專利名稱:核酸雜交的電化學(xué)檢測(cè)法的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域:
本發(fā)明涉及核酸雜交和測(cè)序,具體涉及定性和定量測(cè)定核酸雜交的方法和核酸測(cè)序的方法。
檢測(cè)異質(zhì)DNA樣品中的各DNA序列為鑒別基因、DNA作圖和有關(guān)DNA測(cè)序的新方法提供了基礎(chǔ)。一種檢測(cè)DNA雜交的新方法包括表面結(jié)合DNA序列的應(yīng)用,可利用指示表面結(jié)合的低聚體與異質(zhì)樣品中的序列雜交的分析響應(yīng)來(lái)分析表面結(jié)合DNA序列。這些分析方法一般包括由靶DNA鏈上共價(jià)連接的標(biāo)記物產(chǎn)生的、激光誘導(dǎo)的熒光,它對(duì)表面結(jié)合的雙鏈體中單個(gè)堿基錯(cuò)配不敏感。例如,授予Pirrung等的美國(guó)專利Nos.5,143,854和5,405,783;Fodor等,Nature364555(1993);Bains,Angew.Chem.107356(1995);和Noble,Analytical Chemistry 67(5)201 A(1995)提議用于這方面的表面或“碎片”。在由Hall等在Biochem.andMolec.Bio.Inter.32(1)21(1994)中提出的另一種方法中,用電化學(xué)法檢測(cè)DNA雜交,該方法包括觀測(cè)與雙鏈DNA比較下單鏈DNA的氧化還原性質(zhì)。該方法也對(duì)DNA樣品中單個(gè)堿基錯(cuò)配不敏感。檢測(cè)單個(gè)堿基錯(cuò)配的方法包括酶促或化學(xué)裂解研究,例如授予Na-gai等人的美國(guó)專利No.5,194,372中提出的方法。然而,這些方法因?yàn)樾枰鄷r(shí)間和分離技術(shù)而不理想。
授予Mikkelson等人的美國(guó)專利No.5,312,527描述了檢測(cè)靶核酸的伏安法序列選擇性傳感器,其中將雙鏈核酸與氧化還原活性復(fù)合體接觸。該復(fù)合體與雙鏈DNA非特異性結(jié)合。由于復(fù)合體自身是可提供伏安信號(hào)的氧化還原活性化合物,所以復(fù)合體不以催化方式起作用。
授予Hill等人的美國(guó)專利No.4,840,893描述了對(duì)核酸的電化學(xué)分析,其中由電化學(xué)法依次檢測(cè)配體和反配體(antiligand)之間的競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合。
因此,本領(lǐng)域中需要這種檢測(cè)DNA雜交的方法它包括檢測(cè)單個(gè)堿基對(duì)錯(cuò)配的方法,該方法既迅速又靈敏,且可迅速聯(lián)機(jī)應(yīng)用。
總之,本發(fā)明提供檢測(cè)核酸的方法,該核酸至少含一個(gè)預(yù)選的堿基(例如腺嘌呤、鳥(niǎo)嘌呤、6-巰基鳥(niǎo)嘌呤、8-氧鳥(niǎo)嘌呤和8-氧腺嘌呤)。本方法包括(a)使核酸與能在氧化還原反應(yīng)中氧化預(yù)選堿基的過(guò)渡金屬配合物反應(yīng);(b)檢測(cè)該氧化還原反應(yīng);和(c)通過(guò)預(yù)選堿基上檢測(cè)的氧化還原反應(yīng)確定是否存在核酸。根據(jù)本方法的具體實(shí)施方案和所需具體目的,本方法可任意包括將核酸與互補(bǔ)核酸接觸以形成雜交核酸的步驟。
本發(fā)明的第一個(gè)方面提供了檢測(cè)DNA雜交的方法。該方法包括(a)將DNA樣品與寡核苷酸探針接觸以形成雜交DNA,(b)使雜交的DNA與能在氧化還原反應(yīng)中氧化寡核苷酸探針中預(yù)選堿基的過(guò)渡金屬配合物反應(yīng),其中的寡核苷酸探針至少含一個(gè)預(yù)選的堿基,(c)檢測(cè)該氧化還原反應(yīng),(d)通過(guò)預(yù)選堿基上檢測(cè)的氧化還原反應(yīng)確定是否存在核酸。如下述詳細(xì)討論中所示,檢測(cè)氧化還原反應(yīng)的步驟大體上可通過(guò)測(cè)量流出預(yù)選堿基的電子來(lái)進(jìn)行。
本發(fā)明的第二個(gè)方面提供了檢測(cè)DNA雜交的另一種方法。該方法包括(a)將DNA樣品與寡核苷酸探針接觸以形成雜交DNA,(b)使雜交DNA與能在氧化還原反應(yīng)中氧化寡核苷酸探針中預(yù)選堿基的過(guò)渡金屬配合物反應(yīng),其中的寡核苷酸探針至少含一個(gè)預(yù)選的堿基,(c)檢測(cè)該氧化還原反應(yīng),(d)測(cè)定檢測(cè)的氧化還原反應(yīng)的反應(yīng)速率,(e)將測(cè)得的反應(yīng)速率與過(guò)渡金屬配合物和單鏈DNA的氧化還原反應(yīng)速率進(jìn)行比較,然后(f)確定測(cè)得的反應(yīng)速率與過(guò)渡金屬配合物和單鏈DNA的氧化還原反應(yīng)速率是否基本相同。
本發(fā)明的第三個(gè)方面提供了檢測(cè)DNA雜交的裝置。該裝置包括(a)多個(gè)DNA樣品容器,(b)用于承載多個(gè)DNA樣品容器的樣品處理工具,(c)將寡核苷酸探針遞送至每個(gè)DNA樣品容器的寡核苷酸樣品遞送工具,(d)將過(guò)渡金屬配合物遞送至多個(gè)DNA樣品容器中每一個(gè)的過(guò)渡金屬配合物遞送工具,和(e)檢測(cè)氧化還原反應(yīng)的氧化還原反應(yīng)檢測(cè)器。
本發(fā)明的第四個(gè)方面提供了檢測(cè)DNA雜交的第二種裝置。該裝置包括(a)一個(gè)DNA樣品容器,(b)將多個(gè)寡核苷酸探針遞送至DNA樣品容器的寡核苷酸探針遞送工具,(c)將過(guò)渡金屬配合物遞送至DNA樣品容器的過(guò)渡金屬配合物遞送工具和(d)檢測(cè)氧化還原反應(yīng)的氧化還原反應(yīng)檢測(cè)器。
本發(fā)明的第五個(gè)方面提供了DNA測(cè)序的方法。該方法包括(a)將DNA樣品與寡核苷酸探針接觸而形成雜化DNA,其中寡核苷酸探針包括具有獨(dú)特氧化勢(shì)的預(yù)選合成堿基,(b)使雜交DNA與能在氧化還原反應(yīng)中氧化寡核苷酸探針中預(yù)選合成堿基的過(guò)渡金屬配合物反應(yīng),其中的寡核苷酸探針具有預(yù)定數(shù)的預(yù)選合成堿基,(c)檢測(cè)該氧化還原反應(yīng),(d)測(cè)定檢測(cè)的氧化還原反應(yīng)的反應(yīng)速率,和(e)鑒別與預(yù)選合成堿基配對(duì)的堿基。
下列詳細(xì)描述中詳盡解釋了本發(fā)明的前述方面和其它方面。
對(duì)圖的簡(jiǎn)要描述
圖1示出存在和不存在小牛胸腺DNA時(shí)Ru(bpy)32+的循環(huán)伏安圖。實(shí)線表示在700mM NaCl/50mM磷酸鈉緩沖液中50μMRu(bpy)32+在25mV/s下的掃描。虛線表示50μM Ru(bpy)32+和3.0mM(核苷酸)小牛胸腺DNA的伏安圖。
圖2示出在5’-AAATATAGTATAAAA單鏈(C)和雜交而成的互補(bǔ)鏈(A&B)存在下Ru(bpy)32+的循環(huán)伏安圖。掃描速率為25mV/s。(A)表示25μM Ru(bpy)32++100μM(以鳥(niǎo)嘌呤核苷酸計(jì))雙鏈完全雜交的DNA(5’-AAATATAGTATAAAA)-(3’-TTTATATCATATTTT)。(B)表示Ru(bpy)32+與含GA錯(cuò)配的雙鏈體(5’-AAATATAGTATAAAA)·(3’-TTTATA-TAATATTTT),而(C)表示Ru(bpy)32+和含一個(gè)鳥(niǎo)嘌呤核苷酸的單鏈(5’-AAATATAGTATAAAA)。
圖3表示適于實(shí)施本發(fā)明方法的一個(gè)代表性裝置示意圖。
圖4表示特別適于定量檢測(cè)DNA的檢測(cè)方法示意圖,其中預(yù)選的堿基定位于靶核酸上。
圖5示出在50mM磷酸鈉緩中液與0.7M NaCl,pH7中于25mV/s的掃描速率下Ru(bpy)32+(25μM)的循環(huán)伏安圖。(A)未加寡核苷酸。(B)含75μM d[5’-TTTTATACTATATTT]。(C)含75μM來(lái)自B的低聚體和d[5’-GGGAAATATAG-TATAAAAGGG]的雜交體。工作電極錫摻雜的氧化銦。參比電極Ag/AgCl。對(duì)電極Pt絲。來(lái)自C的雜交體的二級(jí)結(jié)構(gòu)如圖中所示。
圖6示出(A)Ru(bpy)32+(25μM)、(B)Ru(bpy)32+(25μM)與肌苷5’-一磷酸(0.3mM),和(C)Ru(bpy)32+(25μm)與鳥(niǎo)苷5’-一磷酸的循環(huán)伏安圖。肌苷和鳥(niǎo)嘌呤的結(jié)構(gòu)如圖中所示。
圖7表示本發(fā)明的圖4的替代實(shí)施方案示意圖,其中預(yù)選的堿基在末端轉(zhuǎn)移酶的延伸產(chǎn)物上。
圖8表示本發(fā)明的圖4的替代實(shí)施方案示意圖,以?shī)A心分析方式進(jìn)行。
圖9表示適于實(shí)施本發(fā)明的方法的微電子裝置頂視圖。
圖10表示圖9中所述裝置一部分的側(cè)視圖。
圖11示出應(yīng)用尼龍改性ITO電極時(shí)如下Ru(bpy)32+的循環(huán)伏安圖緩沖液浸泡過(guò)的尼龍中Ru(bpy)32+(200μM),在含鹽量高(加有700mM NaCl)的緩沖液中DNA浸泡過(guò)的尼龍中Ru(bpy)32+(200μM),和在含鹽量低(即未加NaCl)的緩沖液中DNA浸泡過(guò)的尼龍中Ru(bpy)32+(200μM)。
圖12示出應(yīng)用緩沖液或DNA浸泡過(guò)的尼龍改性ITO電極時(shí)Os(bpy)32+(200μM)的循環(huán)伏安圖。圖12A示出加有700mM NaCl的循環(huán)伏安圖。圖12B示出未加NaCl的循環(huán)伏安圖。
圖13表示尼龍改性ITO電極上的循環(huán)伏安圖,示出如下Ru(bpy)32+的循環(huán)伏安圖緩沖液浸泡過(guò)的尼龍中Ru(bpy)32+(200μM),在含鹽量高(加有700mM NaCl)的緩中液中tRNA浸泡過(guò)的尼龍中Ru(bpy)32+(200μM),和在含鹽量低(未加NaCl)的緩沖液中tRNA浸泡過(guò)的尼龍中Ru(bpy)32+(200μM)。
圖14示出單獨(dú)的Ru(bpy)32+(25μM),和加有5’-AAATATAGnTATAAAA(其中,n=1(G)、2(GG)或3(GGG))(鏈中的100μM)的Ru(bpy)32+中的循環(huán)伏安圖。掃描速率為25mV/s。
圖15示出單獨(dú)的Ru(bpy)32+(25μM),和加有5’-AAATAT(AGT)nATAAAA(其中,n=1、2或3)(鏈中的100μM)的Ru(bpy)32+的循環(huán)伏安圖。掃描速率為25mV/s。
圖16示出單獨(dú)的25μM釕(4,4’-二甲基二吡啶)32+(或“Ru(4,4’-Me2-bpy)32+”)(實(shí)線),和加有5’-AAATATAG-TATAAAA(鏈中的100μM)的Ru(4,4’-Me2-bpy)32+(虛線)以及加有5’-AAATATAGGGTATAAAA(鏈中的100μM)的Ru(4,4’-Me2-bpy)32+(短劃線)的循環(huán)伏安圖。掃描速率為25mV/s。
圖17示出在含有0.7M NaCl的50mM磷酸鈉緩沖液(pH7)中、掃描速率為25mV/s時(shí)0.20mM Ru(4,4’-Me2-bpy)32+的循環(huán)伏安圖。曲線(A)表示單獨(dú)的Ru(4,4′-Me2-bpy)32+。曲線(B)表示有0.70mM 6-巰基鳥(niǎo)苷5’-一磷酸存在下的Ru(4,4′-Me2-bpy)32+。
圖18示出連有Hybond N+尼龍膜的ITO工作電極上200μMRu(bpy)32+的循環(huán)伏安圖。膜浸漬poly[C]后在緩沖液(A)和poly[G]的濃溶液(B)中進(jìn)行雜交。
圖19示出連有Hybond N+尼龍膜的ITO工作電極上200μMRu(bpy)32+的循環(huán)伏安圖。膜浸漬poly[C]后在緩沖液(A)和變性的小牛胸腺DNA濃溶液(B)中進(jìn)行雜交。
圖20示出200μM Ru(bpy)32+在不含DNA的尼龍改性玻璃狀碳電極上(A)或尼龍膜吸附DNA后的玻璃狀碳電極上(B)的循環(huán)伏安圖(掃描速率=25mV/s)。
術(shù)語(yǔ)“核酸”在本文中表示包括DNA和RNA的任意核酸。本發(fā)明的核酸一般表示聚核酸;即通過(guò)3′,5′磷酸二酯鍵共價(jià)連接的各核苷酸的聚合物。
術(shù)語(yǔ)“互補(bǔ)核酸”在文中表示包括寡核苷酸探針在內(nèi)的能與另一個(gè)核酸專一性地結(jié)合而形成雜交核酸的任意核酸。
短語(yǔ)“確定是否存在…”旨在包括定性確定和定量確定是否存在待測(cè)現(xiàn)象(例如DNA雜交、RNA雜交、檢測(cè)靶核酸等等)。
術(shù)語(yǔ)“雜交DNA”和“雜交核酸”表示由雜交而形成雙鏈DNA或核酸的單鏈DNA,或者由雜交而形成三股螺旋DNA或核酸的雙鏈DNA或核酸。
雖然有時(shí)在文中參照DNA解釋本發(fā)明的方法和裝置,但這是為了說(shuō)清問(wèn)題,且應(yīng)懂得本發(fā)明的方法和裝置也適合于其它核酸如RNA。A.核酸擴(kuò)增方法因?yàn)楸景l(fā)明的方法包括將DNA樣品與寡核苷酸探針接觸以形成雜交DNA,所以某些應(yīng)用中需要在與探針接觸之前擴(kuò)增DNA??捎萌魏魏线m的方法進(jìn)行選擇的核酸序列或靶核酸序列的擴(kuò)增。通??蓞⒁?jiàn)D.Kwoh和T.Kwoh,Am.Biotechnol.Lab.8,14-25(1990)。合適的擴(kuò)增技術(shù)實(shí)例包括但不限于聚合酶鏈反應(yīng)(包括用于RNA擴(kuò)增的逆轉(zhuǎn)錄酶聚合酶鏈反應(yīng)),連接酶鏈反應(yīng),鏈置換擴(kuò)增,基于轉(zhuǎn)錄的擴(kuò)增(參見(jiàn)D.Kwoh等,Proc.Natl.Acad Sci.USA86,1173-1177(1989)),自動(dòng)維持序列復(fù)制(或“3SR”)(參見(jiàn)J.Guatelli等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87,1874-1878(1990)),Qβ復(fù)制酶系統(tǒng)(參見(jiàn)P.Lizardi等,Biotechnology 6,1197-1202(1988)),基于核酸序列的擴(kuò)增(或“NASBA”)(參見(jiàn)R.Lewis,Ge-netic Engineering News 12(9),1(1992)),修復(fù)鏈反應(yīng)(或“RCR”)(參見(jiàn)R.Lewis,上文),和自返式(boomerang)DNA擴(kuò)增(或“BDA”)(參見(jiàn)R.Lewis,上文)。摻入擴(kuò)增產(chǎn)物中的堿基可以是天然堿基或修飾堿基(擴(kuò)增前或擴(kuò)增后修飾),且可以選擇最適合后續(xù)電化學(xué)檢測(cè)步驟的堿基。
也可依已知技術(shù)進(jìn)行聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)。例如參見(jiàn)美國(guó)專利Nos.4,683,195;4,683,202;4,800,159和4,965,188(本文引用的所有美國(guó)專利文獻(xiàn)的公開(kāi)說(shuō)明均并入本文作參考)。一般說(shuō)來(lái),PCR包括首先,在雜交條件下對(duì)待檢測(cè)的具體序列每條鏈用一個(gè)寡核苷酸引物處理核酸樣品(例如在熱穩(wěn)定性DNA聚合酶存在下),以合成出對(duì)每個(gè)核酸鏈互補(bǔ)的各引物延伸產(chǎn)物,引物對(duì)于雜交的具體序列每條鏈應(yīng)是充分互補(bǔ)的,所以由每個(gè)引物合成的延伸產(chǎn)物從其補(bǔ)體分離后,對(duì)于合成其它引物的延伸產(chǎn)物可起模板作用。然后,如果存在待檢測(cè)的某個(gè)或某些序列,在變性條件下處理樣品以從其模板分離引物延伸產(chǎn)物。循環(huán)重復(fù)這些步驟直至達(dá)到所需擴(kuò)增度。可這樣進(jìn)行擴(kuò)增序列的檢測(cè)往反應(yīng)產(chǎn)物中加入能與反應(yīng)產(chǎn)物雜交的寡核苷酸探針(例如本發(fā)明的寡核苷酸探針),該探針攜帶可檢測(cè)的標(biāo)記物;然后依已知技術(shù)檢測(cè)該標(biāo)記物。如果待擴(kuò)增的核酸是RNA,則可首先依已知技術(shù)通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄酶轉(zhuǎn)化成DNA而進(jìn)行擴(kuò)增。
