專利名稱：：中樞神經系統(tǒng)軸突外延調節(jié)劑,以及包含和使用該調節(jié)劑的組合物,細胞和方法
背景技術：
：發(fā)明領域本發(fā)明通常涉及中樞神經系統(tǒng)中的神經生長的調節(jié)，尤其是涉及用于促進中樞神經系統(tǒng)神經生長的方法和有關的制劑，構建物和組合物。具體地說，本發(fā)明涉及使用細胞粘附分子，優(yōu)選的是如L1的神經細胞粘附分子以促進和改善上述神經生長。相關現(xiàn)有技術的描述神經元延伸軸突的能力在發(fā)育期間建立神經元聯(lián)系中具有頭等重要性。在再生因損傷被毀的重新建立的聯(lián)系中也需要這種能力。在所有動物物種的中樞和外周神經系統(tǒng)的發(fā)育過程中，軸突大量地伸長(Cajal(1928)神經系統(tǒng)的退化和再生，牛津大學出版社，倫敦)這種現(xiàn)象涉及軸突和樹突。然而，在成體中，中樞神經系統(tǒng)中軸突和樹對突的再生，隨著進化過程而日益喪失。在外周神經系統(tǒng)中，遭受損傷后，所有脊椎動物種類的軸突能再生(Cajal(1928)；Martini(1994)神經細胞學雜志231-28)。然而，在哺乳動物中，損傷后的軸突再生局限于軸突萌發(fā)。然而，神經元外延的再生在較低等脊椎動物種類中可能存在(Stuermer等，(1992)神經生物學雜志，23537-550)。相反，在中樞神經系統(tǒng)中，如果不是所有的高等和低等脊椎動物成體的神經元那么也是大多數(shù)具有軸突再生的可能性。(Aguayo(1985)“在哺乳動物成體中樞神經系統(tǒng)中來自損傷神經元的軸突再生”。在突觸可塑性(Cotman.C.W.ed.)紐約，TheGuilford出版社，pp457-484)。膠質細胞是控制軸突再生的明確的決定因素。一般來說，哺乳動物膠質細胞允許發(fā)育過程中中樞神經系統(tǒng)軸突再生(Silver等(1982)比較神經病學雜志21010-29，Miller等(1985)發(fā)育生物學11135-41，Pollerberg等，(1985)細胞生物學雜志1011921-1929)，以及成體外周神經系統(tǒng)軸突再生(Fawcett等，(1990)神經科學年評1343-60)。因此，依據(jù)遭受損傷的情況，成體哺乳動物外周神經系統(tǒng)的膠質細胞在一定程度上能恢復它們早期的促進軸突外延的潛能，以使它們促進再生(Kalderon(1988)神經科學研究雜志21501-512；kliot等“誘導背根纖維再生成成熟哺乳動物的脊髓”在神經再生的目前問題，紐約，pp311-328；Carlstedt等，(1989)腦研究通報2293-102)。某些低等脊椎動物的中樞神經系統(tǒng)的膠質細胞仍允許成年期的軸突再生(Stuermer等，(1992)神經生物學雜志23537-550)。相反，成體哺乳動物的中樞神經系統(tǒng)的膠質細胞并不有助于損傷后的軸突再生。幾種起分子信號作用并作為促進和或抑制軸突生長基礎的識別分子已被鑒別出來(Martini(1996))。在軸突外延促進識別分子中，神經細胞粘附分子L1在介導軸突外延中起重要的作用(Schachner(1990)神經科學討論會2497-507)。依賴于L1的軸突外延由嗜同性相互作用所介導。L1能增強表達L1的軸突細胞和施旺氏細胞以及被L1轉染的成纖維細胞中的軸突生長(Bixby等。(1982)美國國家科學院院報，842555-2559；Chang等，(1987)細胞生物學雜志104355-362；Lagenaur等(1987)美國國家科學院院報847753-7757；Serlheimer等(1988)細胞生物學雜志107341-351；Kadaron等(1990a)細胞生物學雜志110193-208；Williams等(1992)細胞生物學雜志119883-892)。切除或壓碎成年小鼠的外周神經后顯著地增強L1的表達(Nieke等(1985)分化30141-151；Martini等，(1994a)神經膠質1070-74)。二天內L1積聚在神經元和施旺氏細胞之之間的接觸位點，主要集中在施旺氏細胞表面而不是在神經元上(Martini等(1994a)。此外，L1的嗜同結合能力通過與神經細胞粘附分子N-CAM的分子連接而被加強，結果使結合通過嗜同輔助作用而發(fā)生(Kadmon等(1990a)；Kadmon等(1990b)細胞生物學雜志110209-218和110193-208；Horstkorte等(1993)細胞生物學雜志1211409-1421)。除了其促軸突外延的特性外，L1還參與細胞粘附(Rathjen等(1984)EMBOJ.31-10；Kadmon等(1990b)細胞生物學雜志，110209-218；Appel等(1993)神經科學雜志，134764-4775)，粒細胞遷移(Lindner等(1983)自然305427-430)和軸突髓鞘形成(Wood等(1990)神經科學雜志103635-3645)。L1由6個免疫球蛋白樣的結構域和5個纖連蛋白III型同源重復構成。L1起信號轉導物作用，在導致胞內信使分子穩(wěn)定的基態(tài)水平變化的一系列復雜事件中，其識別過程為第一步。后者的變化包括肌醇磷酸、Ca2+、pH和環(huán)核苷酸(Schuch等(1990)神經元313-20；vonBohlenundHallbach等(1992)歐洲神經科學雜志，4896-909；Doherty等(1992)神經生物學趨勢評論2595-601)以及蛋白激酶如蛋白激酶C和pp60c-src的活性變化(Schuch等(1990)神經元313-20；Atashi等(1992)神經元8831-842)。L1還和酪蛋白H型激酶和另一個磷酸化L1的未鑒定的激酶有關(Sadoul等(1989)神經化學雜志328251-254)。L1介導的軸突外延對L型Ca2+通道的阻斷作用和百日咳毒素敏感。這些發(fā)現(xiàn)表明Ca2+和G蛋白在L1介導的軸突外延中的重要作用(Williams等(1992)細胞生物學雜志119883-892)。L1也存在于培養(yǎng)物中的增殖未成熟的星形細胞中，這些細胞的軸突外延比分化的L1免疫反應陰性的星形細胞的軸突外延被更好地促進(Saad等(1991)細胞生物學雜志115473-484)。然而，發(fā)現(xiàn)在體內，在從胚胎期第13天一直到成年期檢測的任何發(fā)育階段，星形細胞均表達L1(Bartsch等(1989)比較神經病學雜志284451-462；和未發(fā)表的資料)。假如L1有促使軸突外延的能力，那么研究是否L1和L1所歸屬的免疫球蛋白超家族的其它成員的星形細胞表達可能抑制被報道存在于成熟中樞神經系統(tǒng)的膠質細胞和髓鞘上潛在的抑制性分子信號是恰當?shù)?Schachner等，發(fā)育神經生物學展望；印刷中Schwab等(1993)神經科學年述16565-595)。