用于檢測(cè)抗豬產(chǎn)腸毒素性大腸桿菌抗體的融合蛋白、制備方法及應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及用于檢測(cè)抗豬產(chǎn)腸毒素性大腸桿菌抗體的融 合蛋白、制備方法及應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 產(chǎn)腸毒素性大腸桿菌（Enterotoxigenic Escherichia Coli，ETEC)系人和幼畜 (初生仔豬、犢牛、羔羊及斷奶仔豬）腹瀉最常見的病原性大腸桿菌，其致病力主要由黏附 素性菌毛和腸毒素兩種毒力因子構(gòu)成，二者密切相關(guān)且缺一不可。ETEC首先通過(guò)特異性粘 附素吸附到小腸粘膜上皮細(xì)胞表面的受體上，并定植于腸表面。初生幼畜被ETEC感染后因 劇烈水樣腹瀉和迅速脫水死亡，發(fā)病率、死亡率高。據(jù)統(tǒng)計(jì)，國(guó)內(nèi)幼畜ETEC性腹瀉病在幼畜 腹瀉病中所占比例為：豬35 %，牛26 %，羊17 %，尤其是一周以內(nèi)的新生幼畜。
[0003] 豬產(chǎn)腸毒素性大腸桿菌的黏附素抗原主要有F4 (K88)、F5 (K99)、F6 (987P)、 F7 (F41)和F18,其中以F4的流行最為普遍，因而也尤為重要。F4菌毛是我國(guó)仔豬腹瀉病原 黏附素的優(yōu)勢(shì)抗原，主要引發(fā)新生仔豬、吸乳仔豬，甚至斷奶仔豬發(fā)生腹瀉。F5引發(fā)的仔豬 腹瀉僅次于F4。
[0004] 黏附素抗原具有良好的免疫原性，用帶有黏附素的菌體或純化的黏附素抗原免疫 動(dòng)物體均可以產(chǎn)生高效價(jià)的特異性抗體。因此，抗黏附素抗體的檢測(cè)已成為診斷ETEC的重 要指標(biāo)。目前，對(duì)ETEC致病因子的血清學(xué)檢測(cè)方法有凝集試驗(yàn)、瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)和反向間接 血凝抑制試驗(yàn)等，但這些方法耗時(shí)、費(fèi)力、靈敏性差、特異性不高。熒光抗體技術(shù)雖然有較好 的特異性和敏感性，但比較主觀且不適合大規(guī)模樣品檢測(cè)；ELISA方法具有敏感性好、特異 性強(qiáng)、易操作等優(yōu)點(diǎn)。以往多采用菌體作為包被抗原，雖成本低廉，但純度和產(chǎn)量較低，且特 異性差，易產(chǎn)生交叉反應(yīng)；有研究者用純化的黏附性菌毛作為包被抗原，特異性較好，但黏 附素純化方法較繁瑣。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的是提供用于檢測(cè)抗豬產(chǎn)腸毒素性大腸桿菌抗體的融合蛋白，可以用 于同時(shí)檢測(cè)抗F4和F5型豬產(chǎn)腸毒素性大腸桿菌抗體，有利于更加全面的監(jiān)測(cè)豬群ETEC感 染和疫苗誘導(dǎo)的抗體水平。
[0006] 本發(fā)明的另一目的是提供所述融合蛋白的制備方法，該方法可以實(shí)現(xiàn)所述融合蛋 白可溶性表達(dá)，且該融合蛋白免疫反應(yīng)性良好，產(chǎn)量較高。
[0007] 本發(fā)明的再一目的是提供所述融合蛋白在制備檢測(cè)抗豬產(chǎn)腸毒素性大腸桿菌抗 體的ELISA試劑盒方面的應(yīng)用。該試劑盒檢測(cè)準(zhǔn)確、操作簡(jiǎn)便，特異性、敏感性、重復(fù)性均良 好，適合于在臨床應(yīng)用中進(jìn)行推廣，為ETEC的快速檢測(cè)提供了可靠手段。
[0008] 本發(fā)明的目的采用如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)。
[0009] -種用于檢測(cè)抗豬產(chǎn)腸毒素性大腸桿菌抗體的融合蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO: 1所示。
[0010] 本發(fā)明提供所述融合蛋白的編碼基因。
[0011] 優(yōu)選的技術(shù)方案中，所述編碼基因的序列如SEQ ID NO:2所示。
[0012] 本發(fā)明提供含有所述基因的表達(dá)盒、載體或細(xì)胞。