可依已知技術(shù)進(jìn)行鏈置換擴(kuò)增(SDA)。通常參見(jiàn)G.Walker等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89,392-396(1992);G.Walker等,Nucleic Acids Res.20,1691-1696(1992)。例如,可用單個(gè)擴(kuò)增引物或擴(kuò)增引物對(duì)進(jìn)行SDA,后者實(shí)現(xiàn)指數(shù)式擴(kuò)增。一般說(shuō)來(lái),SDA擴(kuò)增引物包括5′至3′方向的旁側(cè)序列(它的DNA序列是非緊要的),反應(yīng)中應(yīng)用的限制酶的限制酶切位點(diǎn),和雜交至待擴(kuò)增和/或待檢測(cè)的靶序列的寡核苷酸序列(例如本發(fā)明的寡核苷酸探針)。有助于限制酶與識(shí)別位點(diǎn)結(jié)合并且在限制酶切位點(diǎn)帶切口后提供DNA聚合酶引發(fā)位點(diǎn)的旁側(cè)序列其長(zhǎng)度優(yōu)選約為15~20個(gè)核苷酸;限制酶切位點(diǎn)在SDA反應(yīng)中起作用(即摻入引物鏈的硫代磷酸酯鏈不會(huì)抑制后續(xù)的產(chǎn)生切口一可通過(guò)非回文識(shí)別位點(diǎn)的應(yīng)用而滿足的條件);寡核苷酸探針部分長(zhǎng)度優(yōu)選約13~15個(gè)核苷酸。
連接酶鏈反應(yīng)(LCR)也可依已知技術(shù)進(jìn)行。例如參見(jiàn)R.Weiss,Science 254,1292(1991)。大體上用兩對(duì)寡核苷酸探針進(jìn)行反應(yīng)一對(duì)與待測(cè)序列一條鏈結(jié)合;另一對(duì)與待測(cè)序列另一條鏈結(jié)合。每一對(duì)與其對(duì)應(yīng)的鏈完全重疊。反應(yīng)是這樣進(jìn)行的首先,使待測(cè)序列鏈變性(例如分離);然后,在熱穩(wěn)定性連接酶存在下使該鏈與兩對(duì)寡核苷酸探針?lè)磻?yīng)使得每對(duì)寡核苷酸探針連在一起,再分離反應(yīng)產(chǎn)物,然后循環(huán)重復(fù)該處理方法直至序列被擴(kuò)增到所需程度。接著就可以依與前述PCR類似方法進(jìn)行檢測(cè)。B.寡核苷酸探針如上所述,本發(fā)明的方法都適合于檢測(cè)DNA的雜交。該方法的第一步包括將DNA樣品與寡核苷酸探針接觸以形成雜交DNA。適用于本發(fā)明方法的寡核苷酸探針可以是任意探針,它包括約4或6個(gè)堿基至約80或100個(gè)堿基或更多個(gè),更優(yōu)選約8~約15個(gè)堿基。寡核苷酸探針可依本領(lǐng)域中熟知技術(shù)制備成任意寬范圍的堿基序列。制備寡核苷酸探針的合適堿基可選自天然核苷酸堿基例如腺嘌呤、胞嘧啶、鳥(niǎo)嘌呤、尿嘧啶和胸腺嘧啶;和非天然的或“合成的”核苷酸堿基例如8-氧鳥(niǎo)嘌呤、6-巰基鳥(niǎo)嘌呤、4-乙酰胞苷、5-(羧基羥乙基)尿苷、2′-O-甲基胞苷、5-羧基甲氨基-甲基-2-硫尿苷、5-羧基甲氨基甲基尿苷、二氫尿苷、2′-O-甲基假尿苷、β、D-半乳糖Q苷(queosine)、2′-O-甲基鳥(niǎo)苷、肌苷、N6-異戊烯腺苷、1-甲基腺苷、1-甲基假尿苷、1-甲基鳥(niǎo)苷、1-甲基肌苷、2,2-二甲基鳥(niǎo)苷、2-甲基腺苷、2-甲基鳥(niǎo)苷、3-甲基胞苷、5-甲基胞苷、N6-甲基腺苷、7-甲基鳥(niǎo)苷、5-甲氨基甲基尿苷、5-甲氧基氨基甲基-2-硫尿苷、β、D-甘露糖基Q苷、5-甲氧基羰基甲基尿苷、5-甲氧基尿苷、2-甲基硫-N6-異戊烯腺苷、N-((9-β-D-呋喃核糖-2-甲基硫代嘌呤-6-基)甲氨酰)蘇氨酸、N-((9-β-D-呋喃核糖嘌呤-6-基)N-甲基-甲氨酰)蘇氨酸、尿苷-5-氧乙酸甲酯、尿苷-5-氧乙酸、wybutoxosine、假尿苷、Q苷、2-硫胞苷、5-甲基-2-硫尿苷、2-硫尿苷、5-甲基尿苷、N-((9-β-D-呋喃核糖嘌呤-6-基)甲氨酰)蘇氨酸、2′-O-甲基-5-甲基尿苷、2′-O-甲基尿苷、wybutosine、和3-(3-氨基-3-羧基丙基)尿苷??蓱?yīng)用任意寡核苷酸主鏈,包括DNA,RNA(雖然DNA不如RNA更為優(yōu)選),修飾的糖例如碳環(huán),和含2′取代基如氟和甲氧基的糖。寡核苷酸可以是這種寡核苷酸其中至少一個(gè)或全部核苷酸間橋連的磷酸酯殘基是修飾磷酸酯,例如磷酸甲酯、硫代膦酸甲酯(methyl phosphonothioates)、偶磷酰嗎啉酯(phosphoro-morpholidates)、偶磷哌嗪酯(phosphoropiperazidates)和氨基磷酸酯(例如,每隔一個(gè)核苷酸間橋連的磷酸酯殘基可依所述被修飾)。寡核苷酸可以是例如由P.Nielsen等描述于Science 254,1497-1500(1991)中的“肽核酸”。唯一的要求是寡核苷酸探針應(yīng)具有這樣一種序列其至少一部分可以與DNA樣品序列的已知部分結(jié)合。在某些應(yīng)用中可能需要將DNA樣品與一些具有不同堿基序列(例如,如果樣品中有兩個(gè)或多個(gè)靶核酸,或者如果單個(gè)靶核酸在“夾心”式分析中與兩個(gè)或多個(gè)探針雜交)的寡核苷酸探針接觸。C.雜交方法可按本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任意合適方法將DNA(或核酸)樣品與寡核苷酸探針接觸。例如,可將DNA樣品溶于溶液,再通過(guò)在允許雜交的條件下將寡核苷酸探針溶于含DNA樣品的溶液而與寡核苷酸探針接觸。合適的條件是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的(例如參見(jiàn)授予Falkow等人的美國(guó)專利No.4,358,535和同樣引用的其它美國(guó)專利文獻(xiàn))并包括鹽濃度高的條件。也可將DNA樣品溶于溶液,而寡核苷酸探針固定于固相支持體上,通過(guò)將其上固定寡核苷酸探針的固相支持體浸入含DNA樣品的溶液而使DNA樣品與寡核苷酸探針接觸。D.氧化劑和氧化還原反應(yīng)當(dāng)雜交步驟先于氧化步驟時(shí),那么雜交后使雜交的DNA(或核酸)與合適的氧化劑反應(yīng),其中的氧化劑能在氧化還原反應(yīng)中氧化寡核苷酸探針中的預(yù)選堿基。寡核苷酸探針中預(yù)選的堿基可以是任意天然的或合成的核苷酸堿基,它與選定的氧化劑反應(yīng)時(shí)經(jīng)受氧化作用。與未配對(duì)時(shí)相比,配對(duì)時(shí)預(yù)選堿基表現(xiàn)出獨(dú)特的氧化速率。預(yù)選的堿基與四種天然堿基中每一個(gè)配對(duì)時(shí)應(yīng)表現(xiàn)出獨(dú)特的氧化速率。通常,其中5′-單核苷酸(例如5′-脫氧核糖核苷酸或5′-核糖核苷酸)表現(xiàn)的速率常數(shù)大于104M-1s-1的堿基可用催化反應(yīng)檢測(cè)。合適的預(yù)選堿基實(shí)例包括但不限于鳥(niǎo)嘌呤、腺嘌呤、8-氧鳥(niǎo)嘌呤、和8-氧腺嘌呤、8-溴鳥(niǎo)嘌呤、鳥(niǎo)苷、黃苷、wyosine、假尿苷、6-巰基鳥(niǎo)嘌呤、8-巰基鳥(niǎo)嘌呤、2-硫代黃嘌呤、6-硫代黃嘌呤、6-巰基嘌呤、2-氨基-6-羧甲基-巰基嘌呤、2-巰基嘌呤、6-甲氧基嘌吟、2-乙酰氨基-6-羥基嘌呤、6-甲硫基-2-羥基嘌呤、2-二甲氨基-6-羥基嘌呤、2-羥基嘌呤、2-氨基嘌呤、6-氨基-2-二甲基烯丙基嘌呤、2-硫代腺嘌呤、8-羥基腺嘌呤、8-甲氧基腺嘌呤。通常,預(yù)選的堿基選自鳥(niǎo)嘌呤、腺嘌呤、6-巰基鳥(niǎo)嘌呤、8-氧鳥(niǎo)嘌呤和8-氧腺嘌呤,其中鳥(niǎo)嘌呤通常是優(yōu)選的天然預(yù)選堿基,而6-巰基鳥(niǎo)嘌呤則通常是優(yōu)選的合成預(yù)選堿基。
氧化劑可以是任意荷電分子例如陽(yáng)離子類、陰離子類、或兩性離子分子,它與預(yù)選的堿基在獨(dú)特氧化勢(shì)時(shí)有反應(yīng)活性。所以氧化劑的選擇依賴于所選擇的特定預(yù)選堿基,且易于由本領(lǐng)域技術(shù)人員確定。特別優(yōu)選的氧化劑包括能與預(yù)選堿基進(jìn)行金屬-DNA電子傳遞的過(guò)渡金屬配合物,于是金屬配合物的還原形式被再生而完成催化循環(huán)。用于本發(fā)明方法中合適的過(guò)渡金屬配合物實(shí)例例如包括釕2+(2,2′-二吡啶)3(“Ru(bpy)32+),釕2+(4,4′-二甲基-2,2′-二吡啶)3(“Ru(Me2-bpy)32+”),釕2+(5,6-二甲基-1,10-菲咯啉)3(“Ru(Me2-phen)32+”),鐵2+(2,2′-二吡啶)3(“Fe(bpy)32+”),鐵2+(5-氯菲咯啉)3(“Fe(5-Cl-phen)32+”),鋨2+(2,2′-二吡啶)3(“Os(bpy)32+”),鋨2+(5-氯菲咯啉)3(“Os(5-Cl-phen)32+”),二氧合錸1+膦,和二氧合錸1+吡啶(“ReO2(py)41+”)。適用作氧化劑的一些陰離子配合物有Ru(bpy)((SO3)2-bpy)22+和Ru(bpy)((CO2)2-bpy)22+,適用作氧化劑的一些兩性離子配合物有Ru(bpy)2((SO3)2-bpy)和Ru(bpy)2((CO2)2-bpy),其中(SO3)2-bpy2-表示4,4′-二磺基(disulfonato)-2,2′-二吡啶,而(CO2)2-bpy2-表示4,4′-二羧基-2,2′-二吡啶。吡啶、二吡啶和菲咯啉基的合適的取代衍生物也可用于與前述任意金屬的配合物中。合適的取代衍生物包括但不限于4-氨基吡啶、4-二甲基吡啶、4-乙酰吡啶、4-硝基吡啶、4,4′-二氨基-2,2′-二吡啶、5,5′-二氨基-2,2′-二吡啶、6,6′-二氨基-2,2′-二吡啶、4,4′-二乙二胺-2,2′-二吡啶、5,5′-二乙二胺-2,2′-二吡啶、6,6′-二乙二胺-2,2′-二吡啶、4,4′-二羥基-2,2′-二吡啶、5,5′-二羥基-2,2′-二吡啶、6,6′-二羥基-2,2′-二吡啶、4,4′,4″-三氨基-2,2′,2”-三吡啶、4,4′,4″-三乙二胺-2,2′2″-三吡啶、4,4′,4″-三羥基-2,2′2″-三吡啶、4,4′,4″-三硝基-2,2′2″-三吡啶、4,4′,4″-三苯基-2,2′2″-三吡啶、4,7-二氨基-1,10-菲咯啉、3,8-二氨基-1,10-菲咯啉、4,7-二乙二胺-1,10-菲咯啉、3,8-二乙二胺-1,10-菲咯啉、4,7-二羥基-1,10-菲咯啉、3,8-二羥基-1,10-菲咯啉、4,7-二硝基-1,10-菲咯啉、3,8-二硝基-1,10-菲咯啉、4,7-二苯基-1,10-菲咯啉、3,8-二苯基-1,10-菲咯啉、4,7-二精胺(disperamine)-1,10-菲咯啉、3,8-二精胺-1,10-菲咯啉、和二吡啶并[3,2-a2′,2′-c]吩嗪。
可依任意合適的方法使氧化劑與雜交的DNA反應(yīng),以實(shí)現(xiàn)氧化劑與預(yù)選堿基的氧化還原反應(yīng)。所要求的是氧化劑在足以達(dá)到選擇性氧化預(yù)選堿基的條件下與雜交的DNA樣品反應(yīng)。例如,可在足以使氧化劑和預(yù)選的堿基發(fā)生氧化還原反應(yīng)的條件下,通過(guò)將氧化劑溶于含已溶解的雜交DNA的溶液中使過(guò)渡金屬與已溶解的雜交DNA反應(yīng)。另外,在其中雜交DNA被固定于固相支持體的實(shí)施方案中,可在足以使氧化劑和預(yù)選堿基發(fā)生氧化還原反應(yīng)的條件下,通過(guò)將氧化劑固定于同一固相支持體上并將該固相支持體浸入溶液而使氧化劑與雜交的DNA反應(yīng)。其中進(jìn)行氧化還原反應(yīng)的溶劑可以是溶解DNA的任意合適溶劑,且優(yōu)選包括水。允許發(fā)生氧化還原反應(yīng)的條件是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。
在雜交的DNA或核酸中,氧化劑結(jié)合于DNA的小溝內(nèi),于是通過(guò)雙(或三股)螺旋的獨(dú)特結(jié)構(gòu)阻止預(yù)選堿基與氧化劑之間的緊密接觸。預(yù)選堿基殘基的保護(hù)導(dǎo)致需要穿過(guò)溶劑的電子隧道,它減小電子傳遞速率。溶劑可及性隨與預(yù)選堿基配對(duì)的核苷酸堿基性質(zhì)而變。隧道距離可依下式估算k/kss=exp(-βΔr)其中Δr表示雙鏈體與單鏈相比的距離變化,kss表示氧化單鏈DNA樣品中預(yù)選堿基的速率常數(shù)。所以,預(yù)選堿基與氧化劑間的隧道距離對(duì)每個(gè)堿基配對(duì)和未配對(duì)DNA是不同的。因此,電子傳遞速率常數(shù)指示已配對(duì)的(或錯(cuò)配的)堿基的特性。如果電子傳遞的驅(qū)動(dòng)力顯著小于重排能(reorganizational energy)(λ),則依Marcus理論,RTlnk對(duì)驅(qū)動(dòng)力的曲線,對(duì)與反應(yīng)物的近似處理相關(guān)的工作項(xiàng)(work terms)作修正后,得斜率為1/2的直線。然后基于Marcus理論,可由下述方程式計(jì)算絕對(duì)速率常數(shù)k=vexp[-β(r-r0)]exp[-(ΔG+λ)2/4λRT]其中v表示擴(kuò)散控制極限內(nèi)的速率常數(shù)(1011M-1S-1),r表示活化配合物中反應(yīng)物和產(chǎn)物之間的距離,r0表示反應(yīng)物和產(chǎn)物的最近近似距離,而β表示居中介質(zhì)的效應(yīng)。如前所述,由于預(yù)選的堿基被摻入雜交DNA的內(nèi)部,這就會(huì)影響電子必須穿過(guò)隧道到達(dá)氧化劑的有限距離。所以,r不等于r0。水的β約為3-1。該較大的β值表明隧道距離的很小變化將會(huì)引起電子傳遞速率常數(shù)相當(dāng)大的變化。因?yàn)轭A(yù)選堿基和同預(yù)選堿基配對(duì)的堿基之間的DNA構(gòu)象依賴于同預(yù)選堿基配對(duì)的堿基,所以同預(yù)選堿基配對(duì)的堿基影響隧道距離,即電子必須穿過(guò)的、預(yù)選堿基和氧化劑之間的距離。從而建立了隧道距離和同預(yù)選堿基配對(duì)的特定堿基之間的關(guān)系。E.檢測(cè)氧化還原反應(yīng)氧化還原反應(yīng)的發(fā)生可依本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任意合適方法檢測(cè)。例如,氧化還原反應(yīng)的發(fā)生可這樣檢測(cè)應(yīng)用檢測(cè)電極監(jiān)測(cè)能預(yù)示發(fā)生氧化還原反應(yīng)的電信號(hào)變化。通常,將對(duì)于氧化劑和雜交DNA之間電子傳遞敏感的檢測(cè)電極置于含反應(yīng)的雜交DNA和氧化劑的溶液中。一般將參比電極和輔助電極也置于該溶液與檢測(cè)電極配合(使大部分電流通過(guò)該輔助電極)。合適的檢測(cè)電極是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的,例如包括玻璃狀碳電極或銦錫氧化物電極。同樣,合適的參比電極也是本領(lǐng)域已知的,例如包括銀/氯化銀電極。
檢測(cè)與氧化還原反應(yīng)有關(guān)的電信號(hào)可確定是否存在雜交的DNA。確定是否存在雜交DNA的步驟一般包括(i)測(cè)定氧化還原反應(yīng)的反應(yīng)速率,(ii)比較測(cè)得的反應(yīng)速率與過(guò)渡金屬配合物同單鏈DNA的氧化還原反應(yīng)速率,然后(iii)確定測(cè)得的反應(yīng)速率是否與過(guò)渡金屬配合物同單鏈DNA的氧化還原反應(yīng)速率基本相同??梢廊我夂线m的方法進(jìn)行反應(yīng)速率的測(cè)定。例如,可這樣測(cè)定相對(duì)反應(yīng)速率比較電流作為掃描速率、探針濃度、靶濃度、介體、緩沖液、溫度的函數(shù)關(guān)系,和/或電化學(xué)法。