這特別與開發(fā)治療由中樞神經系統(tǒng)神經組織畸形或損傷引起的衰弱的有效對策有關，它正是本發(fā)明所針對的目標發(fā)明概述根據(jù)本發(fā)明，公開了用于調節(jié)神經生長的制劑和相應的方法，尤其是可在中樞神經系統(tǒng)(CNS)的腔隙(compartment)中促進這種生長，更具體地說是在有髓神經組織中。本發(fā)明的制劑能在通常認為抑制已知的軸突外延(outgrowth)因子的生長促進刺激物的環(huán)境中顯著地促使上述神經生長。具體來說，這種抑制環(huán)境包括存在于中樞神經系統(tǒng)膠質細胞和髓鞘上的抑制性分子信號。本發(fā)明的制劑廣泛選自一組細胞粘附分子，較優(yōu)選的是神經細胞粘附分子。最優(yōu)選的是本發(fā)明的制劑選自一組屬于免疫球蛋白超家族的分子，特別是那些介導非鈣依賴的神經細胞粘附的成員，其中L1，N-CAM和髓鞘相關糖蛋白為其中的特別成員?？赡芤灿绊懼袠猩窠浵到y(tǒng)神經生長的其他細胞粘附分子包括層粘連蛋白、纖連蛋白、N-鈣粘著蛋白，BSP-2(小鼠N-CAM)、D-2、224-1A6-A1，L1-CAM、NILE、Nr-CAM、TAG-1(軸突蛋白-1)、Ng-CAM和F3/F11。在本發(fā)明的另一方面，本發(fā)明的制劑屬于一種在本文被稱為神經識別分子L1家族的新家族。這個家族包括L1、NgCAM、神經束蛋白、果蠅神經膠質蛋白、蓑L1.1和L1.2及其他成員。這組制劑全部表現(xiàn)為以L1為特征的Ig樣結構域和FN樣重復，在這方面的連系中，顯示為顯著的共線性，包括HNK-1糖結構的高度N-糖苷化連接的糖類以及一種包含180kD主帶及165和125kD較小帶的蛋白片段帶型。本發(fā)明的制劑也包括其中能調節(jié)中樞神經系統(tǒng)中軸突生長的細胞粘附分子和同族分子片段，它的衍生物和模擬物。尤其是，這些制劑包括含有為細胞外基質分子所特有的結構基元的分子，尤其為纖連蛋白III型同源重復和免疫球蛋白樣結構域。優(yōu)選的是，這些結構基元包括結構上與纖連蛋白III型同源重復1-2和免疫球蛋白樣結構域I-II，III-IV和V-VI相似的那些基元。本發(fā)明涉及促進和增強體內神經再生的方法，以及相應的遺傳構建物，如質粒、載體、轉基因等，以及藥用組合物，所有這些都可用于實現(xiàn)上述方法的目的。更具體地說，本發(fā)明的制劑可制備成載體或質粒，如通過基因治療技術導入位于中樞神經系統(tǒng)中需要再生位點的神經細胞中，引起本發(fā)明的制劑表達，因而促進必需的神經生長。另一策略考慮在一組合物中配制一種或多種適宜制劑，通過非腸道給藥可同樣直接導入到中樞神經系統(tǒng)位點。至于某些制劑如L1已表明能嗜同結合，施用這樣的組合物可起到抑制而不是促進神經生長的目的。這種效果在不需要或無控制的生長可能發(fā)生或正在發(fā)生的特殊情況下也許是所希望要的，因此本發(fā)明也涉及這種用途。因此，這些制劑參與嗜同結合的能力將拮抗劑提供給包括其抗體的能用作激動劑的試劑，因而參與促進神經生長和再生。因此，本發(fā)明涉及用于本文提出的治療目的的，適宜的構建物和含為制劑抗體的組合物的制備。而且，正如在本文以后說明的那樣，根據(jù)本發(fā)明，例如L1的抗體可用作藥物發(fā)現(xiàn)檢測或相同的檢測的一部分，以鑒別可能具有活性和可用于診斷和治療的其它制劑。尤其是，如本文后面所說明的，根據(jù)CHL1的分離和鑒定，L1的類似物，如多克隆抗體的抗體可用于鑒別L1CAM家族的其它成員，因此本發(fā)明涉及應用上述抗體分離的這些CAM成員。本發(fā)明還涉及診斷應用，例如，通過檢測和測定本發(fā)明一種或多種制劑的存在量和活性，可望估測中樞神經系統(tǒng)神經生長潛在的或真正的發(fā)展。同樣地，如本文后面所述，本發(fā)明還涉及包括藥物發(fā)現(xiàn)分析的分析方法，該分析方法能利用本發(fā)明制劑的活性調節(jié)中樞神經系統(tǒng)神經生長。例如可通過含本發(fā)明的制劑的分析方法檢測用于中樞神經系統(tǒng)神經生長調節(jié)的前景藥物，或連同此方法一起開發(fā)的細胞系或者培養(yǎng)物可用作測定系統(tǒng)。簡言之，本發(fā)明還涉及在分化的星形細胞和膠質細胞以及來源于此的細胞和組織中表達神經粘附分子的轉基因小鼠品系。尤其，神經粘附分子是L1。星形膠質細胞的L1表達增強來自這些轉基因小鼠的中樞神經系統(tǒng)組織的軸突外延。還如所討論的，本發(fā)明涉及增強中樞神經系統(tǒng)神經元的神經外延的方法，增強記憶的方法以及長期強化作用的穩(wěn)定和其它相似的有用方法測定的增加突觸效能的方法。還涉及檢測藥物方法和調節(jié)神經粘附分子的效應其它調節(jié)方法，和適用于上述方法的測定系統(tǒng)。相應地，本發(fā)明的一個主要目的是提供一種轉基因的哺乳動物，其膠質細胞表達一種外源的神經粘附分子。本發(fā)明的進一步的目的是提供含轉基因哺乳動物膠質細胞的細胞培養(yǎng)物。而本發(fā)明的另一目的是提供一種細胞培養(yǎng)系統(tǒng)，該系統(tǒng)含轉基因哺乳動損傷或未損傷的視神經或者神經系統(tǒng)的其它部分。本發(fā)明的進一步的目的是提供一種增強中樞神經系統(tǒng)神經元的神經元外延的方法、該方法包括在膠質細胞培養(yǎng)系統(tǒng)上培養(yǎng)神經元。本發(fā)明的進一步的目的是提供一種增強中樞神經系統(tǒng)神經元的神經生長的方法，該方法包括在放置在細胞培養(yǎng)系統(tǒng)中的神經系統(tǒng)的視神經或其它部分上培養(yǎng)神經元。本發(fā)明的進一步的目的是提供一種增強中樞神經系統(tǒng)神經元的神經元生長的方法，該方法包括通過植入細胞來分泌神經粘附分子。本發(fā)明的另一目的是提供一種增強記憶的方法，該方法包括需要增強記憶時，給哺乳動物大腦施用對增強哺乳動物記憶有效的量的膠質細胞培養(yǎng)系統(tǒng)的細胞。本發(fā)明的另一目的是提供一種增強記憶的方法，該方法包括需要增強記憶時給哺乳動物大腦施用對增強哺乳動物記憶有效的量的放置在細胞培養(yǎng)系統(tǒng)中的神經系統(tǒng)的視神經或其它部分的細胞。本發(fā)明的另一目的是提供一種增強記憶的方法，該方法包括在需要上述增強記憶時，給哺乳動物大腦的膠質細胞輸入一種載體，該載體允許神經粘附分子在膠質細胞中表達。本發(fā)明的另一個目的是提供一種增強記憶的方法，該方法包括通過植入細胞分泌神經粘附分子。本發(fā)明的另一目的是提供一種在需要這種增加時增加哺乳動物中樞神經系統(tǒng)中突觸效能的方法，該方法包括給哺乳動物的大腦施用對增加哺乳動物大腦突觸效能有效的量的膠質細胞培養(yǎng)系統(tǒng)的細胞。