預測腎近曲小管細胞毒性的體外試驗的制作方法
【專利說明】預測腎近曲小管細胞毒性的體外試驗
[0001]相關申請的交叉引用
[0002]本申請要求2012年7月20日提交的美國臨時申請第61/674，024號的優(yōu)先權和權益，其內容通過引用納入本文。
技術領域
[0003]本發(fā)明涉及用于預測化合物對于腎近曲小管細胞的毒性(包括預測體內毒性)的體外試驗方法。
【背景技術】
[0004]腎是藥物誘導毒性的主要靶器官之一。腎毒性藥物和化學品會誘導急性腎損傷(AKI)或慢性腎病，隨后發(fā)展成晚期腎病(ESRD) (1-3)。AKI和ESRD患者具有上升患病率和死亡率，并且依賴于透析(1，4，5)。所有住院患者中有約5%而I⑶患者中有約20% -30%發(fā)展成AKI，并且這些病例中有約20%-25%歸因于腎毒性藥物(2-4)。當替代性藥物和新藥投入使用時，其腎毒性可能性通常被低估(6)，這再次導致臨床并發(fā)癥，如COX2抑制劑的情況(7)。
[0005]通常而言，僅在藥物開發(fā)的晚期才檢測腎毒性，并且導致臨床前研宄期間藥物縮減中的2%和3期中的19% (8) ο并且，由于于腎的大功能儲備，腎毒性效應常常僅在監(jiān)管方面批準之后變得明顯。一個近期示例是替諾福韋，其損傷腎近曲小管(9，10)。并且，上述問題還與加入臨床試驗的患者和對象的風險升高，以及保健系統和制藥業(yè)的基礎成本相關聯。一個主要問題是缺乏具有高度可預測性的臨床前模型。動物模型的可預測性受種間差異性的影響，并且還存在其它問題，例如高成本和低通量。此外，歐盟(EU)的法制變化(REACH和化妝品指令的第七次修正)以及美國的新提案(ToxCast和Tox21)提高了對體外模型的興趣。經監(jiān)管批準或驗證的預測人腎毒性的體外模型目前尚不可用。主要困難在于對合適細胞類型和終點的鑒定(11-13)。
[0006]在腎中，腎近曲小管(PT)細胞是藥物誘導的毒性的主要目標，這歸因于其在藥物及有機化合物運輸和腎小球過濾物濃縮中的作用(2，3)。PT源性的細胞系，例如人和豬細胞系ΗΚ-2(人腎-2)和LLC-PKl (Lewis肺癌-豬腎I)，已在體外腎毒理學中頻繁應用。然而，永生細胞的敏感性低于人原生的腎近曲小管細胞(HPTC) (14)，并且對熟知的腎毒性物質不敏感(13)，這歸因于與永生化相關聯的功能變化和藥物轉運體表達變化(15-17)。此夕卜，與一般細胞毒性相關聯的終點，例如細胞死亡、代謝活性或ATP損耗，均不能用于器官特異性毒性的研宄。檢測用肝毒性、腎毒性和心臟毒性化合物處理肝臟、腎PT和心臟源性細胞系的ATP損耗的近期研宄發(fā)現，大多數化合物對所有三種細胞系具有相似作用(18)。
[0007]管控替代性方法的審核與批準的歐洲和美國監(jiān)管機構(歐洲動物實驗替代方法驗證中心(ECVAM)和毒理學替代方法評估國家跨部門毒理學規(guī)劃評價中心/替代方法驗證跨部門協調委員會(NICEATM/ICCVAM))目前尚未對體外腎毒理學的驗證方法采取任何措施。ECVAM已經對一項采用15種藥物的驗證前研宄給予了基金支持(19)。已采用有限數量的藥物測試了在此后的過去10年間開發(fā)的用于體外腎毒理學的其它模型(20-24)，但這些模型的可預測性不明。近期開發(fā)的高通量線粒體腎毒性物質試驗基于兔細胞(25)，其引發(fā)關于種間差異性的問題。在采用新鮮分離自鼠腎的PT的模型中也是同樣情況(23，24)。這兩種模型仍需使用動物。

【發(fā)明內容】

[0008]在一個方面，本發(fā)明提供用于篩選化合物的腎近曲小管毒性的體外方法。所述方法包括:使測試化合物和腎近曲小管細胞的測試群接觸；和，檢測一項或多項細胞的形貌特征(morphology features)，檢測一項或多項細胞骨架特征(cytoskeleton features)，和/或測定測試群中腎近曲小管細胞的細胞數量；并且比較測試群和未接觸測試化合物的對照群之間的細胞形貌、細胞骨架成分排列和/或細胞計數；其中一項或多項細胞形貌特征的變化、一項或多項細胞骨架特征的排列變化或測試群相對于對照群的細胞數量的減少指示該測試化合物對腎近曲小管細胞有毒性。
[0009]形貌特征的變化可包括近曲小管細胞的變圓程度增加、細胞面積減小和細胞核:全細胞比例升高中的一項或多項。細胞骨架排列特征的變化可包括F-肌動蛋白和微管蛋白之一或兩者的排列變化。
[0010]所述方法還可包括，在檢測和/或測定之前，用可檢測的標記物標記測試群，和/或用可檢測的標記物標記對照群。所述可檢測的標記物可以是熒光標記物或有色標記物。所述可檢測的標記物可以是核標記物、全細胞標記物、胞質標記物、細胞骨架蛋白標記物或細胞表面標記物。