可按本領(lǐng)域技術(shù)人員所知的合適方法測(cè)定氧化還原反應(yīng)速率。通常,通過(guò)測(cè)定與發(fā)生氧化還原反應(yīng)相關(guān)的電信號(hào)而測(cè)定氧化還原反應(yīng)速率。例如,與氧化還原反應(yīng)相關(guān)的電信號(hào)可通過(guò)提供合適的裝置與檢測(cè)電極進(jìn)行電子傳遞而測(cè)定。合適的裝置應(yīng)能測(cè)定產(chǎn)生的電信號(hào)以便測(cè)定雜交DNA與氧化劑反應(yīng)的氧化還原反應(yīng)速率。電信號(hào)可能是任何電化學(xué)法的特征,其中的電化學(xué)法包括循環(huán)的伏安法、穩(wěn)態(tài)脈沖伏安法、計(jì)時(shí)安培分析法和方波伏安法,循環(huán)伏安法是優(yōu)選的形式。
然后可比較測(cè)得的反應(yīng)速率和過(guò)渡金屬配合物與單鏈DNA的氧化還原反應(yīng)速率。如前述詳細(xì)討論中所示,氧化劑和雜交DNA或單鏈DNA中所選擇堿基之間的隧道距離會(huì)影響氧化劑和預(yù)選堿基之間反應(yīng)的氧化還原反應(yīng)速率。所以,雜交DNA和單鏈DNA各表現(xiàn)不同的氧化還原反應(yīng)速率。預(yù)選堿基處是否存在雜交的DNA,可通過(guò)確定測(cè)得的氧化還原反應(yīng)速率是否與氧化劑和單鏈DNA中預(yù)選堿基的氧化還原反應(yīng)速率相同而測(cè)定。此外,氧化劑和預(yù)選堿基間的隧道距離會(huì)依預(yù)選堿基與其配對(duì)物之間的鍵長(zhǎng)而不同,這樣可鑒別配對(duì)的每個(gè)可能堿基與其它堿基。預(yù)選堿基和它的配對(duì)物之間的鍵長(zhǎng)依賴于同預(yù)選堿基配對(duì)的堿基。例如,氧化同腺嘌呤配對(duì)的鳥(niǎo)嘌呤的氧化還原反應(yīng)速率不同于氧化同胞嘧啶配對(duì)的鳥(niǎo)嘌呤的氧化還原反應(yīng)速率,反過(guò)來(lái)它又不同于氧化同鳥(niǎo)嘌呤配對(duì)的鳥(niǎo)嘌呤的氧化還原反應(yīng)速率,它也不同于氧化同胸腺嘧啶配對(duì)的鳥(niǎo)嘌呤的氧化還原反應(yīng)速率。確切地說(shuō),氧化鳥(niǎo)嘌呤的氧化還原反應(yīng)速率遵循該趨勢(shì)其中單鏈鳥(niǎo)嘌呤大于與腺嘌呤配對(duì)的鳥(niǎo)嘌呤,后者大于與鳥(niǎo)嘌呤配對(duì)的鳥(niǎo)嘌呤,后者又大于與胸腺嘧啶配對(duì)的鳥(niǎo)嘌呤,后者大于與胞嘧啶配對(duì)的鳥(niǎo)嘌呤。因此,本發(fā)明的方法適用于檢測(cè)在預(yù)選堿基上或在毗鄰預(yù)選堿基的堿基對(duì)上的單個(gè)堿基對(duì)錯(cuò)配。
區(qū)別氧化與各個(gè)不同天然堿基配對(duì)的預(yù)選堿基的氧化還原反應(yīng)速率也有助于鑒別與預(yù)選堿基配對(duì)的堿基。鑒別與預(yù)選堿基配對(duì)的堿基的方法如下(i)測(cè)定檢測(cè)的氧化還原反應(yīng)的反應(yīng)速率,(ii)比較測(cè)得的反應(yīng)速率與如下四個(gè)已知的氧化還原反應(yīng)速率中的每一個(gè)即氧化劑與具有結(jié)合到預(yù)選堿基上的腺票呤、胞嘧啶、鳥(niǎo)嘌呤或胸腺嘧啶的DNA的反應(yīng)速率,和(iii)確定已知氧化還原反應(yīng)速率的哪一個(gè)與測(cè)得的反應(yīng)速率基本相同。反應(yīng)速率可依上述方法測(cè)定。同樣,氧化劑與具有結(jié)合到預(yù)選堿基上的腺嘌呤、胞嘧啶、鳥(niǎo)嘌呤或胸腺嘧啶的DNA之間的氧化還原反應(yīng)四個(gè)不同的反應(yīng)速率也可依同樣方法測(cè)定,使得這些反應(yīng)速率成為已知值。然后可以將測(cè)得的、氧化劑與雜交DNA的氧化還原反應(yīng)的反應(yīng)速率與已知的氧化劑與具有結(jié)合到預(yù)選堿基上的腺嘌呤、胞嘧啶、鳥(niǎo)嘌呤或胸腺嘧啶的DNA的氧化還原反應(yīng)速率進(jìn)行比較。例如,可這樣測(cè)定與預(yù)選堿基配對(duì)的堿基,即通過(guò)測(cè)定其氧化還原反應(yīng)速率與測(cè)得的氧化還原反應(yīng)速率基本相同的已知堿基配對(duì)。F.DNA測(cè)序本發(fā)明還提供DNA測(cè)序的方法,它包括(a)將DNA樣品與寡核苷酸探針接觸以形成雜交DNA,該寡核苷酸探針包括具有獨(dú)特氧化勢(shì)的預(yù)選合成堿基;(b)使雜交DNA與氧化劑如過(guò)渡金屬配合物反應(yīng),該氧化劑能在氧化還原反應(yīng)中氧化寡核苷酸探針中的預(yù)選合成堿基,該寡核苷酸探針具有預(yù)定數(shù)的預(yù)選合成堿基;(c)檢測(cè)該氧化還原反應(yīng);(d)測(cè)定檢測(cè)的氧化還原反應(yīng)的反應(yīng)速率;和(e)鑒定與預(yù)選合成堿基配對(duì)的堿基。
如上文討論的方法中所示,可依本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法,在與寡核苷酸探針接觸之前擴(kuò)增DNA樣品。合成堿基可選自上文所述的堿基,和本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的其它合成堿基。唯一的限制因素是,與四種天然堿基即腺嘌呤、胞嘧啶、鳥(niǎo)嘌呤和胸腺嘧啶的氧化勢(shì)相比,合成堿基應(yīng)具有獨(dú)特氧化勢(shì)。可依上文所述方法進(jìn)行如下步驟將DNA樣品與寡核苷酸探針接觸;使雜交DNA與氧化劑反應(yīng),檢測(cè)該氧化還原反應(yīng),和測(cè)定反應(yīng)速率。鑒定與預(yù)選合成堿基配對(duì)的堿基步驟包括(i)將測(cè)得的反應(yīng)速率與已知的如下四種不同氧化還原反應(yīng)速率中的每一種比較,即氧化劑與具有結(jié)合到預(yù)選合成堿基上的腺嘌呤、胞嘧啶、鳥(niǎo)嘌呤或胸腺嘧啶的DNA反應(yīng);和(ii)確定已知氧化還原反應(yīng)速率中哪一個(gè)與測(cè)得的反應(yīng)速率基本相同。
在另一個(gè)實(shí)施方案中,寡核苷酸探針進(jìn)一步包括第二種預(yù)選的合成堿基。第二種預(yù)選合成堿基具有不同于第一種預(yù)選合成堿基的氧化勢(shì)的特定氧化勢(shì)。在該實(shí)施方案中,檢測(cè)氧化劑與預(yù)選堿基的氧化還原反應(yīng)的步驟進(jìn)一步包括也檢測(cè)氧化劑與第二種預(yù)選合成堿基的氧化還原反應(yīng)。此外,測(cè)定氧化還原反應(yīng)速率的步驟進(jìn)一步包括也測(cè)定氧化劑氧化第二種預(yù)選堿基的氧化還原反應(yīng)速率。還有,鑒定與預(yù)選合成堿基配對(duì)的堿基的步驟進(jìn)一步包括也鑒定與第二種預(yù)選合成堿基配對(duì)的堿基。依該實(shí)施方案,可檢測(cè)兩種預(yù)選合成堿基的氧化還原反應(yīng),使得可應(yīng)用上文所述的方法最終鑒定與每個(gè)預(yù)選合成堿基配對(duì)的堿基。本領(lǐng)域技術(shù)人員會(huì)明白,對(duì)于兩個(gè)以上預(yù)選的合成堿基可進(jìn)行前述方法,只要每個(gè)預(yù)選合成堿基表現(xiàn)出的獨(dú)特氧化勢(shì)不同于其它所有預(yù)選合成堿基的氧化勢(shì),且不同于四種天然堿基中每一個(gè)的氧化勢(shì)。
因?yàn)榕c預(yù)選堿基配對(duì)的每個(gè)堿基可依文中所述方法鑒定,所以可這樣對(duì)DNA測(cè)序通過(guò)重復(fù)前述方法的步驟,應(yīng)用足夠數(shù)量不同的寡核苷酸探針,所述探針在不同位點(diǎn)上具有預(yù)選的合成堿基,以鑒定DNA樣品中的各個(gè)堿基。換言之,DNA樣品是這樣測(cè)序的通過(guò)提供足夠數(shù)量的寡核苷酸探針,其中每個(gè)探針序列包括至少一個(gè)預(yù)選的合成堿基,且在每個(gè)寡核苷酸探針中,合成堿基處于沿探針序列不同的、經(jīng)計(jì)算的位點(diǎn)上。這樣,重復(fù)檢測(cè)雜交DNA與氧化劑的氧化還原反應(yīng),測(cè)定該氧化還原反應(yīng)速率,并鑒定與預(yù)選合成堿基配對(duì)的堿基,就可以逐個(gè)鑒定DNA樣品序列中的堿基。G.裝置本發(fā)明也提供適用于實(shí)施本發(fā)明方法的裝置。這類裝置代表性之一的示意圖如圖3所示。該裝置一般包括多個(gè)DNA樣品容器10。驅(qū)動(dòng)組件11用作傳送多個(gè)DNA樣品容器的樣品處理工具。貯液器12、加料管線13和閥14用作寡核苷酸探針遞送工具以傳送寡核苷酸探針至每個(gè)DNA樣品容器;相應(yīng)地,貯液器15、加料管線16和閥17用作氧化劑遞送工具以傳送過(guò)渡金屬配合物至各個(gè)DNA樣品容器。包括驅(qū)動(dòng)器21和探針22的探針組件20用作氧化還原反應(yīng)檢測(cè)器以檢測(cè)氧化還原反應(yīng)。操作時(shí),DNA樣品被預(yù)先存放在樣品容器10中。然后驅(qū)動(dòng)組件11依次傳送樣品容器10至寡核苷酸探針遞送工具和氧化劑遞傳工具下面以傳送那里的各種反應(yīng)物。遞送反應(yīng)物之后,用驅(qū)動(dòng)工具將各個(gè)樣品容器送到探針22下面,而探針22被驅(qū)動(dòng)器21送入樣品容器以檢測(cè)氧化還原反應(yīng)。完成循環(huán)伏安圖所需的其它電極與探針22一起被傳送。操作各組件和收集數(shù)據(jù)可用合適的控制器30例如在通用計(jì)算機(jī)上運(yùn)行的軟件程序來(lái)進(jìn)行。
本領(lǐng)域技術(shù)人員當(dāng)然易于明白上述裝置的多種變體形式。多個(gè)DNA樣品容器可以是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何合適容器,包括微量滴定板、試管、培養(yǎng)皿、培養(yǎng)瓶、固相支持體等等,它們都能盛裝DNA樣品。樣品處理工具可以是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任意適當(dāng)?shù)卦O(shè)計(jì)的樣品容器處理工具,它能傳送DNA樣品容器。
用于傳送寡核苷酸探針至每個(gè)DNA樣品容器的、合適的寡核苷酸探針遞送工具是本領(lǐng)域熟知的。例如,依一個(gè)實(shí)施方案,寡核苷酸探針遞送工具包括其上固定有寡核苷酸探針的固相支持體。該寡核苷酸探針遞送工具應(yīng)允許DNA樣品與寡核苷酸探針在合適的條件下充分接觸,以實(shí)現(xiàn)DNA樣品和寡核苷酸探針的雜交。用于傳遞氧化劑至多個(gè)DNA樣品容器中每一個(gè)的、合適的氧化劑遞送工具是本領(lǐng)域熟知的。例如,依一個(gè)實(shí)施方案,將氧化劑連結(jié)到固相支持體上而構(gòu)成氧化劑遞送工具。依一個(gè)實(shí)施方案,用于檢測(cè)氧化還原反應(yīng)的氧化還原反應(yīng)檢測(cè)器可包括能檢測(cè)預(yù)選堿基的氧化的一個(gè)或多個(gè)電極。合適的檢測(cè)電極和參比電極參照本發(fā)明的方法已被描述于上文。電極優(yōu)選與測(cè)定氧化還原反應(yīng)的氧化還原反應(yīng)速率的儀器電連接。如上文所述,測(cè)定氧化還原反應(yīng)速率的合適儀器是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。
在本發(fā)明裝置的另一個(gè)實(shí)施方案中,檢測(cè)DNA雜交的裝置包括(a)一個(gè)DNA樣品容器;(b)用于傳送多個(gè)寡核苷酸探針至DNA樣品容器的寡核苷酸探針遞送工具;(c)用于傳送氧化劑至DNA樣品容器的氧化劑遞送工具;和(d)用于檢測(cè)氧化還原反應(yīng)的氧化還原反應(yīng)檢測(cè)器。被采用的、具有固定化探針的這類裝置例如下列文獻(xiàn)中描述的那些授予Pirrung等人的美國(guó)專利Nos.5,143,854和5,405,783;Fodor等人,Nature364555(1993);Bains,Angew.Chem.107356(1995);和Noble,Analytical Chemistry 67(5)21(1995),它們公開(kāi)的內(nèi)容均全文并入本文作參考。
如上所述,DNA樣品容器可以是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任意合適的容器。寡核苷酸探針遞送工具優(yōu)選是固相支持體,其上固定有許多寡核苷酸探針,該遞送工具能傳遞探針至DNA樣品容器。例如,依一個(gè)實(shí)施方案,在足以使DNA樣品與一個(gè)或多個(gè)寡核苷酸探針雜交的條件下,于DNA樣品容器內(nèi),使其上固定有許多寡核苷酸探針的固相支持體與DNA樣品接觸。
用于傳送氧化劑至DNA樣品容器的、合適的氧化劑遞送工具如上文所述。優(yōu)選的氧化劑遞送工具包括其上固定有氧化劑的固相支持體。依一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案,氧化劑和許多寡核苷酸探針被固定于相同的固相支持體上。
本發(fā)明的裝置適用于進(jìn)行多種DNA樣品的診斷分析。許多個(gè)寡核苷酸探針能在一個(gè)樣品中分析和檢測(cè)多種DNA,于是提供對(duì)一個(gè)樣品普查多種DNA包括病原體、病毒等等的適用工具。H.RNA雜交檢測(cè),RNA測(cè)序,和RNA錯(cuò)配檢測(cè)本文還公開(kāi)了檢測(cè)RNA雜交的方法、RNA測(cè)序方法、和檢測(cè)RNA錯(cuò)配的方法。適用于進(jìn)行這些方法的RNA包括但不限于核糖體RNA、轉(zhuǎn)移RNA或基因組RNA(例如,得自RNA病毒如逆轉(zhuǎn)錄病毒、HIV-1等等的RNA)。因此,本發(fā)明的第一個(gè)方面是檢測(cè)RNA雜交的方法,它包括(a)將RNA樣品與寡核苷酸探針接觸以形成雜交的RNA;(b)使雜交的RNA與能在氧化還原反應(yīng)中氧化寡核苷酸探針中預(yù)選堿基的過(guò)渡金屬配合物反應(yīng),該寡核苷酸探針至少具有一個(gè)預(yù)選的堿基;(c)檢測(cè)該氧化還原反應(yīng);(d)通過(guò)預(yù)選堿基上檢測(cè)的氧化還原反應(yīng)確定是否存在雜交RNA。
更確切地說(shuō),檢測(cè)RNA雜交的方法包括(a)將RNA樣品與寡核苷酸探針接觸以形成雜交的RNA;(b)使雜交的RNA與能在氧化還原反應(yīng)中氧化寡核苷酸探針中預(yù)選堿基的過(guò)渡金屬配合物反應(yīng),該寡核苷酸探針至少具有一個(gè)預(yù)選的堿基;(c)檢測(cè)該氧化還原反應(yīng);(d)測(cè)定檢測(cè)的氧化還原反應(yīng)的反應(yīng)速率;(e)將測(cè)得的反應(yīng)速率與過(guò)渡金屬配合物同單鏈RNA的氧化還原反應(yīng)速率進(jìn)行比較;然后(f)確定所測(cè)得的反應(yīng)速率是否與該過(guò)渡金屬配合物同單鏈RNA的氧化還原反應(yīng)速率相同。
測(cè)序RNA的方法包括(a)將RNA樣品與寡核苷酸探針接觸以形成雜交的RNA,該寡核苷酸探針包括具有獨(dú)特氧化速率的預(yù)選堿基;(b)使雜交的RNA與能在氧化還原反應(yīng)中氧化寡核苷酸探針中預(yù)選堿基的過(guò)渡金屬配合物反應(yīng),該寡核苷酸探針具有預(yù)定數(shù)量的預(yù)選堿基;(c)檢測(cè)該氧化還原反應(yīng);(d)測(cè)定檢測(cè)的氧化還原反應(yīng)的反應(yīng)速率;和(e)鑒定與預(yù)選堿基配對(duì)的堿基。
寡核苷酸探針、雜交方法、氧化劑、氧化還原反應(yīng)的檢測(cè)、和用于實(shí)施這些方法的裝置均基本上如前面A-H項(xiàng)中所述,依本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的原理(例如尿嘧啶代替胸腺嘧啶作為堿基)適用于RNA為核酸樣品。I.檢測(cè)靶核酸上的預(yù)選堿基在前面具體描述的方法中,金屬配合物被用于從單鏈和雙鏈DNA或核酸獲得電化電流。優(yōu)選的堿基如鳥(niǎo)嘌呤給出電化學(xué)信號(hào),且對(duì)雙鏈DNA來(lái)說(shuō)該電化學(xué)信號(hào)更弱。這類方法優(yōu)勢(shì)在于表現(xiàn)高度的結(jié)構(gòu)敏感性,所以能分辨單個(gè)的堿基錯(cuò)配。因此這類方法特別適用于DNA測(cè)序。然而,這類方法有兩個(gè)缺點(diǎn)(a)從探針鏈到雜交體存在負(fù)信號(hào),和(b)沒(méi)有信號(hào)的放大。下列技術(shù)提供了解決這些問(wèn)題的方法。此外,下列技術(shù)特別適用于診斷分析,因而特別適用于定量檢測(cè)核酸。