本發(fā)明的另一個目的是提供一種在需要這種增加時能增加哺乳動物中樞神經系統(tǒng)突觸效能的方法，包括給哺乳動物大腦施用對增加哺乳動物大腦突觸效能有效的量的放置在細胞培養(yǎng)系統(tǒng)中的神經系統(tǒng)的視神經或其它部分的細胞。另一個目的是提供一種當需要這種增加時能增加哺乳動物中樞神經系統(tǒng)突觸效能的方法，該方法包括在需要上述增強時給哺乳動物大腦的膠質細胞輸入一種載體，該載體允許神經粘附分子在膠質細胞中表達。本發(fā)明另一個目的是提供一種增加突觸效能的方法，該方法包括通過植入細胞分泌神經粘附分子。本發(fā)明的另一目的是提供一種檢測藥物或其它實體調節(jié)神經粘附分子活性的能力的方法，該方法包括把中樞神經系統(tǒng)神經元添加到膠質細胞培養(yǎng)系統(tǒng)中；再把待檢測的藥物加入到細胞培養(yǎng)系統(tǒng)中；測定中樞神經系統(tǒng)神經元的神經元外延；并相對于不加藥物的對照培養(yǎng)物而言，使在存在藥物時細胞的神經元外延水平的差異與藥物調節(jié)神經粘附分子活性的能力之間的相關。本發(fā)明的另一目的是提供一種檢測藥物或其它實體調節(jié)神經粘附分子活性的能力的方法，該方法包括把中樞神經系統(tǒng)神經元加到視神經或神經系統(tǒng)其它部分的細胞培養(yǎng)系統(tǒng)中；再把待檢測的藥物加到細胞培養(yǎng)系統(tǒng)中；然后測定中樞神經系統(tǒng)神經元的神經元外延；相對于不加藥物的對照培養(yǎng)物而言，在存在藥物時，細胞的神經元外延水平的差異與藥物調節(jié)神經粘附分子活性的能力之間的相關性。本發(fā)明的另一個目的是提供一種用于篩選能調節(jié)神經粘附分子產生的藥物和其它制劑的檢測系統(tǒng)，這種檢測系統(tǒng)包括膠質細胞培養(yǎng)系統(tǒng)；和加入到的細胞培養(yǎng)系統(tǒng)的中樞神經系統(tǒng)神經元。本發(fā)明的另一目的是提供一種用于篩選能調節(jié)神經粘附分子產生的藥物和其它制劑的檢測系統(tǒng)，該檢測系統(tǒng)包括培養(yǎng)加入了藥物或試劑的膠質細胞培養(yǎng)系統(tǒng)；將中樞神經系統(tǒng)神經元加入到細胞培養(yǎng)系統(tǒng)中；和檢測神經元外延以確定所加藥物的效果。本發(fā)明的另一目的是提供一種用于篩選能調節(jié)神經粘附分子產生的藥物和其它制劑的檢測系統(tǒng)，該檢測系統(tǒng)包括在加入了藥物或試劑的細胞培養(yǎng)系統(tǒng)中培養(yǎng)視神經或神經系統(tǒng)的其它部分；將神經元加到細胞培養(yǎng)系統(tǒng)中；和檢測神經元外延以確定所加藥物的效果。本發(fā)明的另一目的是提供一種用于篩選能調節(jié)神經粘附分子產生的藥物或其它制劑的檢測系統(tǒng)，該檢測系統(tǒng)包括在用藥物或制劑接種中樞神經系統(tǒng)神經元的培養(yǎng)物；加入可溶性的神經粘附分子；和檢測神經元外延以確定所加藥物的效果。對確保為詳細的描述進行研究并參考下面的，對于本領域的技術人員來說，其它目的和優(yōu)點都將是顯而易見的。附圖簡述圖1描述GFAP-L1嵌合轉基因圖譜。4.05kb的小鼠L1cDNA被插入到用NotI接頭修飾過的GFAP基因的外顯子中，在該構建物中，L1cDNA的5′的前端是SV40晚期基因剪接區(qū)(V)，接在3′之后的是SV40聚腺苷酸化信號(pA)。L1ATG的位置和聚腺苷酸化信號均已顯示外顯子用框表示。圖2描述來自不同轉基因品系的腦RNA的RNA印跡分析。將10μg成年全腦總RNA上樣至各泳道上并用鼠L1cDNA探測。曝光時間為3天。1-3泳道為來自不同轉基因后代的腦(第1泳道3426品系；第2泳道3427品系；第3泳道3481品系；第4泳道，非轉基因對照腦)。注意轉基因L1mRNA(箭頭)的水平在三個轉基因品系中是不同的，品系3426水平最高，品系3427居中，品系3418最低。右邊的空白顯示28S和18SrRNA的位置。圖3描述用原位雜交定位來自非轉基因小鼠(A、B和E)和3426品系轉基因小鼠(C和D)的成年未損傷(A、C和E)和損傷(損傷后15天，B和D)的視神經的L1mRNA。在野生型動物中，L1mRNA僅在視網(wǎng)膜神經元細胞中檢測到，而在視神經膠質細胞中沒有檢測到(A和B)。在轉基因動物中，在視神經中可見含L1轉錄物的細胞(C和D)。L1陽性細胞的密度在神經無髓鞘近端部分最高。損傷后神經中L1mRNA陽性細胞的密度略有增加(比較C和D)。在視神經中，表達L1細胞的分布(C和D)與表達GFAP(E)細胞的分布相似。在圖E的標尺為100μm(A-E)。圖4描述雙免疫熒光顯微鏡法定位來自轉基因(3426品系，A和B)和野生型(C)動物的非損傷(A和C)和損傷(損傷后28天，B)的視神經中的L1(A和B)和GFAP(C)。損傷后來自轉基因動物的視神經的L1免疫反應性明顯地增加(比較A和B)。在損傷的轉基因神經中的L1免疫反應性圖型與未損傷野生型神經中的GFAP免疫染色圖型相似。L1陽性的無髓鞘視網(wǎng)膜細胞神經節(jié)軸突存在于未損傷的野生型神經(A)中，圖C的標尺為50μM(A-C)。圖5描述雙免疫熒光顯微鏡法定位來自3426品系的轉基因動物(A、B和C)及野生型動物(D、E和F)的培養(yǎng)的星形細胞中的L1(A和D)和GFAP(B和E)。注意僅來自轉基因動物的細胞表達L1，而來自野生型動物的星形細胞為L1陰性。圖F的標尺為30μM(A-F)。圖6顯示(A)來自轉基因和野生型動物的損傷(損傷后15天)和未損傷視神經的蛋白印跡分析。將損傷(泳道1、3和5)或未損傷神經(泳道2、4和6)的25μg總蛋白上樣，并用抗L1的親和純化的多克隆抗體檢測。蛋白提取物從轉基因小鼠品系3426(泳道1和2)、3427(泳道3和4)及野生型動物(泳道5和6)中制備。與非轉基因的對照相比，轉基因動物中的L1表達增加。隨著視神經損傷后，在轉基因動物中發(fā)生L1的上調作用，而在野生型動物中L1的量下降。表觀分子量(kD)在左邊空白欄顯示。圖7描述培養(yǎng)在來自野生型(A和B)和轉基因(C和D)動物(3426品系)的視神經冷凍切片上的小鼠小腦神經元軸突外延的實例。A和C表示未損傷的視神經，而B和D表示損傷的視神經。圖D的標尺為50μM(A-D)。圖8描述和比較在來自野生型(WT)和轉基因動物(品系3426、3427和3418)的非損傷(c)和損傷(l)(損傷后28天)視神經的冰凍切片上維持著的小腦神經元的軸突長度。注意在轉基因動物切片上的軸突長度比在野生型動物切片上的軸突長度要長。在轉基因品系中，軸突總是在損傷的神經上比在非損傷的神經上要長，而軸突長度在野生型動物的非損傷和損傷神經上沒有顯出明顯的差別。注意在不同的轉基因品系中軸突長度與L1的表達水平成正相關(也可見蛋白印跡數(shù)據(jù))。