[0013] 本發(fā)明還提供制備所述融合蛋白的方法，包括如下步驟：將所述融合蛋白的編碼 基因插入pCold I質(zhì)粒，得到重組載體；將所述重組載體轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞，獲得陽(yáng)性重組菌； 誘導(dǎo)所述陽(yáng)性重組菌表達(dá)融合蛋白，純化后得到所述融合蛋白。
[0014] 優(yōu)選的技術(shù)方案中，所述編碼基因的序列如SEQ ID NO:2所示。
[0015] 最后，本發(fā)明提供所述融合蛋白在制備檢測(cè)抗豬產(chǎn)腸毒素性大腸桿菌抗體中的 ELISA試劑盒中的應(yīng)用以及檢測(cè)抗豬產(chǎn)腸毒素性大腸桿菌抗體的ELISA試劑盒，所述試劑 盒包括采用所述融合蛋白包被的ELISA板條。
[0016] 有益效果：本發(fā)明用于檢測(cè)抗豬產(chǎn)腸毒素性大腸桿菌抗體的融合蛋白，可以用于 同時(shí)檢測(cè)抗F4型以及F5型豬產(chǎn)腸毒素性大腸桿菌的抗體，有利于更加全面的監(jiān)測(cè)豬群 ETEC感染和疫苗誘導(dǎo)的抗體水平。本發(fā)明所述融合蛋白的制備方法，可以實(shí)現(xiàn)所述融合蛋 白可溶性表達(dá)，且該融合蛋白免疫反應(yīng)性良好，產(chǎn)量較高。本發(fā)明所述融合蛋白可以應(yīng)用于 制備檢測(cè)抗豬產(chǎn)腸毒素性大腸桿菌抗體的ELISA試劑盒。該試劑盒檢測(cè)準(zhǔn)確、操作簡(jiǎn)便，特 異性、敏感性、重復(fù)性均良好，成本較低，適合于在臨床應(yīng)用中進(jìn)行推廣，為ETEC的快速檢 測(cè)提供了可靠手段。
【附圖說(shuō)明】
[0017] 圖 1 是 p Cold I-F4-F5 酶切鑒定電泳圖，其中 Ml :DL-2000，M2 :DL-15000,1-3 :重 組質(zhì)粒pCold I-F4-F5的EcoR I和Sail酶切產(chǎn)物。
[0018] 圖2 :pCold I-F4-F5/BL21重組菌蛋白表達(dá)的SDS-PAGE分析，其中M :中分子量蛋 白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)，1 :誘導(dǎo)后重組菌全菌蛋白；2 :誘導(dǎo)后重組菌裂解液上清；3 :包涵體重懸液。
[0019] 圖3 :pGEX-4T-1-F4-F5/BL21重組菌SDS-PAGE分析，其中M :中分子量蛋白質(zhì)標(biāo) 準(zhǔn)，1和3 :包涵體沉淀，2和4 :誘導(dǎo)后重組菌裂解液上清。
[0020] 圖4是融合蛋白F4-F5的Western blot分析，其中M :中分子量蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)；1 :融 合蛋白F4-F5與F4陽(yáng)性血清的免疫印跡；2 :融合蛋白F4-F5與F5陽(yáng)性血清的免疫印跡。
【具體實(shí)施方式】
[0021] 下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步的說(shuō)明，以下所述，僅是對(duì)本發(fā)明的較佳實(shí)施 例而已，并非對(duì)本發(fā)明做其他形式的限制，任何熟悉本專業(yè)的技術(shù)人員可能利用上述揭示 的技術(shù)內(nèi)容加以變更為同等變化的等效實(shí)施例。凡是未脫離本發(fā)明方案內(nèi)容，依據(jù)本發(fā)明 的技術(shù)實(shí)質(zhì)對(duì)以下實(shí)施例所做的任何簡(jiǎn)單修改或等同變化，均落在本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。
[0022] 實(shí)施例1制備用于檢測(cè)抗ETEC抗體的融合蛋白
[0023] 1、設(shè)計(jì)用于檢測(cè)抗ETEC抗體的融合基因
[0024] 通過(guò)生物學(xué)軟件DNAStar分析ETEC F4 (K88)菌毛和ETEC F5 (K99)菌毛的核苷酸 和氨基酸序列。運(yùn)用密碼子優(yōu)化軟件CodonAdaptationTool (JCAT)分析后，替換F4和F5 菌毛核苷酸序列中大腸桿菌的稀有密碼子為偏愛(ài)密碼子，并在F4和F5菌毛的基因片段之 間添加 linker序列，設(shè)計(jì)得到了融合基因，序列如SEQ ID N0:2所示。在融合基因的5'端 添加 EcoR I酶切位點(diǎn)，在3'端添加 Sal I酶切位點(diǎn)，送南京金斯瑞生物技術(shù)公司合成。