鑒于前面所述,本文還公開(kāi)了檢測(cè)猜測(cè)含有靶核酸的試驗(yàn)樣品中是否存在靶核酸的方法,其中的靶核酸至少含一種預(yù)選的堿基。與上述方法形成對(duì)照,本方法中預(yù)選的堿基定位于靶核酸上,而不是在寡核苷酸探針上。
可對(duì)于含該靶核酸的試驗(yàn)樣品實(shí)施該方法。猜測(cè)含該靶核酸的任意試驗(yàn)樣品均可使用,樣品包括(但不限于)組織樣品如活組織檢查樣品和生物液體如血液、唾沫、尿和精液樣品,細(xì)菌培養(yǎng)物,土壤樣品,食物樣品等等。靶核酸可以是任意來(lái)源的,包括動(dòng)物,植物或微生物的(例如病毒的、原核生物細(xì)菌的和真核生物細(xì)菌的、原生動(dòng)物的,真菌的,始生類(protoctistal)的等等)視具體實(shí)驗(yàn)?zāi)康亩?。可以在?shí)施本方法之前先依已知方法或本領(lǐng)域技術(shù)人員明白的方法進(jìn)行處理或純化;而且如果需要的話,在實(shí)施本發(fā)明的方法之前,可以將其中的核酸消化、裂解和/或擴(kuò)增(見(jiàn)前述)。
如圖4中所示,該方法包括(a)將試驗(yàn)樣品與專一性地結(jié)合靶核酸的寡核苷酸探針接觸以形成雜交核酸;(b)使雜交核酸與在氧化還原反應(yīng)中氧化預(yù)選堿基的過(guò)渡金屬配合物接觸;(c)檢測(cè)是否存在與雜交核酸相關(guān)的氧化還原反應(yīng);和(d)從預(yù)選堿基上檢測(cè)的氧化還原反應(yīng)確定試驗(yàn)樣品中是否存在靶核酸。如圖4中所示,可將寡核苷酸探針固定于固相支持體上以便分離試驗(yàn)樣品與雜交核酸,其中的分離步驟先于檢測(cè)步驟而進(jìn)行(例如在步驟(a)和(b)之間或者在步驟(b)和(c)之間)。另外,寡核苷酸探針可以溶液中游離態(tài)形式提供,也可以分離雜交核酸與樣品的其它方法提供(例如,通過(guò)與寡核苷酸探針結(jié)合的介體核酸,或通過(guò)生物素-親和素結(jié)合相互作用,其中生物素與寡核苷酸探針結(jié)合,而親和素則固定于固相支持體上)。
靶核酸優(yōu)選比寡核苷酸探針至少多含10個(gè)預(yù)選堿基,或更優(yōu)選比寡核苷酸探針至少多含50或100個(gè)預(yù)選堿基。如果靶核酸比寡核苷酸探針含多得多的預(yù)選堿基,則有益于獲得更大的電流增強(qiáng)效果。
寡核苷酸探針任意但優(yōu)選不合預(yù)選堿基,或至少基本上不含預(yù)選堿基(即含足夠少的預(yù)選堿基,使得探針的信號(hào)不干擾或不被誤認(rèn)為靶核酸的信號(hào))。在得不到有利于與靶核酸雜交的天然堿基的序列時(shí),可以采取應(yīng)用氧化還原非活性的(下文將討論)其它堿基的方法。
靶核酸優(yōu)選長(zhǎng)于寡核苷酸探針,如圖4中所示,并且雜交的核酸中至少有一個(gè)預(yù)選堿基未與寡核苷酸探針雜交(即,是一個(gè)“懸垂著的”堿基)。優(yōu)選至少有10、50或100個(gè)預(yù)選堿基是“懸垂著的”堿基,于是提供測(cè)得的大為放大的電化學(xué)信號(hào)。
例如,可應(yīng)用不含任何鳥(niǎo)嘌呤殘基(如只有A、T和C)的寡核苷酸探針。在該鏈存在下Ru(bpy)32+的循環(huán)伏安圖與沒(méi)有該寡聚體時(shí)的非常相似。然后該鏈與靶鏈雜交,其中靶鏈的重疊堿基配對(duì)區(qū)或者當(dāng)靶核酸長(zhǎng)于寡核苷酸探針時(shí)的懸垂區(qū),兩區(qū)之一含有或兩區(qū)均含有鳥(niǎo)嘌呤(如圖4中所示,毗鄰靶核酸鏈的“G”)。由于檢測(cè)到多個(gè)鳥(niǎo)嘌呤,所以相對(duì)于形成雜交體的數(shù)目來(lái)說(shuō)信號(hào)被放大了。在基因組DNA或RNA為靶鏈時(shí),遇到大量懸垂著的鳥(niǎo)嘌呤,就會(huì)給出相當(dāng)強(qiáng)的信號(hào)放大。例如,特定的有機(jī)體中核糖體RNA可能含多達(dá)1,000個(gè)鳥(niǎo)嘌呤,因此每次雜交會(huì)提供大約1000倍的放大作用。
例如,在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中,對(duì)于靶鏈上預(yù)選堿基的分析包括將(優(yōu)選的氧化還原沉默的)探針鏈固定于固體表面,固體表面取向靠近電極表面,當(dāng)存在介體下掃描時(shí)它就提供弱背景信號(hào)。然后將固體表面與含預(yù)選堿基的靶鏈的溶液接觸。如果發(fā)生了雜交,則靶鏈就會(huì)與電極靠得很近,且將會(huì)檢測(cè)到電流增強(qiáng)。
定量測(cè)定核酸。本發(fā)明方法尤其適合于定量檢測(cè)核酸。在本節(jié)描述的場(chǎng)合中,氧化劑(例如Ru(bpy)33+)氧化雜交體的速率常數(shù)通過(guò)數(shù)字仿真從循環(huán)伏安圖(或其它電子信號(hào))測(cè)定。在多數(shù)情況下該反應(yīng)將服從二級(jí)動(dòng)力學(xué),所以速率=k[Ru(bpy)32+][DNA],其中k表示速率常數(shù),它對(duì)于具體的探針-靶雜交體是專一性的,[Ru(bpy)32+]表示氧化劑濃度,而[DNA]表示雜交體(可以是DNA-RNA雜交體)的濃度。如果k和[Ru(bpy)32+]是已知的,則可測(cè)定雜交體的量。實(shí)際上,業(yè)已用含靶DNA或RNA的、不同量的標(biāo)準(zhǔn)溶液繪制出電流增強(qiáng)的校準(zhǔn)曲線,并利用該電流增強(qiáng)直接得到雜交體的量。然后將該量直接與靶物質(zhì)(例如臨床樣品中的傳染性有機(jī)體)的量聯(lián)系。例如參見(jiàn)M.Holodniy等人,J.Virol.69,3510-3516(1995);J.Mellors等,Science 272,1167-1170(1996)。
寡核苷酸探針、雜交方法、氧化劑和氧化還原反應(yīng)方法、氧化還原反應(yīng)的檢測(cè)、和適用于實(shí)施這些方法的裝置已給出于前述A-H節(jié)中。J.氧化還原惰性的備擇堿基上述H節(jié)中所述方法的一個(gè)缺點(diǎn)是寡核苷酸探針優(yōu)選不含大量預(yù)選堿基(例如鳥(niǎo)嘌呤)。解決該問(wèn)題的一個(gè)辦法是應(yīng)用備擇堿基以代替探針鏈中的鳥(niǎo)嘌呤(即類似鳥(niǎo)嘌呤的堿基,它比核酸雙鏈體中的其它堿基具有更大的胞嘧啶結(jié)合親和力)但不會(huì)在應(yīng)用的反應(yīng)條件下被氧化劑氧化。當(dāng)鳥(niǎo)嘌呤是預(yù)選堿基時(shí)這類備擇堿基的實(shí)例有肌苷和7-脫氮-鳥(niǎo)嘌呤。
因此,檢測(cè)靶核酸的方法,其中靶核酸至少含一個(gè)預(yù)選堿基而探針或捕捉核酸含備擇氧化還原惰性堿基,該方法包括(a)將靶核酸和能專一性地與靶核酸結(jié)合的互補(bǔ)核酸接觸而形成雜交核酸;(b)使雜交核酸與能在氧化還原反應(yīng)中氧化預(yù)選堿基的過(guò)渡金屬配合物反應(yīng);(c)檢測(cè)該氧化還原反應(yīng);和(d)通過(guò)預(yù)選堿基上檢測(cè)的氧化還原反應(yīng)確定是否存在核酸。當(dāng)靶核酸中的預(yù)選堿基是鳥(niǎo)嘌呤且靶核酸含胞嘧啶(它通常將與互補(bǔ)核酸中的鳥(niǎo)嘌呤結(jié)合)時(shí),則互補(bǔ)核酸含與雜交核酸中胞嘧啶結(jié)合的備擇堿基。該備擇堿基可選自肌苷和7-脫氮-鳥(niǎo)嘌呤。反應(yīng)步驟一般包括在足以實(shí)現(xiàn)預(yù)選堿基的選擇性氧化而不致于氧化備擇堿基的條件下,使過(guò)渡金屬配合物與核酸反應(yīng)。
寡核苷酸探針、雜交方法、氧化劑和氧化還原反應(yīng)方法、氧化還原反應(yīng)的檢測(cè)和實(shí)施這些方法適用的裝置均給出于上述A-I節(jié)中。K.用末端轉(zhuǎn)移酶聚合預(yù)選堿基上文H節(jié)中所述方法的另一實(shí)施方案包括用末端轉(zhuǎn)移酶延長(zhǎng)靶核酸以在其上提供附加的預(yù)選堿基。如圖7中所示,這種方法包括(a)將試驗(yàn)樣品和能專一性地與靶核酸結(jié)合的寡核苷酸探針接觸而形成雜交核酸,該寡核苷酸探針具有被封閉而不能由末端轉(zhuǎn)移酶延長(zhǎng)的末端;(b)在末端轉(zhuǎn)移酶存在下使寡核苷酸探針與含預(yù)選堿基的溶液接觸而產(chǎn)生靶核酸的延伸產(chǎn)物,該延伸產(chǎn)物包括預(yù)選堿基;(c)將寡核苷酸探針與在氧化還原反應(yīng)氧化預(yù)選堿基的過(guò)渡金屬配合物接觸;(d)檢測(cè)是否存在氧化還原反應(yīng);和(e)通過(guò)預(yù)選堿基上檢測(cè)的氧化還原反應(yīng)確定試驗(yàn)樣品中是否存在靶核酸。優(yōu)選在檢測(cè)步驟之前將試驗(yàn)樣品與寡核苷酸探針?lè)蛛x,更優(yōu)選在上述步驟(a)和(b)之間分離試驗(yàn)樣品與該探針??梢酝ㄟ^(guò)應(yīng)用固定化探針進(jìn)行分離,或提供處于溶液中的游離探針,如上文H節(jié)中所述。
寡核苷酸探針、雜交方法、氧化劑和氧化還原反應(yīng)方法、氧化還原反應(yīng)的檢測(cè)、和實(shí)施這些方法適用的裝置均給出于上文的A-I節(jié)中。L.夾心分析上文H節(jié)的方法進(jìn)一步的實(shí)施方案是所謂的“夾心”分析,如圖8中所示。在夾心分析中,靶核酸是三元(或多元)雜交體的一部分,該雜交體包括捕捉探針、靶核酸和信號(hào)探針。
檢測(cè)猜測(cè)含靶核酸的試驗(yàn)樣品中靶核酸存在與否的方法包括(a)提供寡核苷酸捕捉探針,其中捕捉探針專一性地與該靶核酸結(jié)合;(b)將試驗(yàn)樣品與捕捉探針接觸以形成雜交核酸;(c)使寡核苷酸信號(hào)探針與雜交核酸接觸,其中信號(hào)探針專一性地結(jié)合其中的靶核酸,且其中信號(hào)探針至少含一個(gè)預(yù)選堿基,以產(chǎn)生雜交核酸夾心;(d)將雜交核酸雜心與在氧化還原反應(yīng)中氧化預(yù)選堿基的過(guò)渡金屬配合物接觸;(e)檢測(cè)是否存在與雜交核酸相關(guān)的氧化還原反應(yīng);和(f)通過(guò)預(yù)選堿基上檢測(cè)的氧化還原反應(yīng)確定試驗(yàn)樣品中是否存在靶核酸。試驗(yàn)樣品優(yōu)選與捕捉探針?lè)蛛x,其中分離步驟可發(fā)生于上述步驟(b)和步驟(c)之間,或于上述步驟(c)和步驟(d)之間。依分析方式(例如異相或均相)而定,該寡核苷酸捕捉探針可被固定于固相支持體上(例如聚合物珠粒,片狀物,或微量滴定板孔內(nèi)表面),或如前所述可提供其它方法以分離雜交核酸與試驗(yàn)樣品。
各種“夾心”分析形式都是已知的。對(duì)分析形式的選擇并不關(guān)鍵,且任何合適的形式都可用于實(shí)施本發(fā)明。例如,如授予Ranki等人的美國(guó)專利No.4,486,539中所述,寡核苷酸捕捉探針可固定于固相支持體上。如授予Kurn等人的美國(guó)專利No.4,868,104中所述,寡核苷酸探針可含聚合物形成單元,且雜交核酸夾心可通過(guò)其聚合而被分離。如M.S.Urdea,Clinical Chem.39,725-726(1993)中所述,信號(hào)探針可以是線型或分枝結(jié)構(gòu)。可應(yīng)用如授予Stabinsky的美國(guó)專利No.4,751,177中所述的介體多核苷酸,它將寡核苷酸捕捉探針與固定化多核苷酸結(jié)合。寡核苷酸探針可連接至專一性結(jié)合對(duì)(如生物素)的一結(jié)構(gòu)單元上,而雜交核酸夾心則通過(guò)與結(jié)合對(duì)其它結(jié)構(gòu)單元的第二相互結(jié)合作用從試驗(yàn)樣品中分離,如下列文獻(xiàn)中所述,它被固定于固相支持體(如阿維丁)上R.Goodson,EPO Ap-plication 0238332;W.Harrison,EPO Application 0139489,和N.Dattagupta,EPO Application 0192168。
寡核苷酸探針、雜交方法、氧化劑和氧化還原反應(yīng)方法、氧化還原反應(yīng)的檢測(cè)、和實(shí)施這些方法適用的裝置均給出于上文A-K中。M.在鳥(niǎo)嘌呤背景信號(hào)存在下檢測(cè)預(yù)選堿基甚至存在由鳥(niǎo)嘌呤的氧化而產(chǎn)生的背景信號(hào)時(shí),也可檢測(cè)寡核苷酸探針中預(yù)選堿基的存在。因?yàn)閷?duì)錯(cuò)配的檢測(cè)依賴于在四種天然堿基(A、T/U、C和G)存在下檢測(cè)寡核苷酸探針中預(yù)選堿基的能力。因此,預(yù)選堿基必須比其它四種堿基被氧化得更為迅速。
本發(fā)明提供寡核苷酸探針,它適用于在鳥(niǎo)嘌呤背景信號(hào)存在下電化學(xué)檢測(cè)預(yù)選堿基。該寡核苷酸探針可以包括上文B節(jié)中給出的任意寡核苷酸探針,其中寡核苷酸探針中至少一個(gè)嘌呤堿基是式I的嘌呤取代基
寡核苷酸探針可含所需數(shù)量(例如l、2或3個(gè)至5、10或15個(gè)或更多個(gè))上式的堿基,這取決于其預(yù)期的結(jié)合配對(duì)物。這類寡核苷酸探針的具體實(shí)例和適用于其制備的核苷酸,是式II的化合物
其中R1表示HO-P(O)(OH)-O-、核苷酸、或寡核苷酸;R2表示-H、核苷酸或寡核苷酸;R3表示-H、-OH、鹵素(如氟、氯),烷氧基(如C1-C4烷氧基例如甲氧基或乙氧基),氨基,或疊氮基;和R4表示-O-或-CH2-。
與上述式I和II中所述相關(guān)的寡核苷酸探針依已知技術(shù)制備,按下文提出的實(shí)施例修飾,本領(lǐng)域技術(shù)人員易于懂得這些。
在式II化合物一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中,R1表示HO-P(O)(OH)-O-。在式I化合物另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中,R表示-H。當(dāng)R1表示核苷酸或寡核苷酸時(shí),磷酸二酯鍵連到3′端。當(dāng)R2表示核苷酸或寡核苷酸時(shí),則磷酸二酯鍵連到5′端。
式I的化合物有益地作為堿基被包括于寡核苷酸探針中,后者可用于本發(fā)明的方法中,如上文A-M節(jié)中所述。寡核苷酸探針當(dāng)然可包括多個(gè)堿基,但當(dāng)寡核苷酸探針用于在背景鳥(niǎo)嘌呤存在下檢測(cè)預(yù)選堿基時(shí),它至少應(yīng)包括一個(gè)式I的堿基。寡核苷酸探針長(zhǎng)度可以是5、10、50或高達(dá)100個(gè)堿基對(duì)。式II化合物的一個(gè)具體實(shí)例是6-巰基鳥(niǎo)苷5′-一磷酸(6-S-GMP)。N.電極結(jié)構(gòu)適用于依上述方法進(jìn)行電化學(xué)檢測(cè)核酸中預(yù)選堿基的電極包括(a)導(dǎo)電基材,其上形成工作表面;和(b)與工作表面連接的聚合物層。聚合物層是結(jié)合核酸(例如通過(guò)疏水作用或其它任何合適的結(jié)合方法)且對(duì)于過(guò)渡金屬配合物呈多孔性的(即過(guò)渡金屬配合物能遷移入與聚合物結(jié)合的核酸)的一層物質(zhì)。導(dǎo)電基材可以是金屬基材或非金屬基材,包括半導(dǎo)體基材(例如金、玻璃態(tài)碳、銦摻雜的氧化錫等等)。導(dǎo)電基材可呈任何物理形式,例如其一端形成工作面的細(xì)長(zhǎng)探頭,或其一面形成工作面的扁平薄片。聚合物層可通過(guò)任意方式與工作面連接,例如通過(guò)將聚合物層夾到工作面上,將聚合物溶液蒸發(fā)到電極上,或電聚合。聚合物實(shí)例包括但不限于尼龍、硝酸纖維素、聚苯乙烯和聚乙烯基吡啶。對(duì)聚合物層厚度沒(méi)有嚴(yán)格要求,可以從100埃()到1、10或甚至100微米。電極基本上可用于上文A-M節(jié)中所述所有方法中。因此,一般地,本發(fā)明提供檢測(cè)核酸的方法,所述核酸至少含一個(gè)預(yù)選堿基,該方法包括(a)將含所述核酸的樣品與電極接觸,該電極包括其上形成工作表面的導(dǎo)電基材和與工作表面連接的上述聚合物層;(b)使核酸與能在氧化還原反應(yīng)中氧化預(yù)選堿基的過(guò)渡金屬配合物反應(yīng);(c)通過(guò)測(cè)量流過(guò)所述電極的電流檢測(cè)該氧化還原反應(yīng);和(d)從預(yù)選堿基上檢測(cè)的氧化還原反應(yīng)確定是否存在核酸。O.微電子裝置上述技術(shù)的一個(gè)優(yōu)勢(shì)在于它們可用微電子裝置來(lái)實(shí)施。適用于上述方法中電化學(xué)檢測(cè)核酸物質(zhì)的微電子裝置包括具有第一和第二個(gè)相對(duì)面的微電子基材;第一個(gè)面上的導(dǎo)電電極;和固定于第一個(gè)面與導(dǎo)電電極毗鄰的寡核苷酸捕捉探針。該捕捉探針被間隔成充分靠近毗鄰的電極(例如從約0.1、1、或2μ至高達(dá)約50、100、500或甚至1000μ)使得在該探針上發(fā)生、或在與該探針雜交的靶核酸上發(fā)生的氧化還原反應(yīng)在毗鄰電極上被檢測(cè)出。