顯示了來自一個代表性和實驗的平均值±平均值的標準誤差(樣本數(shù)超過12)圖9是沒有和用抗L1(抗L1)和小鼠肝細胞膜(抗肝臟的親和純化的多克隆抗體預保溫后，測定在野生型(WT)和轉基因動物的未損傷(c)和損傷(l)視神經(損傷后28天)的冰凍切片上保持的軸突長度的圖解。以在沒有用任何抗體預保溫的神經上的軸突長度為100％，在用抗體處理后獲得的相同神經切片上的軸突長度以對此值的相對值表示。發(fā)現(xiàn)在轉基因動物冰凍切片上的軸突長度，經L1抗體處理過的明顯降低(60％)。圖頂部的數(shù)字表示測定每一值用的神經總數(shù)平均值±平均值標準誤差來自至少雙份進行的4次獨立實驗。圖10描述和比較在缺乏抗體和將切片用抗L2(抗L1)和小鼠肝細胞膜(抗肝臟)親和純化的多克隆抗體預保溫后，從野生型(WT)和轉基因動物(3426品系)制備的星形細胞單層上的小鼠小腦(A)或雞DRG(B)神經元的軸突長度。以沒有用任何抗體預保溫的星形細胞上的軸突長度為100％，抗體處理后獲得的單層星形細胞上的軸突長度以對此值的相對值表示。在用L1抗體預保溫單層星形細胞后僅在轉基因星形細胞中可見軸突長度明顯降低(約40％)。平均值±標準誤差從雙份進行的二個獨立實驗的至少100個神經元中得到。*表示平均值與對照(不經任何抗體處理的野生型或轉基因的星形細胞)相比有顯著差異(p＜0.05，Mann-WhitneyU檢驗)。圖11表示體內視神經的軸突再生(0-2000μm)。將6-8周齡的GFAP-L1轉基因小鼠和野生型小鼠眼眶內壓碎處理，14天后用熒光素標記的生物素酯示蹤以通過順行標記法顯示視網(wǎng)膜神經節(jié)細胞軸突。每點表示一只動物。圖12描述體內視神經軸突再生(0-800μm)。將6-8周齡的GFAP-L1轉基因小鼠和野生型小鼠眼眶內壓碎處理，14天后用熒光素標記的生物素酯示蹤以通過順行標記法顯示視網(wǎng)膜神經節(jié)細胞軸突。每點代表一只動物。圖13顯示注射雞L1抗體到IMHV后對一次被動回避試驗任務的回避百分率(記憶保留)的影響。每一點代表在對應于訓練顯示的時間點上接受L1抗體(抗L1)(實圓圈)或生理鹽水(空方框)注射的一組鳥。所有動物均在訓練后24小時測定(*表示生理鹽水和抗體組間p＜0.05，X-)。圖14包括二個圖，描述在前30分鐘和后5.5小時注射IgI-IV和FN片段對被動回避任務的記憶保留的影響。所有動物在訓練后24小時測定。每組動物組以組方圖表示(*為p＜0.05，**為p＜0.005)。圖15包括一系列圖解，顯示抗L1(antiL1)的抗體對大鼠海馬CA1區(qū)切片中錐狀神經元的LTP的影響。a，未注射抗體的對照位點在TBS前和50分鐘后(箭頭)記錄的平均(n＝4)EPSP。b，在存在抗小鼠L1的兔多克隆抗體時，在TBS前和后50分鐘(箭頭)記錄的平均(n＝4)EPSP(Rathjen等(1984))，c，在L1抗體(IgG部分，6.2mg/ml○)，或者抗在CHO細胞中重組表達的免疫球蛋白樣區(qū)I-VI的多克隆抗體(Hynes(1992)細胞6911-25)(抗血清含大約1mg/ml的特異性抗體，)和下列對照存在下(1)對照LTP(沒有抗體，□)，(2)存在抗小鼠肝細胞膜的多克隆抗體的IgG部分(3.5mg/ml，●)，該抗體強烈地與大鼠海馬切片反應(Linder等(1983)自然305427-430)，(3)存在兔非免疫血清，和(4)存在L1抗體，但沒有用TBS誘導LTP(6.2mg/ml○；還見e、f)在TBS前后EPSP起始斜率隨時間變化的過程。結果以為基線值的百分率的EPSP起始斜率的平均數(shù)±S.E.M表示，基線值在TBS(n＝5)切片前20分鐘期間記錄得到，切片至少來自3只動物；存在L1抗體時的LTP值與對照LTP有差異，對照LTP與抗L1的抗體組的值相比為P＜0.001，而與抗免疫球蛋白樣區(qū)I-VI的抗體組相比為p＜0.01)。d，抗L1的多克隆抗體IgG部分對LTP的濃度依賴性降低(6.2mg/ml，○)；2mg/ml，●；0.6mg/rnl，▲；0.06mg/gl，□p＜0.0001)。作為對照，顯示來自抗肝細胞膜的多克隆抗體的結果(3.5mg/ml，■)。e，在沒有TBS時，使用抗L1的多克隆抗體前和之后60分鐘(箭頭)所記錄到的平均(n＝4)EPSP。f，在沒有TBS時，使用抗L1的多克隆抗體前和之后30分鐘(箭頭)所記錄到的平均(n＝4)細胞內興奮性突觸后電流(EPSP)。圖16說明免疫球蛋白樣結構域I-VI、多克隆NCAM抗體和寡甘露糖苷糖肽對LTP的影響。a，與對照LTP(20mMTris/HCl，pH7.6，□)相比，在L1的免疫球蛋白(Ig)樣結構域I-VI(216μg/ml，3.2mM；在20mMTris/HClpH7.6中，○；p＜0.01)和L1的纖連蛋白(FN)III型同源重復I-V(225μg/ml；3.8mM；在20mMTris/HClpH7.6，■)存在下，TBS前后EPSP起始斜率的隨時間變化的過程。b，在抗NCAM的抗體(1gG部分，3.9mg/ml，▲)，抗軸突蛋白-1的抗血清(●)和如下對照存在下，TBS前后EPSP起始斜率隨時間變化的過程，對照(1)非免疫兔血清(▲)，(2)非免疫兔血清的IgG部分(3.0mg/ml，◆)，以及(3)存在NCAM抗體(3.9mg/ml，□；p＜0.06)但不用TBS誘導LTP。c.在寡甘露糖苷糖肽(O)，來自無唾液酸胎球蛋白的對照糖肽(●)(二者均為100μM)存在下及缺乏糖肽(□)時，TBS前后EPSP起始斜率隨時間變化的過程。結果以換算為基線值百分率的EPSP起始斜率的平均數(shù)±S.E.M.表示，基線值在TBS(n＝5或6，切片至少來自3只動物)前20分鐘記錄得到。圖17圖解性描述L1抗體和寡甘露糖苷糖對早已建立的LTP和MNDA受體介導的突觸傳遞的影響。a.在L1抗體用于實驗整個過程(6.2mg/ml；O)或TBS后10分鐘開始使用時(6.2mg/ml；●)，TBS前后EPSP起始斜率隨時間變化的過程。b.在寡甘露糖苷糖用于實驗整個過程(100μM，O)或TBS后20分鐘開始使用時(100μM；●)，TBS前后EPSP起始斜率隨時間變化的過程。c在CNQX(30μM)存在下使用L1抗體前和后30分鐘(箭頭)所記錄到的平均(n＝4)NMDA受體依賴的EPSP。d在CNQX(10μM)存在下使用寡甘露糖苷糖類前和后60分鐘(箭頭)所記錄到的平均(n＝4)NMDA受體依賴的EPSP。圖a和b的結果以換算為基線值百分率的EPSP起始斜率平均數(shù)±S.E.M.表示，基線值在TBS前20分鐘期間記錄得到(n＝5，切片至少來自3只動物)。圖18描述克隆pX#2的4.43kbcDNA插入片段的核苷酸序列和小鼠CHL1推導的氨基酸序列。最長的開放閱讀框(bp296～bp3922)含以TGA終止密碼子終止的1209個氨基酸。表示信號肽(氨基酸1～24)和跨膜區(qū)(1082～1104)的2個疏水區(qū)已劃下線。