[0025] 融合基因編碼用于檢測(cè)抗ETEC抗體的融合蛋白F4-F5。融合蛋白F4-F5的氨基酸 序列如SEQ ID NO: 1所示。
[0026] 2、融合蛋白F4-F5表達(dá)載體的構(gòu)建
[0027] 將合成的融合基因片段與pCold I載體（TaKaRa)分別使用EcoR I和Sal I雙酶 切，然后混合，于37°C孵育3h。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化Trans5 α感受態(tài)細(xì)胞（TaKaRa)，并涂布至含 氨芐青霉素抗性（100 μ g/ml)的LB平板，37°C培養(yǎng)過(guò)夜。挑取單克隆，于含氨芐青霉素抗 性的LB培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)IOh后，提取質(zhì)粒，酶切鑒定結(jié)果如圖1所示，證實(shí)融合基因片段 成功插入載體。將該陽(yáng)性重組質(zhì)粒命名為pCold I-F4-F5。
[0028] 另外，將融合基因片段分別插入常用原核表達(dá)載體pET28a、pGEX-4T_l和pET22b， 經(jīng)酶切鑒定后分別得到陽(yáng)性重組質(zhì)粒pET28a-F4-F5、pGEX-4T-1-F4-F5和pET22b-F4-F5。
[0029] 3、重組表達(dá)質(zhì)粒的誘導(dǎo)表達(dá)
[0030] 重組質(zhì)粒pCold I-F4-F5轉(zhuǎn)化BL21感受態(tài)細(xì)胞（TaKaRa)，挑取陽(yáng)性克隆，提取菌 體質(zhì)粒酶切鑒定。將陽(yáng)性重組菌命名為pCold I-F4-F5/BL21。
[0031] pCold I-F4-F5/BL21活化培養(yǎng)至OD6。。達(dá)到1. 2,取Iml菌液保存，其余菌液中 加入終濃度為ImM的IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)。誘導(dǎo)后每隔3h取Iml菌液，至誘導(dǎo)后12h。將收集 到的菌液4°C、12000r/min離心5min收集沉淀。每管沉淀用80 μ L的PBS緩沖液懸起后 加入20 μ L SDS-PAGE上樣緩沖液，沸水浴10min，用SDS-PAGE電泳分析。電泳結(jié)果如圖 2所示，參照分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，可見誘導(dǎo)表達(dá)獲得蛋白大小約為29kD，與融合蛋白F4-F5加 his-tag(GEhealthcare)大小一致，證明該重組質(zhì)粒在大腸桿菌中得到了表達(dá)。
[0032] 取 ImL 誘導(dǎo) 12h 的 pCold I-F4-F5/BL21 菌液，12000rpm 離心 2min，用 300 yL PBS 緩沖液重懸菌體。凍融3次，超聲破碎，離心分離上清液與沉淀。用300 μ L PBS緩沖液重 懸包涵體沉淀。各取40 μ L菌體裂解液上清與包涵體重懸液，加入10 μ L SDS-PAGE上樣緩 沖液，沸水浴l〇min，進(jìn)行SDS-PAGE電泳。電泳結(jié)果如圖2所示，可見融合蛋白F4-F5主要 在上清中表達(dá)，表達(dá)量占菌體總蛋白的35%左右。
[0033] 另外，將重組質(zhì)粒 pET28a-F4-F5、pGEX-4T-1-F4-F5 和 pET22b-F4-F5 分別按照常 規(guī)方法轉(zhuǎn)入感受態(tài)細(xì)胞BL21，分析各重組菌的蛋白表達(dá)情況。以pET28a和pET22b為表達(dá) 載體時(shí)，目標(biāo)蛋白沒(méi)有獲得表達(dá)。以PGEX-4T-1為表達(dá)載體，目標(biāo)蛋白以包涵體形式表達(dá)， 分子量約為56kD，如圖3所不。
[0034] 4、融合蛋白 F4-F5 的 Western Blot 實(shí)驗(yàn)
[0035] 取誘導(dǎo)后12h的p