在圖9和圖10中所示的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中,微電子裝置20在其第一個(gè)相對(duì)面上有許多獨(dú)立的電極21,且許多個(gè)獨(dú)立的寡核苷酸捕捉探針22被固定于毗鄰每個(gè)獨(dú)立的電極處。通過(guò)提供許多個(gè)互不相同的獨(dú)立的寡核苷酸探針,它們各自具有一個(gè)相聯(lián)電極,從而提供一個(gè)小型裝置,它能檢測(cè)許多不同的雜交作用。每個(gè)電極與一個(gè)合適的觸頭23電連接使得裝置可裝上導(dǎo)線或者有效地與必要的電子儀器聯(lián)系以進(jìn)行文中所述方法的檢測(cè)和確定步驟。
核酸可由已知技術(shù)選擇性地固定在微電子基材的適當(dāng)部位。例如參見(jiàn)授予Pirrung等人的美國(guó)專利No.5,405,783。該微電子基材可以是半導(dǎo)體(例如硅)或能用慣常的微電子技術(shù)加工的非半導(dǎo)體材料(如玻璃)。電極可以是金屬或非金屬導(dǎo)電材料如多晶硅??蓱?yīng)用慣常的微電子加工方法如淀積蝕刻而形成電極。有許多合適的微電子結(jié)構(gòu)和制作方法都是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的。例如參見(jiàn)S.M.Sze,VLSI Technology(1983);S.K.Ghandhi,VLSI FabricationPrinciples(1983)。
提出下述實(shí)施例以闡述本發(fā)明,但不應(yīng)認(rèn)為是限制本發(fā)明。在這些實(shí)施例中,cm2/s表示每秒平方厘米數(shù),M表示摩爾濃度,M-1s-1表示每摩爾每秒,eV表示電子伏特,V表示伏特,nm表示毫微米,GMP表示鳥(niǎo)苷5′-一磷酸,而ITO表示錫摻雜的氧化銦電極。依已知技術(shù)應(yīng)用273A型EG+G Princeton Applied Research Poten-tiostat/Galvanostat采集循環(huán)伏安圖。ITO工作電極由ITO-涂敷的堿石灰玻璃片制備,部件號(hào)(part number)CH-50IN-1514,得自Delta Technologies,Ltd,13960 North 47th Street,Stillwater,Min-nesota 55082-1234 USA。尼龍膜為HYBOND-N+nylon mem-brane,目錄號(hào)RPN 1210B,得自Amersham Corp,2636 ClearbrookDrive,Arlington Heights,IL 60005 USA。
實(shí)施例1測(cè)定Ru(bpy)32+的循環(huán)伏安圖有和無(wú)小牛胸腺DNA時(shí)Ru(bpy)32+的循環(huán)伏安圖如圖1所示,在一次伏安掃描期間觀測(cè)到催化增強(qiáng)作用,是由金屬配合物的氧化形式多次氧化DNA而產(chǎn)生的。任何DNA-結(jié)合的氧化還原配對(duì)物的伏安法必須按與結(jié)合形式和未結(jié)合形式相關(guān)的正方形圖來(lái)分析,因?yàn)镈NA的擴(kuò)散系數(shù)(例如2.0×10-7cm2/s)大大小于金屬配合物(8.0×10-6cm2/s)。該現(xiàn)象通常導(dǎo)致結(jié)合形式電流的急劇減??;然而,在足夠高的離子強(qiáng)度([Na+]=0.8M)下,金屬配合物的結(jié)合太弱而不能影響電流響應(yīng)。此時(shí),可依簡(jiǎn)單的EC′機(jī)理分析電流。
(E)(C)實(shí)施例2循環(huán)伏安圖的分析循環(huán)伏安圖的分析為應(yīng)用DIGISIMTM數(shù)據(jù)分析包,通過(guò)擬合去掉背景的、完整的電流-電勢(shì)曲線而進(jìn)行。對(duì)于金屬配合物的輸入?yún)?shù)為E1/2,對(duì)于金屬配合物和DNA為擴(kuò)散系數(shù),它們均在單獨(dú)實(shí)驗(yàn)中測(cè)定。因此,得自該擬合的唯一參數(shù)是方程2的二級(jí)速率常數(shù),k=9.0×103M-1s-1。在寬范圍的掃描速率下測(cè)定了該同樣的速率常數(shù)。
Ru(bpy)33+氧化DNA的速率常數(shù)在兩個(gè)獨(dú)立的實(shí)驗(yàn)中得到證實(shí)。首先,通過(guò)用COOLTM算法擬合將方波伏安圖用于獲得方程2的準(zhǔn)一級(jí)kobs。該COOLTM算法應(yīng)用明顯不同于DIGISIMTM的擬合方法;然而,kobs對(duì)DNA作圖呈線性且給出二級(jí)速率常數(shù)k=8.2×10M3s-1,它與用DIGISIMTM擬合循環(huán)伏安圖得到的速率常數(shù)相符。其次,制備正式的Ru(bpy)33+樣品,并與DNA直接在快速掃描停留中反應(yīng)。對(duì)于時(shí)間相關(guān)譜圖在350~600nm之間的綜合分析表明,Ru(bpy)33+已全部轉(zhuǎn)變成Ru(bpy)32-而沒(méi)有中間體產(chǎn)物,且速率常數(shù)為12×103M-1s-1。這樣,通過(guò)兩種獨(dú)立的電化學(xué)測(cè)量法和一種擬合完整的可見(jiàn)光譜的非電化學(xué)停留技術(shù)有力地確定了Ru(bpy)33+氧化DNA的速率常數(shù),所述兩個(gè)電化學(xué)測(cè)量法應(yīng)用很不同的擬合方案。
實(shí)施例3循環(huán)伏安圖的分析如果電子傳遞的驅(qū)動(dòng)力顯著小于重組能(λ),則RTlnk對(duì)驅(qū)動(dòng)力的曲線(當(dāng)對(duì)與反應(yīng)物近似處理相關(guān)的工作項(xiàng)作修正后)應(yīng)得斜率為1/2的直線。由一些具有不同氧化還原電勢(shì)的金屬(bpy)33+衍生物氧化DNA的速率常數(shù)示于下文表1中。
由于Marcus理論描述了與驅(qū)動(dòng)力相關(guān)的電子傳遞速率,所以可依如下方程分析絕對(duì)速率常數(shù)k=vexp[-β(r-r0)]exp[-(ΔG+λ)2/4λRT]其中v表示擴(kuò)散控制極限(1011M-1s-1)內(nèi)的速率常數(shù),r表示活化復(fù)合體中反應(yīng)物與產(chǎn)物間的距離,r0表示反應(yīng)物和產(chǎn)物的最近近似距離,而β描述了間插介質(zhì)的影響。在雙螺旋內(nèi)部摻入鳥(niǎo)嘌呤供體便施加一段有限距離,電子必須穿過(guò)它經(jīng)隧道至結(jié)合的金屬配合物,即r≠r0。然而,如果將鳥(niǎo)苷5′-一磷酸(GMP)用作電子供體,則鳥(niǎo)嘌呤可與金屬配合物直接碰撞(r=r0)。至于Fe(py)33+和GMP,停留法測(cè)得速率常數(shù)為2.6×103M-1s-1。已知相關(guān)反應(yīng)的λ值處于1~1.5eV范圍內(nèi),它給出鳥(niǎo)嘌呤+/0偶聯(lián)物的ΔG為1.1±0.1V。表1.Ru(bpy)32+氧化DNA寡聚體中鳥(niǎo)嘌呤的速率常數(shù)
a測(cè)定速率常數(shù)用的DNA濃度都基于鳥(niǎo)嘌呤核苷酸的摩爾數(shù)。
b估測(cè)的穿過(guò)溶劑的隧道距離,依k/kss=exp[-βΔr]計(jì)算的距離,其中β(H2O)=3-1且kss=1.8×105M-1s-1。c由于速率常數(shù)與鳥(niǎo)嘌呤濃度有關(guān),所以觀測(cè)的GG錯(cuò)配速率業(yè)已相對(duì)于含單個(gè)鳥(niǎo)嘌呤的其它寡聚體歸一化。
圖2示出存在作為單鏈的5′-AAATATAGTATAAAA時(shí)(C)以及與其互補(bǔ)鏈雜交時(shí)(A),Ru(bpy)32+的循環(huán)伏安圖。至于GMP,單鏈r=r0,且由速率常數(shù)1.8×105M-1s-1給定ΔG(鳥(niǎo)嘌呤+/0)=1.1V和λ=1.3eV,它們與得自GMP氧化的值相符。雖然單鏈有急劇增強(qiáng),但該掃描速率下對(duì)于充分雜交的雙鏈體只觀測(cè)到很小的增強(qiáng),導(dǎo)致雜交時(shí)電流減小四倍。已知諸如Ru(bpy)32+的金屬配合物在小溝內(nèi)與DNA結(jié)合,所以氧化該雙鏈體降低150倍的速率常數(shù)(1.2×103M-1s-1)必定是由鳥(niǎo)嘌呤殘基和表面結(jié)合的配合物之間的距離引起的。當(dāng)該金屬配合物??坑谛蟽?nèi)時(shí),鳥(niǎo)嘌呤與該金屬配合物不能緊密接觸,且電子必須經(jīng)隧道穿過(guò)使鳥(niǎo)嘌呤殘基與該金屬配合物分離的溶劑。經(jīng)隧道穿過(guò)水的效果遠(yuǎn)低于穿過(guò)非極性介質(zhì),據(jù)估測(cè)水的β值約為3-1。因而隧道距離可依下式計(jì)算
k/kss=exp(-βΔr)其中Δr表示與單鏈相比雙鏈體中的距離變化。該分析時(shí),充分雜交的雙鏈體Δr為1.7。
水的大β值啟示,隧道距離的很小變化將引起電子傳送速率常數(shù)的顯著變化,它反過(guò)來(lái)又反映DNA結(jié)構(gòu)中的小微擾。也如圖2所示,當(dāng)存在相同的雙鏈體(其中GC堿基對(duì)已由GA錯(cuò)配置換)時(shí)Ru(bpy)32+的伏安圖。GA錯(cuò)配的摻入導(dǎo)致與正式雙鏈體相比原電流增強(qiáng)2倍,這又轉(zhuǎn)變?yōu)樗俾食?shù)變化16倍(kGA=1.9×104M-1s-1)。對(duì)于單鏈、充分雜交的雙鏈體和所有三個(gè)GX錯(cuò)配,速率數(shù)據(jù)均列于表1。還示出相對(duì)于單鏈的隧道距離Δr計(jì)算值。正如預(yù)計(jì)的那樣,G-嘌呤錯(cuò)配中的鳥(niǎo)嘌呤殘基對(duì)金屬配合物的可及性比GT錯(cuò)配中更大,GT錯(cuò)配中兩個(gè)堿基仍然由擺動(dòng)對(duì)中的兩個(gè)氫鍵連接。然而,GT錯(cuò)配仍然引起速率常數(shù)變化四倍,它易于檢測(cè)。因此,氧化速率常數(shù)依如下趨勢(shì)G(單鏈)>GA>GG>GT>GC。把各種錯(cuò)配彼此區(qū)分開(kāi)的能力為雜交的錯(cuò)配敏感性檢測(cè)奠定基礎(chǔ),它甚至對(duì)毗鄰預(yù)選堿基的堿基對(duì)處單堿基對(duì)錯(cuò)配也敏感。
實(shí)施例4避免在探針鏈中氧化的修飾堿基以肌苷代替鳥(niǎo)嘌呤應(yīng)用銦錫氧化物(ITO)工作電極(面積=0.32cm2)、Pt絲對(duì)電極和Ag/AgCl參比電極來(lái)收集循環(huán)伏安圖。在圖5中,含25μMRu(bpy)32+和75μM寡核苷酸的樣品被溶于50mM磷酸鈉緩中劑(pH=7)和0.70M NaCl,在25mV/s下掃描。在圖6中,含50μMRu(bpy)32+和0.3mM 5′-GMP或5′-IMP的樣品被溶于含700mMNaCl和50mM磷酸鈉緩沖劑(pH=6.8,[Na+]=780mM)的緩沖水溶液,在2.5mV/s下從0.0V至1.4V掃描。對(duì)于不存在Ru(bpy)32+時(shí)單核苷酸的掃描未顯示明顯的氧化電流。新清潔的ITO電極被用于每次試驗(yàn),且對(duì)緩沖液?jiǎn)为?dú)的背景掃描從后續(xù)的掃描中扣除。二級(jí)鳥(niǎo)嘌呤氧化速率常數(shù)的測(cè)定是應(yīng)用DIGISIMTM軟件程序包依兩步法原理擬合循環(huán)伏安數(shù)據(jù)而進(jìn)行的。除氧化速率之外的所有參數(shù)均是從同一個(gè)電極上單獨(dú)的金屬配合物伏安圖測(cè)定的。5′-GMP購(gòu)自Sigma,而5′-IMP購(gòu)自U.S.Biochemical,均未進(jìn)一步純化而直接應(yīng)用。寡核苷酸是在the UNC Department of Pathology制備的,并通過(guò)3000分子量截止濾器以除去單核苷酸。由反相HPLC檢定純度。濃度依Fasman,G.D.CRC Handbook of Bio-chemistry and Molecular Biology;CRC Press,Boca Raton,F(xiàn)L,1975;Vol.1中所述由260nm處的吸光度而測(cè)得。圖5中的雜交體是通過(guò)在90℃下加熱互補(bǔ)鏈達(dá)5min然后緩慢冷卻2h至25℃而制備的。
這些數(shù)據(jù)啟示,肌苷可代替探針鏈中的鳥(niǎo)嘌呤以提供氧化還原惰性探針鏈。
實(shí)施例5避免在探針鏈中氧化的修飾堿基7-脫氮-鳥(niǎo)嘌呤大致依上述實(shí)施例4中同樣方法進(jìn)行該實(shí)施例,只是將7-脫氮-鳥(niǎo)嘌呤用作修飾的堿基代替鳥(niǎo)嘌呤以提供氧化還原惰性的探針鏈。
7-脫氮-鳥(niǎo)嘌呤被氧化的速率只有103M-1s-1,它比鳥(niǎo)嘌呤小兩個(gè)數(shù)量級(jí),并足夠緩慢以提供氧化還原惰性的探針鏈。
實(shí)施例6應(yīng)用與附在ITO電極上的尼龍膜結(jié)合的小牛胸腺DNA的檢測(cè)將尼龍膜裁成環(huán)形,直徑約為6mm以適合電化學(xué)元件并覆蓋浸入溶液中的ITO電極部分。
對(duì)于只獲得金屬配合物的循環(huán)伏安圖的實(shí)驗(yàn),先用緩沖液使ITO電極適應(yīng)試驗(yàn)環(huán)境。再將尼龍片(無(wú)DNA)插入電化學(xué)元件,并用移液管吸取200μL的200μM金屬配合物溶液置于該元件內(nèi)。對(duì)于Os(bpy)32+試驗(yàn),在電化學(xué)分析之前先平衡6分鐘。至于Ru(bpy)32+試驗(yàn),在電化學(xué)分析之前先平衡15分鐘。應(yīng)用PAR273A穩(wěn)壓器在25mV/s的掃描速率下采集循環(huán)伏安圖。
至于DNA試驗(yàn),當(dāng)ITO電極適應(yīng)合適的緩沖液后,將DNA浸泡的尼龍片插入電化學(xué)元件。將200μL 200μM金屬配合物的合適的緩沖劑溶液吸移入該元件,在合適的平衡時(shí)間(對(duì)于Os(bpy))32+為6分鐘,而對(duì)于Ru(bpy))32+為15分鐘)之后,在25mV/s的掃描速率下記錄循環(huán)伏安圖。尼龍片均在5.8mM小牛胸腺DNA水溶液中浸泡約5分鐘。研究了從5分鐘至18小時(shí)范圍內(nèi)不同的浸泡時(shí)間。DNA快速(在數(shù)分鐘內(nèi))與尼龍膜結(jié)合,通常采用這么短的浸泡時(shí)間。在低含鹽量條件下,應(yīng)用50mM磷酸鈉緩沖液(pH=6.8,[Na+]=80mM)。在高含鹽量條件下,應(yīng)用50mM磷酸鈉緩沖劑和700mM NaCl(pH6.8,[Na+]=780mM)溶液。
Ru(bpy)32+在尼龍-ITO電極上的循環(huán)伏安圖示于圖11。短劃線示出尼龍膜先在小牛胸腺DNA中浸泡再附在電極上這種情況的伏安圖。對(duì)于DNA標(biāo)記膜,出現(xiàn)平行于溶液中觀測(cè)到的電流的強(qiáng)催化電流。實(shí)驗(yàn)表明Ru(bpy)32+在尼龍膜內(nèi)自由擴(kuò)散,且不需要DNA擴(kuò)散來(lái)實(shí)現(xiàn)催化電流。圖11也示出在更低鹽濃度觀測(cè)到更強(qiáng)的催化電流,是由于介體與固定化DNA之間的相互作用增強(qiáng)的緣故。