2個箭頭表示從λgt11文庫分離得到的克隆311的5′和3′末端。天冬酰胺連接的糖基化的潛在位點(Hubbard和Ivatt，1981)在氨基酸序列下用實心菱形標示。免疫球蛋白(Ig)樣結構域用羅馬數(shù)字從I～VI標數(shù)在保守的色氨酸下。特征性的半胱氨酸用圓圈標示。FN-樣重復標數(shù)為F1～F5，特征性的色氨酸(F1；缺失，F(xiàn)2；W732，F(xiàn)3；W830，F(xiàn)4W936，F(xiàn)5；W1053)和酪氨酸/苯丙氨酸(FY682，F(xiàn)2Y781，F(xiàn)3F888，F(xiàn)4Y989，F(xiàn)5缺失)用方框標出。括號突出RGD和DGEA序列(分別為氨基酸殘基185～187和555～558)。非翻譯序列用斜體數(shù)字顯示。序列數(shù)據(jù)可從EMBL/Genebank/DDBJ的登記號X94310下得到。圖19描述小鼠CHL1的結構域結構、細菌表達的蛋白片段的編碼區(qū)和疏水性圖。(a)圖示表明從CHL1原始序列推導出的結構特征。數(shù)字用來表示在翻譯起始位點開始的氨基酸序列。從I～VI的Ig樣結構域用半圓表示(氨基酸數(shù)目指形成二硫鍵的半胱氨酸)，用框象征從1-5的FN樣重復(氨基酸數(shù)目指結構域邊界)。實圓圈顯示潛在的N-糖基化位點。信號肽和跨膜區(qū)用劃線框表示。(b)線條表示編碼在大腸桿菌中產生的重組蛋白的cDNA位置。(c)推導的氨基酸序列疏水性圖(Kyte和Doolittle，1982)顯示具有公認的疏水信號序列和跨膜結構域(*)的完整膜蛋白的獨特特征。正值表示疏水性。橫坐標所標的數(shù)字為氨基酸位置。圖20顯示L1家族分子的細胞內結構域的排列。從推測的跨膜區(qū)后的第一個氨基酸殘基開始的細胞內結構域序列，被排序為小鼠CHL1、小鼠L1、雞Nr-CAM、雞Ng-CAM、雞神經束蛋白、果蠅神經膠質蛋白、蓑L1.2。數(shù)字指CHL1的氨基酸的位置，灰色框表示在CHL1序列中導入的缺口。在大多數(shù)序列中出現(xiàn)的相同氨基酸用黑框標志。三個括號(I、II和III)系指高度保守的一段序列。圖21是小鼠和大鼠不同組織的CHL1和L1mRNA的RNA印跡分析(a)將從缺少小腦的腦(泳道1，5)，脊髓(泳道3，7)和背根神經節(jié)(泳道4，8)來的多聚(A)RNA(2μg)及來自9天齡具小腦小鼠(泳道2，8)的總RNA(10μg)用CHL1(1～4泳道)或L1(5～8泳道)核酸探針雜交。將從腎(9泳道)、脾(10泳道)、肝(11泳道)、胸腺(12泳道)來的多聚(A)*RNA(1μg)及來自9日齡小鼠的腸(13道)和肺(14泳道)的多聚(A)*RNA(0.5μg)用CHL1核酸探針雜交。(b)NGF誘導(1泳道)和未誘導(2泳道)的PC12細胞、COS-1細胞(3泳道)的總RNA(20μg)及9日齡(4泳道)和6天齡大鼠(5泳道)的小腦總RNA(30μg)用CHL1核酸探針雜交。RNA在左邊欄顯示。圖22表示抗CHL1的多克隆抗體的特異性和CHL1在不同組織中表達。(a)用對來自腦免疫純化的L1(1泳道)(2μg))、N-CAM(2泳道(2μg))、MAG(3泳道(2μg))和使用CHL1抗體進行陰離子交換層析純化的重組CHL1蛋白片段(4泳道(0.1μg)的蛋白質印跡分析。(b)從9日齡小鼠的腦(1泳道)、肝(2泳道)、肺(3泳道)、腎(4泳道)、和腸(5泳道)的粗膜去污劑的裂解物的可溶性(S)和不溶性(M)部分的蛋白印跡分析。在圖(b)左邊的數(shù)字指和腦(1泳道)及肝(2泳道)的CHL1免疫反應帶的分子量。分子量標準用kD為單位在左邊(a)和右邊(b)欄表示。圖23顯示瞬時轉染COS-1細胞的CHL1檢測。單層培養(yǎng)的CHL-1轉染(a)和模擬轉染(c)的COS-1細胞用抗CHL1的多克隆抗體免疫染色。(b，d)分別相對應于(a，c)的相差顯微圖。圖d標尺為30μm，從a-d。圖24描述用原位雜交分析對小鼠視網(wǎng)膜、視神經和小腦皮層切片中的CHL1和L1mRNA進行定位。在7日齡小鼠的視網(wǎng)膜中，位于神經節(jié)細胞層的神經節(jié)細胞(在a中的l)和位于內核層的無長突及水平細胞(在1中的2)可檢測到L1mRNA。在視網(wǎng)膜中的其它類型細胞或者在視神經中的膠質細胞不含有可檢測水平的L1轉錄物(a)。在神經節(jié)細胞和位于內核層內邊(即Vitread)的少數(shù)細胞每周可檢出CHL1mRNA(b)。位于視神經近側區(qū)(即近視網(wǎng)膜)的膠質細胞可被CHL1反義cRNA探針強烈標記，而位于更遠側區(qū)的膠質細胞僅每周才被標記上(b)。在2周齡小鼠的小腦皮層中，在分子層的星狀細胞和籃狀細胞中(mol)和內粒層的高爾基細胞和粒細胞中(Igld)可檢出L1轉錄物。CHL1轉錄物的分布圖形相似，除開在分子層的較薄部分幾乎見不到任何標記(b)。用CHL1正義cRNA探針雜交的切片沒有被標記(7日齡的視網(wǎng)膜和視神經，見c)。圖c標尺為100μm，a-c圖e標尺為150μm，d和e。圖25說明在星形細胞的培養(yǎng)物中的CHL1的免疫熒光顯微鏡法定位。培養(yǎng)的小鼠星形細胞的雙免疫標記用CHL1的多克隆抗體(a，d)和GFAP的單克隆抗體(b，e)進行，(c，f)分別對應于(a，b和d，e)的相差顯微圖。圖C和F的標尺為20μm，分別對應于a-c和d-f。圖26是去糖基化的CHL1的蛋白質印跡分析。來自7日齡小鼠腦粗膜的去污劑的裂解物的可溶(S)和不溶(M)部分與N-糖苷酶F(N)、O-糖苷(O)、兩種酶合用(N+O)或者沒有酶(-)溫育，然后在蛋白質印跡中和抗CHL1的抗體反應。分子量標準顯示在右邊空白處，單位為kD。糖基化和去糖基化的CHL1蛋白級分的分子量以kD為單位顯示于下面的盆中。圖27顯示來自腦組織的CHL1免疫沉淀物中MNK-1糖類的存在用CHL1的抗體將CHL1從9日齡小鼠腦的全腦組織的去污劑的裂解物中沉淀。腦裂解物(1泳道)和免疫沉淀物(2，3泳道)用SDS-PAGE分離，印跡，用抗HNK-1表位的312單克隆抗體(1，2泳道)或CHL1抗體(3泳道)溫育。分子量標準在右邊空白處顯示，單位為kD。圖28和L929轉染體共培養(yǎng)時海馬神經元的軸突外延將來自大鼠第18天胚胎的海馬神經元培養(yǎng)在亞鋪滿的單層的L929轉染子或親本L929細胞上。共培養(yǎng)11-12小時后，固定細胞，用412單克隆抗體(識別HNK-1糖的表位)或抗NCAM的多克隆抗體標記細胞。由于在這些培養(yǎng)物中神經元高度分叉的特點，為了總軸突長度的測定僅測定每一分叉上最長的軸突。(A)軸突生長被CHL1促進并被抗體抑制。使用(+AB)或不使用抗重組CHL1的多克隆抗體(純化的IgG500μg/ml，平板接種后45分鐘加入)，將神經元與CHL1轉染子(CHL1)或親本L929細胞(L929)及L1轉染子共培養(yǎng)。