全，向每管加入2倍體積乙醇，搖勻后室溫放置，5min。5、待絮狀沉淀產(chǎn)生,迅速顛倒幾次離心管,5000rpm, 5min,去上清。6、用70%乙醇洗滌沉淀兩次，洗完后置空氣中干燥。7、加滅菌水，瓊脂糖膠電泳鑒定，定量。8、室溫至DNA完全溶解后(24_48hr)可用于PCR分析。(二)PCR鑒定小鼠的基因型引物I (GTT GTG TGT GTC CGA CCG T)和引物 2 (GTC AGA AAC AAC CAC CAC CATGC)能夠鑒定野生型和myd88F1°x/F1°x小鼠，這對引物能從條件性基因敲除小鼠中擴(kuò)增出大小為353bp和/或266bp的條帶用于鑒定野生型和轉(zhuǎn)基因陽性小鼠。結(jié)果見圖一。用引物4 (GCG GTC TGG CAG TAA AAA CTA TC)、引物 5 (GTG AAA CAG CAT TGCTGT CAC TT)、引物 6 (CTA GGC CAC AGA ATT GAA AGA TCT)和 7 (GTA GGT GGA AAT TCTAGC ATC ATC C)來鑒定Neur0g3-Cre的野生型和轉(zhuǎn)基因小鼠，這對引物能從轉(zhuǎn)基因小鼠中擴(kuò)增出大小為IOObp和/或324bp的條帶，但不能區(qū)分雜合子和純合子。結(jié)果見圖二。(三)小鼠雜交和·基因型篩選myd88Flox/Flox;Neurog3_cre小鼠對上述兩種基因型的小鼠的雜交后代進(jìn)行基因型鑒定，以引物I (GTT GTG TGTGTC CGA CCG T)和引物 2 (GTC AGA AAC AAC CAC CAC CAT GC)和引物 4 (GCG GTC TGGCAG TAA AAA CTA TC)、引物 5 (GTG AAA CAG CAT TGC TGT CAC TT)、引物 6 (CTA GGC CACAGA ATT GAA AGA TCT)和 7 (GTA GGT GGA AAT TCT AGC ATC ATC C)同時陽性的小鼠即為myd88Flox/Flox;Neurog3-cre 小鼠。所獲得的myd88F1°x/Flra￡;Neurog3-cre 小鼠:I)全部通過基因型鑒定；NeuiOg3-Cre:Myd88f/f為純合子的基因型，子代均可用于實(shí)驗(yàn)，目前正處于擴(kuò)群階段。2)該種小鼠的生育、生產(chǎn)、發(fā)育及生殖等基本生命現(xiàn)象正常，可用于體內(nèi)對照試驗(yàn)。3)該種小鼠的免疫功能正常，可用于免疫相關(guān)的實(shí)驗(yàn)動物機(jī)制研究。序列表〈110〉梁廷波<120>選擇性敲除小腸上皮細(xì)胞內(nèi)Myd88分子的雜交小鼠的構(gòu)建方法〈130〉<160>6〈210〉I<211>19<212>DNA〈213〉人工序列〈220〉〈223〉人工序列的描述:人工合成的引物序列〈400〉I
權(quán)利要求
1.一種選擇性敲除小腸上皮細(xì)胞內(nèi)Myd88分子的雜交小鼠的構(gòu)建方法，其特征在于包括步驟如下 (1)、選擇⑶llc-cre與條件性Myd88基因敲除小鼠；構(gòu)建引物，分別對兩種小鼠通過PCR技術(shù)進(jìn)行基因型鑒定； (2)、將上述兩種小鼠進(jìn)行雜交； (3)、對雜交的小鼠后代進(jìn)行基因型鑒定，篩選得到小腸上皮胞內(nèi)Myd88分子選擇性敲除的雜交小鼠 myd88Flrai/Flra￡; Neurog3_cre。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的選擇性敲除小腸上皮細(xì)胞內(nèi)Myd88分子的雜交小鼠的構(gòu)建方法，其特征在于對上述兩種基因型的小鼠的雜交后代進(jìn)行基因型鑒定，以引物I和引物2，引物4、引物5、引物6和引物7同時陽性的小鼠即為myd88FWF1°X; Neurog3-cre小鼠；其中引物 I 的 DNA 序列為 GTT GTG TGT GTC CGA CCG T，引物 2 的 DNA 序列為 GTC AGA AAC AACCAC CAC CAT GC，引物 4 的 DNA 序列為 GCG GTC TGG CAG TAA AAA CTA TC，引物 5 的 DNA 序列為 GTG AAA CAG CAT TGC TGT CAC TT，引物 6 的 DNA 序列為 CTA GGC CAC AGA ATT GAAAGA TCT，引物 7 的 DNA 序列為 GTA GGT GGA AAT TCT AGC ATC ATC C。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種選擇性敲除小腸上皮細(xì)胞內(nèi)Myd88分子的雜交小鼠的構(gòu)建方法，包括以下步驟1)自美國jackson公司購得CD11c-cre(小腸上皮細(xì)胞工具鼠)與條件性Myd88基因敲除小鼠；2)將上述兩種小鼠進(jìn)行雜交；3)構(gòu)建引物，對雜交的小鼠后代進(jìn)行基因型鑒定，篩選得到小腸上皮細(xì)胞內(nèi)Myd88分子選擇性敲除的雜交小鼠(myd88Flox/Flox;Neurog3-cre)。本發(fā)明的有益效果本發(fā)明構(gòu)建的小腸上皮細(xì)胞內(nèi)Myd88分子選擇性敲除的雜交小鼠的生物學(xué)特征為小腸上皮細(xì)胞不表達(dá)Myd88分子，其可較好地應(yīng)用于小腸上皮免疫效應(yīng)及分子機(jī)制的活體研究。
文檔編號A01K67/02GK103250679SQ20131017354
公開日2013年8月21日 申請日期2013年5月9日 優(yōu)先權(quán)日2013年5月9日
發(fā)明者梁廷波, 張勻, 白雪莉, 陳偉, 徐濤, 張劍, 繆小燕 申請人:梁廷波