圖12A示出用Os(bpy)32+作介體的同樣試驗(yàn)。該鋨配合物不氧化鳥(niǎo)嘌呤,所以在鳥(niǎo)嘌呤的存在下觀測(cè)到電流的任何增強(qiáng)必將起因于DNA結(jié)合引起的介體預(yù)濃縮。事實(shí)上,尼龍電極上存在DNA時(shí)Os(bpy)32+的電流弱于沒(méi)有DNA時(shí)的電流。實(shí)驗(yàn)表明,當(dāng)DNA結(jié)合在尼龍電極上時(shí)對(duì)于Ru(bpy)32+來(lái)說(shuō)電流的增大只是由于專有的催化反應(yīng)而不是由于微小的結(jié)合差異。鹽濃度的影向示于圖12B,發(fā)現(xiàn)與對(duì)催化反應(yīng)觀測(cè)到的巨大鹽效應(yīng)相比是小的。
通過(guò)將DNA與附著在ITO電極上的尼龍膜結(jié)合,我們闡述了甚至在DNA不擴(kuò)散而介體擴(kuò)散的實(shí)施方案中也可檢測(cè)DNA。該發(fā)現(xiàn)使得當(dāng)固定化探針與電極充分接近時(shí)可檢測(cè)DNA,其中探針與電極充分接近使探針-靶雜交體存留于介體的擴(kuò)散層內(nèi)。
實(shí)施例7檢測(cè)與附在ITO電極上的尼龍膜結(jié)合的RNA
依實(shí)施例6中所述方法進(jìn)行該試驗(yàn),只是應(yīng)用得自Bakers Yeast(購(gòu)自Sigma)的tRNA代替小牛胸腺DNA。依實(shí)施例6中所述那樣將尼龍膜片浸泡于tRNA溶液。
在Ru(bpy)32+存在下的循環(huán)伏安圖示于圖13。就DNA來(lái)說(shuō),對(duì)兩種緩沖液觀測(cè)的催化電流在低含鹽量下更強(qiáng)。在高和低鹽濃度下觀測(cè)到電流的差異沒(méi)有實(shí)施例6中對(duì)DNA所觀測(cè)到的那樣顯著,是由于tRNA與陽(yáng)離子結(jié)合得不如DNA那樣好,因而鹽效應(yīng)較不明顯。
圖13中的結(jié)果表明,可依與DNA同樣方法檢測(cè)RNA,這是由于RNA和DNA都含鳥(niǎo)嘌呤。所以糖-磷酸酯主鏈的化學(xué)組成不影響催化電流?;谠擁?xiàng)觀測(cè),可以檢測(cè)單鏈和雙鏈DNA和RNA,DNA-RNA雜交體,和含其它修飾主鏈的單鏈或雙鏈體例如PNA’s、碳環(huán)、硫代膦酸酯或其它取代的核糖鍵。
實(shí)施例8檢測(cè)RNA至于定量檢測(cè)RNA,將DNA(或RNA、PNA、或其它備擇主鍵)探針固定于固相支持體上。該探針可通過(guò)以肌苷或7-脫氮-鳥(niǎo)嘌呤代替探針鏈中的鳥(niǎo)嘌呤而被修飾成氧化還原惰性的。然后將固定化探針與靶RNA(例如得自HIV或丙型肝炎)的溶液接觸。于是固體表面含與RNA鏈雜交的氧化還原惰性、固定化探針。再將固體表面與Ru(bpy)32+溶液接觸,并測(cè)定介體的循環(huán)伏安圖。催化電流標(biāo)志雜交作用,而電流量被用于定量分析結(jié)合的RNA鏈,它基于鏈中已知鳥(niǎo)嘌呤數(shù)。
至于RNA的錯(cuò)配檢測(cè),將DNA(或RNA、PNA、或其它備擇物)探針固定于固體表面。探針鏈中的預(yù)選堿基比其它堿基更易于氧化。將該表面先與靶RNA的溶液接觸,再與Ru(bpy)32+或其它介體的溶液接觸。然后按DNA的同樣方法測(cè)定預(yù)選堿基上的雜交程度(完全配對(duì)、未配對(duì)、或錯(cuò)配)。
實(shí)施例9檢測(cè)堿基的預(yù)選序列依實(shí)施例3中所述實(shí)施本方法。圖14中給出的循環(huán)伏安圖表明有關(guān)5′-G的電流遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于5′-GG的,后者又遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于5′-GGG的。對(duì)于含GG和GGG序列的單鏈和雙鏈體均觀測(cè)到電流的極大增強(qiáng)。該電流增強(qiáng)并不僅僅由于G數(shù)目的增多,因?yàn)槿鐖D15所示,如果G都被分散,向同一鏈上增加G所造成的電流升高要低得多。因?yàn)镚GG的5′-G比單個(gè)的G更易于氧化,所以有可能選擇能氧化GGG而不是G的介體(具有更小的氧化還原電勢(shì))。
Ru(4,4′-二甲基-二吡啶)32+的循環(huán)伏安圖示于圖16,同時(shí)伴隨在單個(gè)G寡核苷酸和GGG寡核苷酸存在下的重復(fù)掃描。如圖所示,只有GGG寡核苷酸存在時(shí)才觀測(cè)到催化電流。該實(shí)施例示出了調(diào)節(jié)介體電勢(shì)使得更易于被氧化的序列在背景鳥(niǎo)嘌呤存在下可被檢測(cè)的能力。該方法可用于檢測(cè)單個(gè)的合成堿基,該堿基被衍化使之比鳥(niǎo)嘌呤更易被氧化。
該實(shí)驗(yàn)表明,有可能降低介體電勢(shì)并仍能鑒定更易于氧化的堿基或堿基序列。
實(shí)施例10在背景天然鳥(niǎo)嘌呤存在下檢測(cè)預(yù)選鳥(niǎo)嘌呤衍生物6-巰基鳥(niǎo)苷5′-一磷酸的二鈉鹽(6-S-GMP)
由可商購(gòu)的6-巰基鳥(niǎo)苷(得自Sigma)磷酸化而制備。應(yīng)用POCl3依M.Yoshikawa等人,Bull.Chem.Soc.Jpn.423505(1969)的方法進(jìn)行磷酸化。在伏安法分析之前,先用HPLC純化6-S-GMP的二鈉鹽。如肌苷5′-一磷酸實(shí)施例中一樣,在高的離子強(qiáng)度下完成循環(huán)伏安圖。工作電極是ITO電極,其表面附上Hybond N+尼龍膜以防止6-S-GMP的直接氧化。對(duì)電極是Pt絲。參比電極是Ag/AgCl。掃描速率為25mV/s。
循環(huán)伏安結(jié)果如圖17中所示,其中曲線A示出單獨(dú)的Ru(4,4′-Me2-bpy)32+(4,4′-Me2-bpy=4,4′-二甲基-2,2′-二吡啶)。加入5′-GMP時(shí),未觀測(cè)到Ru(Me2bpy)32+波的增強(qiáng);然而,加入6-巰基鳥(niǎo)苷5′-一磷酸(6-S-GMP)導(dǎo)致電流顯著增強(qiáng)(曲線B)。5′-GMP存在下的峰電流與曲線A中相同。該數(shù)據(jù)表明,有可能在背景天然鳥(niǎo)嘌呤存在下檢測(cè)6-巰基鳥(niǎo)嘌呤。
實(shí)施例11檢測(cè)與靶鏈上預(yù)選堿基的DNA雜交將尼龍膜(Hybond N+,Amersham,480-600μg/cm2)割成直徑約為6mm的環(huán)形。將尼龍片置于聚胞苷酸(可得自Sigma)在水中的濃溶液浸泡1小時(shí)。然后從聚胞苷酸(poly[C])溶液中取出尼龍片,并放在石蠟?zāi)ど蠜龈伞kS著這些片變干,將另外15μL poly[C]溶液分成三個(gè)5μL等分樣加至膜上。讓這些片完全干燥。再將已干尼龍片在低含鹽量的緩沖液(50mM磷酸鈉,pH=6.8,[Na+]=80mM)中洗滌以除去浸泡期間未強(qiáng)烈結(jié)合的任何poly[C]。
作為對(duì)照試驗(yàn),在模擬雜交試驗(yàn)時(shí)只用poly[C]浸漬的尼龍片,其間該片未與另外的核酸接觸,但經(jīng)歷其它所有雜交步驟。將該片置于400μL milli-Q水中,于48℃下加熱1小時(shí),再讓其冷卻至室溫。從水中取出該片,在電化學(xué)分析之前先用低含鹽量的緩中液洗滌。以這種方式制備的這些片代表圖18和19中的背景掃描(A)。
將poly[C]浸漬過(guò)的片置于400μL聚鳥(niǎo)苷酸(可得自Sigma)水溶液,在48℃下加熱1小時(shí),再讓其冷卻至室溫。然后從聚鳥(niǎo)苷酸(poly[G])溶液中取出該片,在電化學(xué)分析之前先用低含鹽量的緩沖液洗滌。
加熱小牛胸腺DNA(可得自Sigma)水溶液至90℃達(dá)10分鐘而使之變性(熔化)。將poly[C]浸漬過(guò)的尼龍片置于已變性的小牛胸腺DNA溶液,加熱至48℃達(dá)1小時(shí),再讓其冷卻至室溫。從小牛胸腺DNA溶液中取出該片,在電化學(xué)分析之前先用低含鹽量的緩中液洗滌。作為對(duì)照,使未用poly[C]浸泡的尼龍片也經(jīng)歷同樣的處理過(guò)程。在對(duì)照膜中觀測(cè)到通過(guò)吸附到尼龍膜上(而不是通過(guò)雜交)進(jìn)行的小牛胸腺DNA的結(jié)合和檢測(cè)。
當(dāng)用低含鹽量緩沖液使ITO電極適應(yīng)之后,將經(jīng)上述處理的尼龍片插入電化學(xué)元件。用移液管移取200μL 200μM Ru(bpy)32+溶液置于該元件內(nèi),平衡15分鐘后記錄循環(huán)伏安圖。掃描速率為25mV/sec。
循環(huán)伏安圖如圖18所示。探針序列poly[C]被固定在HybondN+尼龍膜上,并在緩沖液中實(shí)施雜交方案(“模擬雜交”)。將該膜附著在ITO工作電極上,并觀測(cè)Ru(bpy)32+的循環(huán)伏安圖(A)。將膜浸入poly[G]溶液,并依同樣方案進(jìn)行雜交。再測(cè)定Ru(bpy)32+的循環(huán)伏安圖(B),得到大的電流增強(qiáng)效果,這是由于雜交poly[G]靶的催化氧化的緣故。如圖19所示,該分析法對(duì)合適的序列是專一的。圖19中比較了poly[C]膜的伏安測(cè)量法,其中雜交過(guò)程在緩中液(A)或在單鏈小牛胸腺DNA溶液(B)中進(jìn)行。圖19表明,如果不存在靶序列,則得不到電流增強(qiáng)效果。
實(shí)施例12檢測(cè)尼龍修飾玻璃態(tài)碳電極上的DNA圖20示出玻璃態(tài)碳電極的循環(huán)伏安圖(或“CV”),尼龍膜附在該電極上是先于(A)和后于(B)DNA在尼龍膜上的固定化。
將尼龍膜(Zeta-Probe,Bio-Rad,80-100μg/cm2)裁成直徑約為5mm的環(huán)狀。用制成的尼龍片覆蓋玻璃態(tài)碳電極表面并由塑料套固定在適當(dāng)位置。至于只獲得金屬配合物的CV的試驗(yàn),先用低含鹽量、50mM磷酸鈉緩沖液(pH=6.8,[Na+]=80mM)使玻璃態(tài)碳電極適應(yīng)。再將尼龍片(無(wú)DNA)附著在電極上,并用移液管移取400μL 200μM Ru(bpy)32+溶液置于該電化學(xué)元件中。在電化學(xué)分析之前先平衡15分鐘。應(yīng)用PAR 273A穩(wěn)壓器在25mV/s的掃描速率下采集循環(huán)伏安圖。在典型的DNA試驗(yàn)中,先用低含鹽量的磷酸鈉緩沖液使玻璃態(tài)碳電極適應(yīng)。將尼龍片置于5.8mM小牛胸腺DNA水溶液中浸泡約5分鐘。然后從溶液中取出該片,放在玻璃態(tài)碳電極上用套固定在適當(dāng)位置。用移液管移取400μL 200μMRu(bpy)32+置于電化學(xué)元件中,平衡15分鐘后在25mV/s的掃描速率下記錄循環(huán)伏安圖。
上文對(duì)本發(fā)明的闡述不能認(rèn)為是限制它。本發(fā)明由下列權(quán)利要求來(lái)限定,權(quán)利要求的等同內(nèi)容也包括在內(nèi)。
權(quán)利要求
1.檢測(cè)DNA雜交的方法,它包括(a)將DNA樣品與寡核苷酸探針接觸而形成雜交的DNA;(b)使雜交的DNA與能在氧化還原反應(yīng)中氧化所述寡核苷酸探針中預(yù)選堿基的過(guò)渡金屬配合物反應(yīng),該寡核苷酸探針至少具有一個(gè)所述預(yù)選堿基;(c)檢測(cè)該氧化還原反應(yīng);(d)通過(guò)預(yù)選堿基上檢測(cè)的氧化還原反應(yīng)確定是否存在雜交的DNA。
2.權(quán)利要求1的方法,其中所述確定步驟進(jìn)一步包括(i)測(cè)定所述檢測(cè)的氧化還原反應(yīng)的反應(yīng)速率,(ii)將測(cè)得的反應(yīng)速率和該過(guò)渡金屬配合物與單鏈DNA的氧化還原反應(yīng)速率進(jìn)行比較;然后(iii)確定測(cè)得的反應(yīng)速率是否與該過(guò)渡金屬配合物同單鏈DNA的氧化還原反應(yīng)速率基本相同。
3.權(quán)利要求1的方法,其中所述DNA樣品是單鏈DNA樣品,而所述雜交的DNA是雙鏈體。
4.權(quán)利要求1的方法,其中所述寡核苷酸探針包括約4~約100個(gè)堿基。
5.權(quán)利要求1的方法,其中所述預(yù)選堿基是鳥(niǎo)嘌呤。
6.權(quán)利要求1的方法,其中所述預(yù)選堿基是腺嘌呤。
7.權(quán)利要求1的方法,其中所述過(guò)渡金屬配合物選自Ru(bpy)32+、Ru(Me2-bpy)32+、Ru(Me2-phen)32+、Fe(bpy)32+、Fe(5-Cl-phen)32+、Os(bpy)32+、Os(5-Cl-phen)32+和ReO2(py)41+。
8.權(quán)利要求1的方法,其中所述反應(yīng)步驟包括在足以實(shí)現(xiàn)選擇性氧化所述預(yù)選堿基的條件下使所述過(guò)渡金屬配合物與所述雜交DNA樣品反應(yīng)。
9.權(quán)利要求1的方法,它進(jìn)一步包括在所述接觸步驟之前擴(kuò)增所述雜交DNA的步驟。
10.權(quán)利要求9的方法,其中所述擴(kuò)增DNA樣品的步驟通過(guò)聚合酶鏈反應(yīng),鏈置換擴(kuò)增,連接酶鏈反應(yīng),或基于核酸序列的擴(kuò)增來(lái)進(jìn)行。
11.權(quán)利要求2的方法,其中所述測(cè)定氧化還原反應(yīng)的反應(yīng)速率的步驟包括測(cè)定該反應(yīng)的循環(huán)伏安圖。
12.權(quán)利要求2的方法,其中所述比較步驟包括將過(guò)渡金屬配合物與雜交DNA樣品的反應(yīng)的循環(huán)伏安圖和過(guò)渡金屬配合物與單鏈DNA的反應(yīng)的已知循環(huán)伏安圖進(jìn)行比較。
13.權(quán)利要求1的方法,其中所述寡核苷酸探針被固定在固體表面。
14.權(quán)利要求13的方法,其中所述過(guò)渡金屬配合物被固定于固體表面。
15.權(quán)利要求1的方法,它進(jìn)一步包括步驟(e)鑒定與所述預(yù)選堿基配對(duì)的堿基。
16.權(quán)利要求1的方法,它進(jìn)一步包括步驟(e)鑒定與毗鄰預(yù)選堿基的堿基配對(duì)的堿基。
17.權(quán)利要求15或16的方法,其中所述鑒定步驟進(jìn)一步包括(i)測(cè)定檢測(cè)的氧化還原反應(yīng)的反應(yīng)速率;(ii)將測(cè)得的反應(yīng)速率與四種不同的已知氧化還原反應(yīng)速率中的每一種進(jìn)行比較,其中的已知反應(yīng)速率是過(guò)渡金屬配合物與具有同預(yù)選堿基結(jié)合的腺嘌呤、胞嘧啶、鳥(niǎo)嘌呤或胸腺嘧啶的DNA的反應(yīng)速率;和(iii)確定所述已知的氧化還原反應(yīng)速率中哪一個(gè)與所述測(cè)得的反應(yīng)速率基本相同。
18.檢測(cè)DNA雜交的方法,它包括(a)將DNA樣品與寡核苷酸探針接觸而形成雜交的DNA;(b)使雜交的DNA與能在氧化還原反應(yīng)中氧化所述寡核苷酸探針中預(yù)選堿基的過(guò)渡金屬配合物反應(yīng),該寡核苷酸探針至少具有一個(gè)所述預(yù)選堿基;(c)檢測(cè)該氧化還原反應(yīng);(d)測(cè)定檢測(cè)的氧化還原反應(yīng)的反應(yīng)速率;(e)將測(cè)得的反應(yīng)速率和過(guò)渡金屬配合物同單鏈DNA的氧化還原反應(yīng)速率進(jìn)行比較;然后(f)確定測(cè)得的反應(yīng)速率是否與過(guò)渡金屬配合物同單鏈DNA的氧化還原反應(yīng)速率相同。
19.權(quán)利要求18的方法,其中所述預(yù)選堿基是鳥(niǎo)嘌呤。
20.權(quán)利要求18的方法,其中所述預(yù)選堿基是腺嘌呤。
21.權(quán)利要求18的方法,其中所述過(guò)渡金屬配合物選自Ru(bpy)32+、Ru(Me2-bpy)32+、Ru(Me2-phen)32+、Fe(bpy)33+、Fe(5-Cl-phen)33+、Os(bpy)32+、Os(5-Cl-phen)32+和ReO2(py)41+。
22.權(quán)利要求18的方法,其中所述反應(yīng)步驟包括在足以實(shí)現(xiàn)選擇性氧化所述預(yù)選堿基的條件下使所述過(guò)渡金屬配合物與所述DNA樣品接觸。
23.權(quán)利要求18的方法,它進(jìn)一步包括在所述反應(yīng)步驟之前擴(kuò)增所述DNA的步驟。