顯示了4-5次獨立實驗的平均總軸突長度。誤差棒是平均數(shù)的標準誤差。(B)不同的CHL1細胞系比L1更好地促進軸突外延。神經元培養(yǎng)在表達程度稍有不同的兩種不同的CHL1轉染子(CHL1細胞系1、CHL1細胞系2)、親本L929細胞(L929)及L1轉染子(L1)上。提供了以L929細胞作對照(ctr)的百分數(shù)表示的總軸突長度。誤差棒為平均數(shù)的標準誤。(C)軸突外延促進作用影響所有長度級別的軸突。提供了使用或不使用如(A)中提供的抗體處理，與CHL1轉化體(CHL1細胞系1和2)及親本L929細胞(L929)共培養(yǎng)的海馬神經元的總軸突長度的累積頻率分布圖。其軸突比某一長度x更長或相等的神經元的百分率(垂直軸)以作為軸突長度x的函數(shù)(水平軸)作圖。數(shù)值來自一次代表性的實驗。圖29和L929轉染體共培養(yǎng)的小腦神經元的軸突外延來自6-7日齡小鼠的小腦神經元在CHL1轉染體(CHL1)、不表達轉染CHL1的L929細胞(Mock)、親本L929或L1轉染體(L1)上培養(yǎng)20小時。細胞染色按已在圖7所述的方法進行。(A)CHL1促進小腦神經元的軸突外延。顯示的是三次實驗的總軸突長度平均數(shù)。誤差棒為平均數(shù)的標準誤。(B)CHL1促進小腦神經元的軸突外延也比L1更好。以L929細胞作對照(ctr)的百分數(shù)提供總軸突長度，誤差棒為平均數(shù)的標準誤(C)CHL1增加小腦神經元的軸突外延影響所有各級大小的軸突。以作為軸突長度x(水平軸)的函數(shù)，作出具有軸突比某一長度x更長或相等的神經元的百分率的總軸突長度的累積頻率分布圖(垂直軸)顯示的數(shù)值來自一次代表性的實驗。圖30用可溶的CHL1處理的海馬神經元的軸突外延海馬神經元在多聚-L-賴氨酸覆蓋的蓋玻片上培養(yǎng)12小時，培養(yǎng)時添加CHL1轉染子(CHL1)、親本L929細胞(L929)、或者L1轉染體(L1)的粗膜制備物的上清(40μg/ml總蛋白)。軸突長度的染色和測定按已所述的方法(圖7)進行。(A)來自L929轉染子的可溶CHL1促進每個細胞最長軸突和所有軸突的外延。顯示了最長軸突的絕對長度和總軸突長度。數(shù)值為3次獨立實驗的平均數(shù)。誤差棒為平均數(shù)的標準誤差。(B)可溶的CHL1促使軸突數(shù)目略有增加。將總軸突長度換算為用來自親本L929細胞(ctr)處理的海馬神經元軸突長度的百分數(shù)作圖。數(shù)值為3次獨立實驗的平均數(shù)。誤差棒為平均數(shù)的標準誤差。(C)可溶的CHL1也影響所有各級長度的軸突外延。顯示的是來自一次代表性實驗的總軸突長度的累積頻率分布圖。圖31L929轉染子的CHL1和L1蛋白的凝集反應數(shù)量分析及穩(wěn)定性。(A)S2細胞轉染子的凝集反應數(shù)量分析。為檢測凝集反應，CHL1-(CHL1)(ctr)和L1-(L1)轉染細胞在培養(yǎng)基中培養(yǎng)18h(密度約為3×106細胞/ml)，用(+ind)或不用(-ind)CuSO4誘導轉基因表達。在溫育開始和結束時用血球計數(shù)器統(tǒng)計顆粒數(shù)。凝集反應的百分數(shù)按指數(shù)(1-N/NO×100)計算。N18和NO分別表示溫育期結束或開始時的顆粒數(shù)。數(shù)值至少為4次獨立實驗的平均數(shù)。誤差棒為標準偏差。(B)L929轉染子凝集反應的動力學。將CHL1-轉染細胞(CHL1)、CHL1轉染不表達的細胞(Mock)、親本L929細胞(L929)和L1轉染細胞(L1)用低濃度的胰酶-EDTA處理從組織培養(yǎng)物上分離，清洗，在聚苯乙烯管中37℃溫育。每隔30分鐘從每一樣本吸取一等分試樣，用血球計數(shù)器統(tǒng)計顆粒數(shù)。結果按圖(A)所述表示。顯示的數(shù)值至少為3次獨立實驗的平均數(shù)。線條為標準偏差。本發(fā)明優(yōu)選的實施方案詳述具體地說，本發(fā)明涉及一些在本文被稱作“中樞神經系統(tǒng)神經生長調節(jié)劑”(CNGMs)的制劑的應用，尤其是在本文被定義為促進中樞神經系統(tǒng)(中樞神經系統(tǒng))軸突外延的一類神經細胞粘附分子。通常，由于在膠質細胞中存在抑制性分子信號，成熟的中樞神經系統(tǒng)的神經元不能再生。本發(fā)明的制劑和方法能用于克服這種抑制作用并促進中樞神經系統(tǒng)軸突外延。本發(fā)明的制劑包括并可選自任何能調節(jié)或促進中樞神經系統(tǒng)軸突外延的任何細胞粘附分子，特別是屬于免疫球蛋白超家族的分子。更具體而言，這些分子選自介導非Ca2+依賴的神經細胞粘附的免疫球蛋白超家族的成員，包括L1、N-CAM和髓鞘相關糖蛋白。本發(fā)明也涉及具有促軸突活性的這些分子的片段、類似物、同源物、衍生物和模擬物。特別優(yōu)選這些片段的結構基元和包括與纖連蛋白III型同源重復相似的結構域(特別是重復1-2)，和免疫球蛋白樣結構域(尤其是結構域I-II、III-IV和V-VI)的類似物。作為本發(fā)明的制劑，尤其是L1CAM家屬的成員顯示出嗜同結合作用，制劑和它們的拮抗劑，特別是它們的抗體可用作這些制劑有關的受體激動劑，因而可被以用相同的方式用在診斷和臨床應用中并用于與試劑本身相同的目的。因此，L1起受體的作用，其受體可用作激動劑，以促進本文所述的軸突外延以協(xié)助特別是中樞神經系統(tǒng)中的神經再生。在L1的抗體能用于鑒別在本文將作制劑的神經識別分子L1CAM家屬的其它成員的能力中，進一步說明了這種性能，而且本發(fā)明相應地擴展到利用上述抗體鑒別、分離和表征的分子。因此，本文下面鑒別為中樞神經系統(tǒng)神經生長調節(jié)劑的這類物質被認為在其成員中包括例如L1的CAMs和本文后來所述的例如CHL1的其類似物的抗體。本發(fā)明在一個方面涉及在體內分化星形細胞中中樞神經系統(tǒng)神經生長調節(jié)劑(CNGMs)或神經細胞粘附因子的異位表達。已發(fā)現(xiàn)在上述星形細胞的單層培養(yǎng)物和成年小鼠視神經的非損傷和損傷的冰凍切片及還在轉基因動物體內的視神經壓碎實驗中，這些分子增強軸突外延。增加的促軸突外延的能力與CNGM異位表達的水平成比例。這可通過對本發(fā)明不同的轉基因品系表達不同的轉基因編碼的CNGM基礎水平的比較，和視神經損傷后接著增加CNGM表達的相關性來證明。應當理解盡管損傷和非損傷的視神經適于本發(fā)明中使用，同樣地能使用神經系統(tǒng)的任何部分，包括腦和脊髓的各部分。軸突外延依賴于由星形細胞的CNGM表達水平，這說明了CNGM在轉基因動物中促進軸突外延而產生的特異的影響。軸突外延被多克隆CNGM抗體而不是被針對小鼠肝細胞膜的抗體所抑制進一步支持這種特異性，尤其是因為這兩種抗體能很好地對轉基因動物的神經元和星形細胞的細胞表面反應。