[0011]在所述方法中，腎近曲小管細胞可源自體細胞或干細胞，包括例如原生細胞或來自穩(wěn)定細胞系的細胞。例如，腎近曲小管細胞可源自體細胞，并且可以是人原生腎近曲小管細胞，HK-2細胞或LLC-PKl細胞。例如，腎近曲小管細胞可源自干細胞，并且可以從胚胎干細胞、間充質干細胞或誘導性多能干細胞分化而來。在一些實施方式中，腎近曲小管細胞是人腎近曲小管細胞。在一些實施方式中，腎近曲小管細胞是非人腎近曲小管細胞。
[0012]在該方法中，所述接觸可進行一段時間，例如，約8小時或更長。所述接觸可以是在約3?約14天的一段時間內重復一次或多次的接觸。所述接觸可包括向所述腎近曲小管細胞測試群添加濃度為約0.001?約1000 μ g/ml的測試化合物。
[0013]本領域技術人員根據本發(fā)明下面的【具體實施方式】的描述以及附圖和表將會明白本發(fā)明的其它方面和特征。
【附圖說明】
[0014]本申請的附圖如下所述，這些附圖僅通過示例方式說明本發(fā)明的實施方式。
[0015]圖1.上圖:市售HPTC(美國典型培養(yǎng)物保藏中心)；下圖:分離自新鮮人腎樣品的HPTC。細胞未處理(左圖)或用0.2mg/ml的四環(huán)素(右上圖)或慶大霉素(右下圖)處理。用這些腎毒性物質處理導致形貌變化(綠色:F-肌動蛋白)以及由細胞核(藍色)數量下降所示的細胞數量下降。這些變化均可通過HCS定量并且進行后續(xù)圖像分析。
[0016]圖2.將HPTC (ATCC)接種至多孔板，培養(yǎng)，然后不處理或用CdCl2 (10 μ g/ml)、馬兜鈴酸(100 μ g/ml)或順鉑(100 μ g/ml)處理。細胞采用相差顯微鏡成像。
[0017]圖3 ?7.將 HPTC (ATCC)(圖 3) ,LLC-PKl 細胞(圖 4 和 6)以及 ΗΚ-2 細胞(圖 5和7)接種進入多孔板，培養(yǎng)，然后不處理或用至多500 μ g/ml的CuCl2、CdCl2, K2Cr2O7或替諾福韋(圖3?5)或慶大霉素、四環(huán)素、5-氟尿嘧啶或As2O3 (圖6和7)處理。細胞核用DAPI染色，并且細胞通過高內涵篩選(HCS)法成像并計數。
[0018]圖8.(表I)藥物對細胞數量影響的比較。使HPTC (ATCC)、HK_2和LLC-PKl細胞接觸濃度為I μ g/ml?1000 μ g/ml的41種測試化合物?；贖CS測定的細胞數量計算IC5tl值。若在化合物的最高濃度(100yg ml-1)時，細胞活力>50%，則賦予>1000 μ g ml_l的值。在一些情況中未測定到細胞數量(ND)?；衔颕?22對人體具有腎毒性，并且直接損傷腎近曲小管。化合物23?33對人體具有腎毒性，但不直接損傷腎近曲小管?；衔?4?41對人體無腎毒性。
[0019]圖9.與載體對照(載體:水)、氧化鉍(III)或10% DMS0(陽性對照)接觸的HPTC的顯微照片。
[0020]圖10.未處理(陰性)對照，或接觸濃度為1000 μ g/ml (上排)或500 μ g/ml (下排)重鉻酸鉀、氧化鍺(IV)或乙酸鉛的HPTC的顯微照片。紅色:F-肌動蛋白，藍色:細胞核。
[0021]圖11.未處理(陰性)對照，或接觸濃度為1000 μ g/ml (上排)或500 μ g/ml (下排)百草枯、異環(huán)磷酰胺或嘌呤霉素(puryomycin)的HPTC的顯微照片。紅色:F-肌動蛋白，藍色:細胞核。
[0022]圖12.未處理(陰性)對照，或接觸濃度為1000 μ g/ml (上排)或500 μ g/ml (下排)重鉻酸鉀、氧化鍺(IV)或乙酸鉛的HPTC的顯微照片。綠色:α-微管蛋白，藍色:細胞核。
[0023]圖13.未處理(陰性)對照，或接觸濃度為1000 μ g/ml (上排)或500 μ g/ml (下排)百草枯、異環(huán)磷酰胺或嘌呤霉素(puryomycin)的HPTC的顯微照片。綠色:α -微管蛋白，藍色:細胞核。
【具體實施方式】
[0024]提供一種預測化合物對腎近曲小管的體內毒性的體外試驗，該試驗采用培養(yǎng)的腎近曲小管細胞(PTC)，包括人原生腎近曲小管細胞(HPTC)或源自干細胞的PTC樣細胞。所述試驗基于在PTC或PTC樣細胞中觀察到的指示腎近曲小管(PT)毒性的不同形貌、細胞骨架和細胞數量的變化。
[0025]觀察到當采用屬于直接損傷PTC的腎毒性物質的化合物處理時，PTC趨于發(fā)生形貌變化，包括細胞變圓和細胞面積減小，還趨于發(fā)生細胞骨架成分(例如F-肌動蛋白或微管蛋白)的重排。細胞數量通常在響應PT損傷腎毒性化合物的細胞死亡后下降，其能通過用PT特異性腎毒性物質處理后對PTC的培養(yǎng)物中的細胞核數量計數來檢測。
[0026]因此，提供一種篩選化合物PT特異性毒性的方法。簡言之，所述方法包括使PTC的測試群與