24.權(quán)利要求23的方法,其中所述擴(kuò)增雜交DNA的步驟通過(guò)聚合酶鏈反應(yīng),鏈置換擴(kuò)增,連接酶鏈反應(yīng),或基于核酸序列的擴(kuò)增來(lái)進(jìn)行。
25.權(quán)利要求18的方法,其中所述測(cè)定步驟包括測(cè)定所述反應(yīng)的循環(huán)伏安圖。
26.權(quán)利要求18的方法,其中所述比較步驟包括將過(guò)渡金屬配合物與雜交DNA樣品的反應(yīng)的循環(huán)伏安圖和過(guò)渡金屬配合物與單鏈DNA的反應(yīng)的已知循環(huán)伏安圖進(jìn)行比較。
27.權(quán)利要求18的方法,其中所述寡核苷酸探針被固定在固體表面。
28.權(quán)利要求27的方法,其中所述過(guò)渡金屬配合物被固定于所述固體表面。
29.權(quán)利要求18的方法,它進(jìn)一步包括步驟(g)鑒定與所述預(yù)選堿基配對(duì)的堿基。
30.權(quán)利要求29的方法,其中所述鑒定堿基的步驟(g)包括(i)將測(cè)得的反應(yīng)速率與四種不同的已知氧化還原反應(yīng)速率中的每一種進(jìn)行比較,其中的已知反應(yīng)速率是過(guò)渡金屬配合物與具有同預(yù)選堿基結(jié)合的腺嘌呤、胞嘧啶、鳥(niǎo)票呤或胸腺嘧啶的DNA的反應(yīng)速率;和(ii)確定所述已知的氧化還原反應(yīng)速率中哪一個(gè)與所述測(cè)得的反應(yīng)速率基本相同。
31.檢測(cè)DNA雜交的裝置,它包括(a)多個(gè)DNA樣品容器;(b)承載所述多個(gè)DNA樣品容器的樣品處理工具;(c)將所述寡核苷酸探針傳遞至每個(gè)所述DNA樣品容器的寡核苷酸探針遞送工具;(d)將所述過(guò)渡金屬配合物傳遞至多個(gè)DNA樣品容器中每一個(gè)的過(guò)渡金屬配合物遞送工具;和(e)檢測(cè)氧化還原反應(yīng)的氧化還原反應(yīng)檢測(cè)器。
32.權(quán)利要求31的裝置,它進(jìn)一步包括測(cè)定檢測(cè)的氧化還原反應(yīng)的氧化還原反應(yīng)速率的工具。
33.權(quán)利要求31的裝置,其中所述氧化還原反應(yīng)檢測(cè)器包括一個(gè)電極。
34.權(quán)利要求31的裝置,其中所述寡核苷酸探針遞送工具包括其上固定所述寡核苷酸探針的一個(gè)固體表面。
35.檢測(cè)DNA雜交的裝置,它包括(a)一個(gè)DNA樣品容器;(b)將多個(gè)寡核苷酸探針傳遞至所述DNA樣品容器的寡核苷酸探針遞送工具;(c)將所述過(guò)渡金屬配合物傳遞至該DNA樣品容器的過(guò)渡金屬配合物遞送工具;(d)檢測(cè)氧化還原反應(yīng)的氧化還原反應(yīng)檢測(cè)器。
36.權(quán)利要求35的裝置,它進(jìn)一步包括測(cè)定所述檢測(cè)的氧化還原反應(yīng)的氧化還原反應(yīng)速率的工具。
37.權(quán)利要求35的裝置,其中所述氧化還原反應(yīng)檢測(cè)器包括一個(gè)電極。
38.權(quán)利要求35的裝置,其中所述寡核苷酸探針遞送工具包括其上固定多個(gè)寡核苷酸探針的固體表面,其中所述寡核苷酸探針各不相同。
39.權(quán)利要求38的裝置,其中所述過(guò)渡金屬配合物遞送工具包括其上固定多個(gè)寡核苷酸探針和所述過(guò)渡金屬配合物的固體表面。
40.DNA測(cè)序的方法,該方法包括(a)將DNA樣品與寡核苷酸探針接觸以形成雜交的DNA,所述寡核苷酸探針包括具有獨(dú)特氧化速率的一個(gè)預(yù)選堿基;(b)使所述雜交DNA與能在氧化還原反應(yīng)中氧化所述寡核苷酸探針中預(yù)選堿基的過(guò)渡金屬配合物反應(yīng),所述寡核苷酸探針具有預(yù)定數(shù)量的預(yù)選堿基;(c)檢測(cè)所述氧化還原反應(yīng);(d)測(cè)定檢測(cè)的氧化還原反應(yīng)的反應(yīng)速率;和(e)鑒定與所述預(yù)選堿基配對(duì)的堿基。
41.權(quán)利要求40的方法,其中所述鑒定步驟包括(i)將測(cè)得的反應(yīng)速率與四種不同的已知氧化還原反應(yīng)速率中的每一種進(jìn)行比較,其中的已知反應(yīng)速率是過(guò)渡金屬配合物與具有同預(yù)選堿基結(jié)合的腺嘌呤、胞嘧啶、鳥(niǎo)嘌呤或胸腺嘧啶的DNA的反應(yīng)速率;和(ii)確定所述已知的氧化還原反應(yīng)速率中哪一個(gè)與所述測(cè)得的反應(yīng)速率基本相同。
42.權(quán)利要求40的方法,其中所述寡核苷酸探針進(jìn)一步包括具有獨(dú)特氧化速率的第二種預(yù)選堿基,其中所述第二種預(yù)選堿基的氧化速率不同于所述預(yù)選堿基的氧化速率。
43.權(quán)利要求42的方法,其中所述檢測(cè)步驟進(jìn)一步包括檢測(cè)過(guò)渡金屬配合物與所述第二種預(yù)選堿基的氧化還原反應(yīng);其中所述測(cè)定步驟進(jìn)一步包括測(cè)定檢測(cè)的過(guò)渡金屬配合物與第二種預(yù)選堿基的氧化還原反應(yīng)的反應(yīng)速率;以及其中所述的鑒定步驟進(jìn)一步包括鑒定與所述第二種預(yù)選堿基配對(duì)的堿基。
44.權(quán)利要求40的方法,它進(jìn)一步包括用足夠數(shù)量的在不同位點(diǎn)具有所述預(yù)選堿基的寡核苷酸探針重復(fù)(a)至(e)的步驟,以鑒定所述DNA樣品中每個(gè)堿基。
45.檢測(cè)RNA雜交的方法,它包括(a)將RNA樣品與寡核苷酸探針接觸而形成雜交的RNA;(b)使雜交的RNA與能在氧化還原反應(yīng)中氧化所述寡核苷酸探針中預(yù)選堿基的過(guò)渡金屬配合物反應(yīng),該寡核苷酸探針至少具有一個(gè)所述預(yù)選堿基;(c)檢測(cè)該氧化還原反應(yīng);(d)通過(guò)預(yù)選堿基上檢測(cè)的氧化還原反應(yīng)確定是否存在雜交的RNA。
46.權(quán)利要求45的方法,其中所述確定步驟進(jìn)一步包括(i)測(cè)定所述檢測(cè)的氧化還原反應(yīng)的反應(yīng)速率,(ii)將測(cè)得的反應(yīng)速率和該過(guò)渡金屬配合物與單鏈RNA的氧化還原反應(yīng)速率進(jìn)行比較;然后(iii)確定測(cè)得的反應(yīng)速率是否與該過(guò)渡金屬配合物同單鏈RNA的氧化還原反應(yīng)速率基本相同。
47.權(quán)利要求45的方法,其中所述RNA樣品是單鏈RNA樣品,而所述雜交的RNA是雙鏈體。
48.權(quán)利要求45的方法,其中所述寡核苷酸探針包括約4~約100個(gè)堿基。
49.權(quán)利要求45的方法,其中所述預(yù)選堿基是鳥(niǎo)嘌呤。
50.權(quán)利要求45的方法,其中所述預(yù)選堿基是腺嘌呤。
51.權(quán)利要求45的方法,其中所述過(guò)渡金屬配合物Ru(bpy)32+、Ru(Me2-bpy)32+、Ru(Me2-phen)32+、Fe(bpy)32+、Fe(5-Cl-phen)32+、Os(bpy)32+、Os(5-Cl-phen)32+和ReO2(py)41+。
52.權(quán)利要求45的方法,其中所述反應(yīng)步驟包括在足以實(shí)現(xiàn)選擇性氧化所述預(yù)選堿基的條件下使所述過(guò)渡金屬配合物與所述雜交RNA樣品反應(yīng)。
53.權(quán)利要求45的方法,它進(jìn)一步包括在所述接觸步驟之前擴(kuò)增所述雜交RNA的步驟。
54.權(quán)利要求53的方法,其中所述擴(kuò)增RNA樣品的步驟通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄酶聚合酶鏈反應(yīng)進(jìn)行。
55.權(quán)利要求46的方法,其中所述測(cè)定所述氧化還原反應(yīng)的反應(yīng)速率的步驟包括測(cè)定該反應(yīng)的循環(huán)伏安圖。
56.權(quán)利要求46的方法,其中所述比較步驟包括將過(guò)渡金屬配合物與雜交RNA樣品的反應(yīng)的循環(huán)伏安圖和過(guò)渡金屬配合物與單鏈RNA的反應(yīng)的已知循環(huán)伏安圖進(jìn)行比較。
57.權(quán)利要求45的方法,其中所述寡核苷酸探針被固定在固體表面。
58.權(quán)利要求57的方法,其中所述過(guò)渡金屬配合物被固定于所述固體表面。
59.權(quán)利要求45的方法,它進(jìn)一步包括步驟(e)鑒定與所述預(yù)選堿基配對(duì)的堿基。
60.權(quán)利要求45的方法,它進(jìn)一步包括步驟(e)鑒定與毗鄰預(yù)選堿基的堿基配對(duì)的堿基。
61.權(quán)利要求59或60的方法,其中所述鑒定步驟進(jìn)一步包括(i)測(cè)定檢測(cè)的氧化還原反應(yīng)的反應(yīng)速率;(ii)將測(cè)得的反應(yīng)速率與四種不同的已知氧化還原反應(yīng)速率中的每一種進(jìn)行比較,其中的已知反應(yīng)速率是過(guò)渡金屬配合物與具有同預(yù)選堿基結(jié)合的腺嘌呤、胞嘧啶、鳥(niǎo)嘌呤或尿嘧啶的RNA的反應(yīng)速率;和(iii)確定所述已知的氧化還原反應(yīng)速率中哪一個(gè)與所述測(cè)得的反應(yīng)速率基本相同。
62.檢測(cè)RNA雜交的方法,它包括(a)將RNA樣品與寡核苷酸探針接觸而形成雜交的RNA;(b)使雜交的RNA與能在氧化還原反應(yīng)中氧化所述寡核苷酸探針中預(yù)選堿基的過(guò)渡金屬配合物反應(yīng),該寡核苷酸探針至少具有一個(gè)所述預(yù)選堿基;(c)檢測(cè)該氧化還原反應(yīng);(d)測(cè)定檢測(cè)的氧化還原反應(yīng)的反應(yīng)速率;(e)將測(cè)得的反應(yīng)速率和過(guò)渡金屬配合物同單鏈RNA的氧化還原反應(yīng)速率進(jìn)行比較;然后(f)確定測(cè)得的反應(yīng)速率是否與過(guò)渡金屬配合物同單鏈RNA的氧化還原反應(yīng)速率相同。
63.權(quán)利要求62的方法,其中所述預(yù)選堿基是鳥(niǎo)嘌呤。
64.權(quán)利要求62的方法,其中所述預(yù)選堿基是腺嘌呤。
65.權(quán)利要求62的方法,其中所述過(guò)渡金屬配合物選自Ru(bpy)32+、Ru(Me2-bpy)32+、Ru(Me2-phen)32+、Fe(bpy)32+、Fe(5-Cl-phen)32+、Os(bpy)32+、Os(5-Cl-phen)32+和ReO2(py)41+。
66.權(quán)利要求62的方法,其中所述反應(yīng)步驟包括在足以實(shí)現(xiàn)選擇性氧化所述預(yù)選堿基的條件下使所述過(guò)渡金屬配合物與所述RNA樣品接觸。
67.權(quán)利要求62的方法,它進(jìn)一步包括在所述反應(yīng)步驟之前擴(kuò)增所述RNA的步驟。
68.權(quán)利要求67的方法,其中所述擴(kuò)增雜交RNA的步驟通過(guò)聚合酶鏈反應(yīng),鏈置換擴(kuò)增,連接酶鏈反應(yīng),或基于核酸序列的擴(kuò)增來(lái)進(jìn)行。
69.權(quán)利要求62的方法,其中所述測(cè)定步驟包括測(cè)定所述反應(yīng)的循環(huán)伏安圖。
70.權(quán)利要求62的方法,其中所述比較步驟包括將過(guò)渡金屬配合物與雜交RNA樣品的反應(yīng)的循環(huán)伏安圖和過(guò)渡金屬配合物與單鏈RNA的反應(yīng)的已知循環(huán)伏安圖進(jìn)行比較。
71.權(quán)利要求62的方法,其中所述寡核苷酸探針被固定于固體表面。
72.權(quán)利要求71的方法,其中所述過(guò)渡金屬配合物被固定于所述固體表面。
73.權(quán)利要求62的方法,它進(jìn)一步包括步驟(g)鑒定與所述預(yù)選堿基配對(duì)的堿基。
74.權(quán)利要求73的方法,其中所述鑒定堿基的步驟(g)包括(i)將測(cè)得的反應(yīng)速率與四種不同的已知氧化還原反應(yīng)速率中的每一種進(jìn)行比較,其中的已知反應(yīng)速率是過(guò)渡金屬配合物與具有同預(yù)選堿基結(jié)合的腺嘌呤、胞嘧啶、鳥(niǎo)嘌呤或尿嘧啶的RNA的反應(yīng)速率;和(ii)確定所述已知的氧化還原反應(yīng)速率中哪一個(gè)與所述測(cè)得的反應(yīng)速率基本相同。
75.RNA測(cè)序的方法,該方法包括(a)將RNA樣品與寡核苷酸探針接觸以形成雜交的RNA,所述寡核苷酸探針包括具有獨(dú)特氧化速率的預(yù)選堿基;(b)使所述雜交RNA與能在氧化還原反應(yīng)中氧化所述寡核苷酸探針中預(yù)選堿基的過(guò)渡金屬配合物反應(yīng),所述寡核苷酸探針具有預(yù)定數(shù)量的預(yù)選堿基;(c)檢測(cè)所述氧化還原反應(yīng);(d)測(cè)定檢測(cè)的氧化還原反應(yīng)的反應(yīng)速率;和(e)鑒定與所述預(yù)選堿基配對(duì)的堿基。
76.權(quán)利要求75的方法,其中所述鑒定步驟包括(i)將測(cè)得的反應(yīng)速率與四種不同的已知氧化還原反應(yīng)速率中的每一種進(jìn)行比較,其中的已知反應(yīng)速率是過(guò)渡金屬配合物與具有同預(yù)選堿基結(jié)合的腺嘌呤、胞嘧啶、鳥(niǎo)嘌呤或尿嘧啶的RNA的反應(yīng)速率;和(ii)確定所述已知的氧化還原反應(yīng)速率中哪一個(gè)與所述測(cè)得的反應(yīng)速率基本相同。
77.權(quán)利要求75的方法,其中所述寡核苷酸探針進(jìn)一步包括具有獨(dú)特氧化速率的第二種預(yù)選堿基,其中所述第二種預(yù)選堿基的氧化速率不同于所述預(yù)選堿基的氧化速率。
78.權(quán)利要求77的方法,其中所述檢測(cè)步驟進(jìn)一步包括檢測(cè)過(guò)渡金屬配合物與所述第二種預(yù)選堿基的氧化還原反應(yīng);其中所述測(cè)定步驟進(jìn)一步包括測(cè)定檢測(cè)的過(guò)渡金屬配合物與第二種預(yù)選堿基的氧化還原反應(yīng)的反應(yīng)速率;以及其中所述的鑒定步驟進(jìn)一步包括鑒定與所述第二種預(yù)選堿基配對(duì)的堿基。
79.權(quán)利要求75的方法,它進(jìn)一步包括用足夠數(shù)量的在不同位點(diǎn)具有所述預(yù)選堿基的寡核苷酸探針重復(fù)(a)至(e)的步驟,以鑒定所述RNA樣品中每個(gè)堿基。
80.檢測(cè)核酸的方法,所述核酸至少含有一個(gè)預(yù)選的堿基,該方法包括(a)使所述核酸與能在氧化還原反應(yīng)中氧化所述預(yù)選堿基的過(guò)渡金屬配合物反應(yīng);(b)檢測(cè)所述氧化還原反應(yīng);和(c)通過(guò)預(yù)選堿基上檢測(cè)的氧化還原反應(yīng)確定是否存在所述核酸。
81.權(quán)利要求80的方法,其中所述反應(yīng)步驟之前先進(jìn)行如下步驟將所述核酸與互補(bǔ)核酸接觸以形成雜交核酸。
82.權(quán)利要求81的方法,其中所述確定步驟進(jìn)一步包括如下步驟(i)測(cè)定所述檢測(cè)的氧化還原反應(yīng)的反應(yīng)速率,(ii)將測(cè)得的反應(yīng)速率和過(guò)渡金屬配合物同單鏈核酸的氧化還原反應(yīng)速率進(jìn)行比較;然后(iii)確定測(cè)得的反應(yīng)速率是否與過(guò)渡金屬配合物同單鏈核酸的氧化還原反應(yīng)速率基本相同。
83.權(quán)利要求82的方法,其中所述測(cè)定氧化還原反應(yīng)的反應(yīng)速率的步驟包括測(cè)定該反應(yīng)的循環(huán)伏安圖。
84.權(quán)利要求82的方法,其中所述比較步驟包括將過(guò)渡金屬配合物與雜交核酸樣品的反應(yīng)的循環(huán)伏安圖和過(guò)渡金屬配合物與單鏈核酸的反應(yīng)的已知循環(huán)伏安圖進(jìn)行比較。
85.權(quán)利要求81的方法,其中所述確定步驟之后接著進(jìn)行如下步驟鑒定與所述預(yù)選堿基配對(duì)的堿基。
86.權(quán)利要求81的方法,其中所述確定步驟之后接著進(jìn)行如下步驟鑒定與毗鄰預(yù)選堿基的堿基配對(duì)的堿基。