在一優(yōu)選的實施方案，CNGM是L1。L1生物學效應能被L1抗體所抑制，這表明在轉基因的星形細胞表面，L1以反式構型具有嗜同活性。此外，不和雞背根神經節(jié)神經元反應的L1種特異性抗體抑制在轉基因的星形細胞上的這種神經元細胞類型的軸突外延。這些發(fā)現(xiàn)明確地把L1確認為反式活化的活性分子并表明由一般缺乏L1表達的膠質細胞異位表達L1明顯地在體外增強軸突外延。在體內一般不表達L1的膠質細胞上轉基因介導的軸突外延的增強作用顯示，成年哺乳動物中樞神經系統(tǒng)的膠質細胞能更有助于軸突外延。因此，膠質衍生的促軸突生長的分子隨成熟而丟失(Smith等(1986)比較神經病學雜志。25123-43；Smith等(1990)發(fā)育生物學138377-390)似乎可由識別分子的表達而被補償，該識別分子一般在成年的哺乳動物外周神經系統(tǒng)的膠質細胞中高度表達(Niecke等(1985)；Bixby等(1988)細胞生物學雜志107353-362；Seilheimer等(1988)細胞生物學雜志107341-351)。來自本發(fā)明轉基因品系的成熟星形細胞的表型，可針對遭受損傷后施旺細胞相關的重新表達L1的能力而被修飾。由施旺細胞引起的L1表達增加可能通過損傷后自分泌機制上調神經營養(yǎng)素所介導(Seilheimer等(1987)EMBOJ61611-1616)。相似地，由培養(yǎng)基中的星形細胞產生的L1表達能被TGF-β和NGF上調(Saad等(1991))通過用GFAP-L1轉基因產生小鼠的方法，成熟星形細胞對神經損傷的不反應性用促軸突外延的分子L1的上調作用克服。L1的表達可能特別對中樞神經系統(tǒng)有髓鞘神經的軸突外延有利，一般情況下有髓鞘神經含有幾種抑制軸突生長的分子(Schachner等，發(fā)育神經生物學展望，印刷中；Schwab等(1995)神經科學年述16565-595)。本發(fā)明說明星形神經膠質細胞和少突神經膠質細胞的抑制作用至少部分地被本文定義的制劑的促軸突外延特性所克服，尤其是通過被異位表達的L1活性得以闡明。通過星形細胞表達L1也似乎能補償由少突神經膠質細胞所致的抑制效應。因此，對允許和不允許的分子信號可能沒有必要定位于相同類型細胞上以發(fā)生軸突外延。反之，上述分子信號可分布在不同的細胞類型中。L1和其它促軸突生長的分子的細胞和分子操作可能因而允許在損傷或疾病后增強成年哺乳動物中樞神經系統(tǒng)的再生能力。正如前面所述，本發(fā)明涉及促進在中樞神經系統(tǒng)中神經生長，包括為再生因損傷或疾病而失去的結構，以及再生那些表現(xiàn)為不完全或未成熟形成的結構和組織所需要的生長。本發(fā)明的制劑還顯示出本文后面所闡述的神經保護或神經保護作用，例如能被施用于抑制或抵抗各種病因學造成的神經退化或丟失。本發(fā)明涉及包含或通過經基因治療或相似的方法促進某些制劑表達，或者適當而有益地以藥用組合物形式外源施用制劑來治療損傷或患病的中樞神經系統(tǒng)結構來運送本發(fā)明制劑的構建物和組合物。在后一方面，盡管已確認目前已被鑒別的成員，如L1和N-CAM似乎嗜同種結合，并因而可證明用表達的方法傳輸更有利，但一般認為某些制劑，當以這樣的方法施用時能起促生長效應。本發(fā)明期望涉及可能的途徑和方案。也應當理解本發(fā)明涉及CNGM分泌細胞在調節(jié)中樞神經系統(tǒng)中的神經外延、再生和神經存活中的應用，諸如某些可溶的CNGMs和其片段，其同族分子也包括在本發(fā)明之中。因此，如果在本發(fā)明中出現(xiàn)時，下列術語具有下面的含義。術語“制劑”、“中樞神經系統(tǒng)神經生長調節(jié)劑”、“CNGM”、“神經識別分子”、“識別因子”、“識別因子蛋白”、“神經粘附分子”和未特別列出的任何變異體可在本文互換使用，并且貫穿整個申請中被使用。權利要求涉及的蛋白質物質包括一種或多種蛋白，并涉及那些具有前述的氨基酸序列和在本文權利要求書中提出的活性全貌的蛋白。前述術語也包括上述蛋白的活性片段、同源物、衍生物、模擬物和類似物，包括與所述制劑表現(xiàn)相似的小分子。因此，同樣可考慮顯示基本相同或改變活性的蛋白質。這些修飾可為有意設計的，例如通過定點誘變獲得修飾，或者可偶然出現(xiàn)，例如經過在產生復合體或稱之為亞單位的宿主中突變得到的那些修飾另外，術語“中樞神經系統(tǒng)神經生長調節(jié)劑”“CNGM”、“神經識別因子”、“識別因子”、“識別因子蛋白”和“神經粘附分子”指包括在本文具體引述的范圍之中的蛋白質及基本上同源的類似物和等同的變異體。本文描述的氨基酸殘基優(yōu)選為“L”異構體形式。不過，以“D”異構體形式存在的殘基能取代任何L-氨基酸殘基，只要所需的免疫球蛋白結合的功能特性被多肽保持。NH2指存在于多肽的氨基端的游離的氨基基團。COOH指存在于多肽的羧基端的游離的羧基基團。為與標準的多肽命名一致，生物化學雜志2433552-59(1969)，氨基酸殘基的縮寫示于在下列對應表中對應表符號氨基酸單字母三字母YTyr酪氨酸GGly甘氨酸FPhe苯丙氨酸MMet甲硫氨酸AAla丙氨酸SSer絲氨酸IIle異亮氨酸LLeu亮氨酸TThr蘇氨酸VVal纈氨酸PPro脯氨酸KLys賴氨酸HHis組氨酸QGin谷氨酰胺EGlu谷氨酸WTrp色氨酸RArg精氨酸DAsp天冬氨酸NAsn天冬酰胺CCys半胱氨酸應該注意的是所有的氨基酸殘基序列在本文用通式表示，其左和右的方向為氨基端到羧基端的常規(guī)方向。此外，應該注意的是在氨基酸殘基序列起點或終止的破折號表示接下一個或多個氨基酸殘基的序列的一個肽鍵。提供上表以表示的三個字母和一個字母的相互關系，它們在本文可能交替出現(xiàn)?！皬椭谱印笔瞧痼w內DNA復制的自主單位作用，即在其自身控制下能復制的任何遺傳元件(如，質粒、染色體、病毒)。“載體”是一個復制子，如質粒、噬菌體或粘粒，另一DNA片段可粘附于載體上，以便造成附加片段的復制?！癉NA分子”系指要么以單鏈形式或雙鏈螺旋存在的脫氧核糖核苷酸(腺嘌呤、鳥嘌呤、胸腺嘧啶或胞嘧啶)的聚合物形式。該術語僅指分子的一級和二級結構，但并不限制其成為任何特別的三級形式。因此，該術語包括已發(fā)現(xiàn)的雙鏈DNA、特別是線性DNA分子(例如，限制性片段)、病毒、質粒和染色體。在討論特別的雙鏈DNA分子結構時，在本文可根據(jù)一般常規(guī)方式，僅給出沿DNA非轉錄鏈的5′到3′方向的序列來描述序列(即，具有與mRNA同源的序列的鏈)?！皬椭破瘘c”系指參與DNA合成的那些DNA序列。DNA“編碼序列”是一種雙鏈DNA序列，當置于適當?shù)恼{節(jié)序列控制之下時，該序列在體內可轉錄和翻譯成多肽。編碼序列的邊界由5′端(氨基)的起始密碼子和3′端(羧基)的翻譯終止密碼子決定。