87.權(quán)利要求85或86的方法,其中所述鑒定步驟進(jìn)一步包括如下步驟(i)測(cè)定檢測(cè)的氧化還原反應(yīng)的反應(yīng)速率;(ii)將測(cè)得的反應(yīng)速率與五種不同的已知氧化還原反應(yīng)速率中的每一種進(jìn)行比較,其中的已知反應(yīng)速率是過(guò)渡金屬配合物與具有同預(yù)選堿基結(jié)合的腺嘌呤、胞嘧啶、鳥(niǎo)嘌呤、胸腺嘧啶或尿嘧啶的核酸的反應(yīng)速率;和(iii)確定所述已知的氧化還原反應(yīng)速率中哪一個(gè)與所述測(cè)得的反應(yīng)速率基本相同。
88.權(quán)利要求80的方法,其中所述核酸包括約4~約100個(gè)堿基。
89.權(quán)利要求80的方法,其中所述預(yù)選堿基選自鳥(niǎo)嘌呤和腺嘌呤。
90.權(quán)利要求80的方法,其中所述過(guò)渡金屬配合物選自Ru(bpy)32+、Ru(Me2-bpy)32+、Ru(Me2-phen)32+、Fe(bpy)32+、Fe(5-Cl-phen)32+、Os(bpy)32+、Os(5-Cl-phen)32+和ReO2(py)41+。
91.權(quán)利要求80的方法,其中所述核酸是DNA。
92.權(quán)利要求80的方法,其中所述核酸是RNA。
93.權(quán)利要求80的方法,其中所述反應(yīng)步驟包括在足以實(shí)現(xiàn)選擇性氧化所述預(yù)選堿基的條件下使所述過(guò)渡金屬配合物與所述核酸反應(yīng)。
94.權(quán)利要求80的方法,它進(jìn)一步包括在所述反應(yīng)步驟之前擴(kuò)增所述核酸的步驟。
95.權(quán)利要求94的方法,其中所述擴(kuò)增核酸的步驟通過(guò)聚合酶鏈反應(yīng),鏈置換擴(kuò)增,連接酶鏈反應(yīng),或基于核酸序列的擴(kuò)增來(lái)進(jìn)行。
96.權(quán)利要求80的方法,其中所述核酸被固定于固體表面。
97.權(quán)利要求96的方法,其中所述過(guò)渡金屬配合物被固定于所述固體表面。
98.檢測(cè)猜測(cè)含有靶核酸的試驗(yàn)樣品中是否存在靶核酸的方法,其中所述靶核酸至少含一個(gè)預(yù)選堿基,該方法包括(a)將該試驗(yàn)樣品與能同該靶核酸專一性地結(jié)合的寡核苷酸探針接觸而形成雜交核酸;(b)將該雜交核酸和能在氧化還原反應(yīng)中氧化所述預(yù)選堿基的過(guò)渡金屬配合物接觸;(c)檢測(cè)是否存在與所述雜交核酸相關(guān)的氧化還原反應(yīng);和(d)通過(guò)所述預(yù)選堿基上檢測(cè)的氧化還原反應(yīng)確定所述試驗(yàn)樣品中是否存在該靶核酸。
99.權(quán)利要求98的方法,它進(jìn)一步包括如下步驟在所述檢測(cè)步驟之前把所述試驗(yàn)樣品和所述雜交核酸分離開(kāi)。
100.權(quán)利要求98的方法,其中所述靶核酸比所述寡核苷酸探針至少多含10個(gè)預(yù)選堿基。
101.權(quán)利要求98的方法,其中所述寡核苷酸探針不含所述預(yù)選堿基。
102.權(quán)利要求98的方法,其中所述靶核酸比所述寡核苷酸探針更長(zhǎng),且其中所述雜交核酸內(nèi)至少有一個(gè)預(yù)選堿基未與所述寡核苷酸探針雜交。
103.權(quán)利要求98的方法,其中所述確定步驟是定量確定步驟。
104.權(quán)利要求98的方法,其中所述確定步驟進(jìn)一步包括(i)測(cè)定所述檢測(cè)的氧化還原反應(yīng)的反應(yīng)速率,(ii)將測(cè)得的反應(yīng)速率和過(guò)渡金屬配合物與單鏈靶核酸的氧化還原反應(yīng)速率進(jìn)行比較;然后(iii)確定測(cè)得的反應(yīng)速率是否與該過(guò)渡金屬配合物同單鏈靶核酸的氧化還原反應(yīng)速率基本相同。
105.權(quán)利要求104的方法,其中所述測(cè)定氧化還原反應(yīng)的反應(yīng)速率的步驟包括測(cè)定該反應(yīng)的循環(huán)伏安圖。
106.權(quán)利要求104的方法,其中所述比較步驟包括將過(guò)渡金屬配合物與雜交靶核酸樣品的反應(yīng)的循環(huán)伏安圖和過(guò)渡金屬配合物與單鏈靶核酸的反應(yīng)的已知循環(huán)伏安圖進(jìn)行比較。
107.權(quán)利要求98的方法,其中所述靶核酸包括約4~約100個(gè)堿基。
108.權(quán)利要求98的方法,其中所述預(yù)選堿基選自鳥(niǎo)嘌呤和腺嘌呤。
109.權(quán)利要求98的方法,其中所述過(guò)渡金屬配合物選自Ru(bpy)32+、Ru(Me2-bpy)32+、Ru(Me2-phen)32+、Fe(bpy)32+、Fe(5-Cl-phen)32+、Os(bpy)32+、Os(5-Cl-phen)32+和ReO2(py)41+。
110.權(quán)利要求98的方法,其中所述靶核酸是DNA。
111.權(quán)利要求98的方法,其中所述靶核酸是RNA。
112.權(quán)利要求98的方法,其中所述反應(yīng)步驟包括在足以實(shí)現(xiàn)選擇性氧化所述預(yù)選堿基的條件下使所述過(guò)渡金屬配合物與所述靶核酸反應(yīng)。
113.權(quán)利要求98的方法,它進(jìn)一步包括在所述反應(yīng)步驟之前擴(kuò)增所述靶核酸的步驟。
114.權(quán)利要求113的方法,其中擴(kuò)增所述靶核酸樣品的步驟通過(guò)聚合酶鏈反應(yīng),鏈置換擴(kuò)增,連接酶鏈反應(yīng),或基于核酸序列的擴(kuò)增來(lái)進(jìn)行。
115.權(quán)利要求98的方法,其中所述寡核苷酸探針被固定于固體表面。
116.權(quán)利要求115的方法,其中所述過(guò)渡金屬配合物被固定于所述固體表面。
117.檢測(cè)靶核酸的方法,所述靶核酸至少含一個(gè)預(yù)選堿基,該方法包括(a)將該靶核酸和能與該靶核酸專一性地結(jié)合的互補(bǔ)核酸接觸而形成雜交核酸;(b)使該雜交核酸與能在氧化還原反應(yīng)中氧化所述預(yù)選堿基的過(guò)渡金屬配合物反應(yīng);(c)檢測(cè)該氧化還原反應(yīng);和(d)通過(guò)預(yù)選堿基上檢測(cè)的氧化還原反應(yīng)確定是否存在所述核酸;其中該靶核酸內(nèi)的預(yù)選堿基是鳥(niǎo)嘌呤;該靶核酸含胞嘧啶,而所述互補(bǔ)核酸含與所述雜交核酸中的胞嘧啶結(jié)合的備擇堿基;而且其中所述備擇堿基選自肌苷和7-脫氮-鳥(niǎo)嘌呤。
118.權(quán)利要求117的方法,其中所述反應(yīng)步驟包括在足以實(shí)現(xiàn)選擇性氧化所述預(yù)選堿基而不氧化所述備擇堿基的條件下使過(guò)渡金屬配合物與所述核酸反應(yīng)。
119.權(quán)利要求117的方法,其中所述確定步驟進(jìn)一步包括(i)測(cè)定所述檢測(cè)的氧化還原反應(yīng)的反應(yīng)速率,(ii)將測(cè)得的反應(yīng)速率和過(guò)渡金屬配合物與單鏈核酸的氧化還原反應(yīng)速率進(jìn)行比較;然后(iii)確定測(cè)得的反應(yīng)速率是否與過(guò)渡金屬配合物同單鏈核酸的氧化還原反應(yīng)速率基本相同。
120.權(quán)利要求119的方法,其中所述測(cè)定氧化還原反應(yīng)的反應(yīng)速率的步驟包括測(cè)定該反應(yīng)的循環(huán)伏安圖。
121.權(quán)利要求119的方法,其中所述比較步驟包括將過(guò)渡金屬配合物與雜交核酸樣品的反應(yīng)的循環(huán)伏安圖和過(guò)渡金屬配合物與單鏈核酸的反應(yīng)的已知循環(huán)伏安圖進(jìn)行比較。
122.權(quán)利要求117的方法,其中所述確定步驟之后是如下步驟鑒定與所述預(yù)選堿基配對(duì)的堿基。
123.權(quán)利要求117的方法,其中所述確定步驟之后是如下步驟鑒定與毗鄰預(yù)選堿基的堿基配對(duì)的堿基。
124.權(quán)利要求122或123的方法,其中所述鑒定步驟進(jìn)一步包括(i)測(cè)定檢測(cè)的氧化還原反應(yīng)的反應(yīng)速率;(ii)將測(cè)得的反應(yīng)速率與四種不同的已知氧化還原反應(yīng)速率中的每一種進(jìn)行比較,其中的已知反應(yīng)速率是過(guò)渡金屬配合物與具有同預(yù)選堿基結(jié)合的腺嘌呤、胞嘧啶、鳥(niǎo)嘌呤、胸腺嘧啶、或尿嘧啶的核酸的反應(yīng)速率;和(iii)確定所述已知的氧化還原反應(yīng)速率中哪一個(gè)與所述測(cè)得的反應(yīng)速率基本相同。
125.權(quán)利要求117的方法,其中所述靶核酸包括約4~約100個(gè)堿基。
126.權(quán)利要求117的方法,其中所述過(guò)渡金屬配合物選自Ru(bpy)32+、Ru(Me2-bpy)32+、Ru(Me2-phen)32+、Fe(bpy)32+、Fe(5-Cl-phen)32+、Os(bpy)32+、Os(5-Cl-phen)32+和ReO2(py)41+。
127.權(quán)利要求117的方法,其中所述靶核酸是DNA。
128.權(quán)利要求117的方法,其中所述靶核酸是RNA。
129.權(quán)利要求117的方法,它進(jìn)一步包括在所述反應(yīng)步驟之前擴(kuò)增所述靶核酸的步驟。
130.權(quán)利要求129的方法,其中所述擴(kuò)增靶核酸的步驟通過(guò)聚合酶鏈反應(yīng),鏈置換擴(kuò)增,連接酶鏈反應(yīng),或基于核酸序列的擴(kuò)增來(lái)進(jìn)行。
131.權(quán)利要求117的方法,其中所述互補(bǔ)核酸被固定于固體表面。
132.權(quán)利要求131的方法,其中所述過(guò)渡金屬配合物被固定于所述固體表面。
133.檢測(cè)猜測(cè)含有靶核酸的試驗(yàn)樣品中是否存在靶核酸的方法,該方法包括(a)將試驗(yàn)樣品與能同該靶核酸專一性地結(jié)合的寡核苷酸探針接觸而形成雜交核酸,該寡核苷酸探針具有被封閉而不能由末端轉(zhuǎn)移酶延伸的末端;(b)將該雜交核酸與含預(yù)選堿基的溶液在末端轉(zhuǎn)移酶存在下接觸而產(chǎn)生所述靶核酸的延伸產(chǎn)物,該延伸產(chǎn)物含所述預(yù)選堿基;(c)使所述寡核苷酸探針和能在氧化還原反應(yīng)中氧化預(yù)選堿基的過(guò)渡金屬配合物接觸;(d)檢測(cè)是否存在所述氧化還原反應(yīng);和(e)通過(guò)所述預(yù)選堿基上檢測(cè)的氧化還原反應(yīng)確定所述試驗(yàn)樣品中是否存在該靶核酸。
134.權(quán)利要求133的方法,它進(jìn)一步包括如下步驟在所述檢測(cè)步驟之前從所述雜交核酸中分離出所述試驗(yàn)樣品。
135.檢測(cè)猜測(cè)含有靶核酸的試驗(yàn)樣品中是否存在靶核酸的方法,該方法包括(a)提供寡核苷酸捕捉探針,其中所述捕捉探針與所述靶核酸專一性地結(jié)合;(b)將試驗(yàn)樣品與捕捉探針接觸而形成雜交核酸;(c)使寡核苷酸信號(hào)探針和該雜交核酸接觸,其中所述信號(hào)探針與所述靶核酸專一性地結(jié)合,而且其中所述信號(hào)探針至少含一個(gè)預(yù)選堿基,以形成雜交核酸夾心;(d)將所述雜交核酸夾心與可在氧化還原反應(yīng)中氧化預(yù)選堿基的過(guò)渡金屬配合物接觸;(e)檢測(cè)是否存在與所述雜交核酸夾心相關(guān)的氧化還原反應(yīng);和(f)通過(guò)預(yù)選堿基上檢測(cè)的氧化還原反應(yīng)確定所述試驗(yàn)樣品中是否存在該靶核酸。
136.權(quán)利要求135的方法,它進(jìn)一步包括如下步驟在所述檢測(cè)步驟之前從所述雜交核酸中分離所述試驗(yàn)樣品。
137.權(quán)利要求136的方法,其中所述分離步驟在步驟(b)和步驟(c)之間,或者在步驟(c)和步驟(d)之間進(jìn)行。
138.適用于電化學(xué)檢測(cè)核酸物質(zhì)的微電子裝置,該裝置包括具有第一個(gè)和第二個(gè)相對(duì)面的微電子基材;位于第一個(gè)表面上的導(dǎo)電電極;和固定于第一個(gè)表面上毗鄰所述導(dǎo)電電極的寡核苷酸捕捉探針。
139.權(quán)利要求138的微電子裝置,該裝置的第一個(gè)表面上具有多個(gè)導(dǎo)電電極,且有多個(gè)不同的寡核苷酸捕捉探針固定于該第一個(gè)表面上,其中每個(gè)寡核苷酸捕捉探針位于毗鄰不同的導(dǎo)電電極處。
140.權(quán)利要求138的微電子裝置,它進(jìn)一步包括與所述導(dǎo)電電極電連接的觸頭。
141.權(quán)利要求138的微電子裝置,其中所述基材是硅。
142.權(quán)利要求138的微電子裝置,其中所述寡核苷酸捕捉探針長(zhǎng)度為4~100個(gè)核苷酸。
143.適用于在背景鳥(niǎo)嘌呤信號(hào)存在下電化學(xué)檢測(cè)預(yù)選堿基的寡核苷酸探針,所述寡核苷酸探針至少含有一個(gè)式I的嘌呤堿基;
144.權(quán)利要求143的寡核苷酸探針,其中所述探針長(zhǎng)度高達(dá)100個(gè)堿基。
145.檢測(cè)核酸的方法,它包括(a)提供至少含一個(gè)下式的預(yù)選堿基的核酸
然后(b)使該核酸和能在氧化還原反應(yīng)中氧化所述預(yù)選堿基的過(guò)渡金屬配合物反應(yīng);(c)檢測(cè)該氧化還原反應(yīng);和(d)通過(guò)所述預(yù)選堿基上檢測(cè)的氧化還原反應(yīng)確定是否存在所述核酸。
146.權(quán)利要求145的方法,其中所述反應(yīng)步驟之前先進(jìn)行如下步驟將所述核酸與互補(bǔ)核酸接觸而形成雜交核酸。
147.權(quán)利要求146的方法,其中所述互補(bǔ)核酸至少含一個(gè)鳥(niǎo)嘌呤取代物。
148.適用于電化學(xué)檢測(cè)核酸中預(yù)選堿基的電極,是通過(guò)將所述核酸與能在氧化還原反應(yīng)中氧化所述預(yù)選堿基的過(guò)渡金屬配合物反應(yīng)而進(jìn)行檢測(cè)的,該電極包括(a)其上形成工作表面的導(dǎo)電基材;和(b)與所述工作表面連接的聚合物層,其中所述聚合物層對(duì)于該過(guò)渡金屬配合物呈多孔性,且其中所述聚合物層結(jié)合所述核酸。
149.權(quán)利要求148的電極,它進(jìn)一步包括與所述聚合物層結(jié)合的核酸,所述核酸至少含一個(gè)預(yù)選堿基。
150.檢測(cè)核酸的方法,所述核酸至少含一個(gè)預(yù)選堿基,該方法包括(a)使含所述核酸的樣品與電極接觸,該電極包括(i)其上形成工作表面的導(dǎo)電基材;和(ii)與所述工作表面連接的聚合物層,其中所述聚合物層結(jié)合所述核酸;(b)使所述核酸與能在氧化還原反應(yīng)中氧化所述預(yù)選堿基的過(guò)渡金屬配合物反應(yīng),且其中所述聚合物層對(duì)于該過(guò)渡金屬配合物呈多孔性;(c)通過(guò)測(cè)量流經(jīng)該電極的電流檢測(cè)該氧化還原反應(yīng);和(d)通過(guò)所述預(yù)選堿基上檢測(cè)的氧化還原反應(yīng)確定是否存在所述核酸。
151.權(quán)利要求150的方法,其中所述反應(yīng)步驟之前先進(jìn)行如下步驟將所述核酸與互補(bǔ)核酸接觸而形成雜交核酸。
全文摘要
檢測(cè)至少含一個(gè)預(yù)選堿基(例如腺嘌呤、鳥(niǎo)嘌呤、6-硫基鳥(niǎo)嘌呤、8-氧鳥(niǎo)嘌呤、和8-氧腺嘌呤)的核酸(例如DNA、RNA)的方法,該方法包括:(a)使核酸與能在氧化還原反應(yīng)中氧化預(yù)選堿基的過(guò)渡金屬配合物反應(yīng);(b)檢測(cè)該氧化還原反應(yīng);和(c)通過(guò)在預(yù)選堿基上檢測(cè)的氧化還原反應(yīng)確定是否存在核酸。該方法可用于多種應(yīng)用場(chǎng)合,包括DNA測(cè)序、診斷分析和定量分析。
文檔編號(hào)G01N33/53GK1192249SQ9619599
公開(kāi)日1998年9月2日 申請(qǐng)日期1996年6月24日 優(yōu)先權(quán)日1995年6月27日
發(fā)明者H·H·索普, D·H·約翰斯頓, M·E·納皮爾, C·R·魯密斯, M·F·西絲塔爾, J·H·金 申請(qǐng)人:查珀?duì)栂柋笨_來(lái)納大學(xué)