編碼序列可包括，但并不局限于，原核生物的序列、來自真核生物mRNA的cDNA、來自真核生物(如哺乳動物)DNA的基因組DNA序列以及甚至合成的DNA序列。聚腺苷酸化信號和轉錄終止序列通常位于編碼序列的3′端。轉錄和翻譯控制序列為DNA調節(jié)序列，如啟動子、增強子、聚腺苷酸化信號、終止子等，它們供作在宿主細胞中表達編碼序列之用。“啟動子序列”是在細胞中能結合RNA聚合酶，并啟動下游(3′方向)編碼序列轉錄的DNA調節(jié)區(qū)。為解釋本發(fā)明，啟動子序列在其3′端以轉錄起始位點為界，擴大到上游(5′方向)到包括為啟動上述背景下可檢測水平的轉錄所必需的最小數(shù)目的堿基或單元。在啟動子序列中會找到一個轉錄起始位點(通常由核酸酶S1作圖確定)以及負責結合RNA聚合酶的蛋白結合結構域(共有序列)。真核生物啟動子常常，但不總是含“TATA”框和“CAT”框。除了-10和-35的共有序列外，原核生物啟動子含Shine-Dalgarno序列?！氨磉_控制序列”是控制和調節(jié)另一DNA序列的轉錄和翻譯的DNA序列。在細胞中當RNA聚合酶將編碼序列轉錄成mRNA時，編碼序列在轉錄和翻譯控制序列的“控制之下”，mRNA然后翻譯成由編碼序列編碼的蛋白?！靶盘栃蛄小笨砂ㄔ诰幋a序列前。該序列編碼處多肽N端的信號肽，信號肽與宿主細胞聯(lián)絡以指導信號肽到細胞表面或者分泌多肽到培養(yǎng)基中，而該信號肽在蛋白離開細胞前被宿主細胞切除。發(fā)現(xiàn)信號肽與許多源于原核和真核生物的蛋白有關。術語“寡核苷酸”，在本文用作指探針，定義為由2個或多個核苷酸，優(yōu)選多個3個核苷酸組成的分子。其確切的大小依賴于許多因素，最終取決于寡核苷酸的最后功能和使用。術語“引物”在本文系指寡核苷酸，其或者在純化的限制性消化中自然產生，或者合成產生。當置于引物延伸產物合成的條件下，引物能起合成起點作用，它與核酸鏈互補。即在核苷酸、如DNA聚合酶的誘導劑和合適的溫度和pH存在下，引物被誘導。引物要么是單鏈或雙鏈，必需足夠長以在誘導劑存在下引導所需的延伸產物合成。引物確切的長度取決于許多因素，包括溫度、引物來源和使用方法。例如，作診斷應用時，取決于靶序列的復雜性，典型的寡核苷酸引物含15-25或更多的核苷酸，盡管它可能含較少的核苷酸。本文所選的引物“基本上”與特定的靶DNA序列的不同鏈互補。這意味著引物必須有足夠的互補性，能與它們各自的鏈雜交。因此，引物序列沒有必要反映模板的確切序列。例如，非互補的核苷酸片段可與引物的5′端相連，引物序列的剩余部分與該鏈互補。另一方面，只要引物序列與鏈的序列有足夠的互補性能與此雜交，由此形成合成延伸產物的模板，那么非互補的堿基或更長的序列可散置在引物中。在此所用的術語“限制性內切核酸酶”和“限制酶”系指細菌的酶，每種酶在特異的核苷酸序列或其附近切割雙鏈DNA。當上述DNA已被導入進細胞中時，則細胞被外源或異源DNA所“轉化”。轉化的DNA可整合或不整合(共價連接)到組成細胞基因組的染色體DNA上。例如，在原核生物、酵母和哺乳動物細胞中，轉化DNA可保持在如質粒一樣的附加因子上。至于真核細胞，穩(wěn)定轉化的細胞是轉化DNA已經整合進染色體的細胞，這樣轉化DNA由子代細胞通過染色體復制遺傳，真核細胞建立由包括含轉化DNA的子代細胞群體組成的細胞系或克隆的能力可說明了這種穩(wěn)定性?！翱寺　笔莵碜詥渭毎蚬餐婕毎?，由有絲分裂形成的細胞群體?！凹毎怠笔悄茉隗w外穩(wěn)定生長許多代的原代細胞的克隆。當至少約75％的核苷酸與確定長度的DNA序列匹配時(優(yōu)選的至少約80％，最優(yōu)選的至少約90或95％)，二種DNA序列為“基本上同源”。基本同源的序列可用序列數(shù)據(jù)庫已有的標準軟件比較序列予以鑒別，或者如在確定為對于特別體系的嚴謹條件下DNA雜交實驗中鑒別。確定合適的雜交條件是現(xiàn)有技術中的技術。如見Maniatis等，同上；DNA克隆，VolsI&amp;II，同上；核苷酸雜交，同上。DNA構建物的“異源”區(qū)是指未發(fā)現(xiàn)與自然界中的較大有聯(lián)系的較大DNA分子中的可鑒別的DNA片段。因此，當異源區(qū)編碼一種哺乳動物基因時，該基因通常由在來源生物的基因組中不是位于哺乳動物基因組DNA側翼的DNA相接。異源編碼序列的另一實例是自然界未發(fā)現(xiàn)其本身編碼序列的構建物(例如，基因組的編碼序列含有內含子的cDNA，或者具有與天然基因不同密碼子的合成序列)。等位變異或自然發(fā)生的突變事件不產生在本文所述的DNA異源區(qū)?！翱贵w”是包括抗體和其片段的任何免疫球蛋白，它能結合特異表位。術語包括多克隆抗體、單克隆抗體和嵌合抗體，最后提及的抗體進一步詳述見美國專利Nos4,816,397和4,816,567?！翱贵w結合位點”是抗體分子的結構部分，由特異結合抗原的重和輕鏈可變和高度可變區(qū)組成。本文以各種語法形式采用的短語“抗體分子”意指既是完整的免疫球蛋白分子又是免疫球蛋白分子的免疫學活性部分。作為實例的抗體分子是完整的免疫球蛋白分子，基本上完整的免疫球蛋白分子和含互補位免疫球蛋白分子的那些部分，包括本領域熟知的如Fab、Fab′、F(ab′)2和F(v)，這些部分優(yōu)選用于本文所述的治療方法中。通過熟知的方法對基本完整的抗體分子分別進行木瓜蛋白酶和胃蛋白酶的蛋白裂解反應來制備抗體分子的Fab和F(ab′)2部分。例如見Theofilopolous等的美國專利，號為4,342,566。Fab′抗體分子部分也已熟知，其從F(ab′)2部分產生，接著用巰基乙醇還原連接二條重鏈部分的二硫鍵，隨后用如碘乙酰胺的試劑對所得蛋白硫醇進行烷基化而來。本文優(yōu)選的是含完整抗體分子的抗體。以各種語法形式出現(xiàn)的短語“單克隆抗體”指的是僅有一種能和特異抗原起免疫反應的抗體結合位點的抗體。因而典型的單克隆抗體顯示對任何能起免疫反應的抗原有單結合親和性。因此，單克隆抗體可能含有許多抗體結合位點的抗體分子，每一免疫特異性針對不同的抗原，如雙特異(嵌合的)單克隆抗體。短語“藥學上可接受的”系指當給人服用時，分子實體和組合物生理學上可忍受，通常不產生過敏性反應或相似的不適反應，如胃不適、頭暈等。本文所用的短語“治療有效量”意味著足以預防，并優(yōu)選降低至少約30％，較優(yōu)選至少50％，最優(yōu)選至少90％的臨床上靶細胞群體S堋活性的明顯變化，或者其它的病理學特征如血壓升高，發(fā)燒或可伴其存在和活性的白細胞計數(shù)的量。當表達控制序列控制和調節(jié)該DNA序列的轉錄和翻譯時，DNA序列為“操作性連接”到表達控制序列上。術語“操作性連接”包括在將要被表達DNA序列前具有合適的起始信號(如，ATG)，并維持正確的閱讀框以允許在表達控制序列控制之下表達DNA序列和產生由DNA序列編碼的所需產物。如果操作者希望插入到重組DNA分子中的基因不含有合適的起始信號，上述的起始信號可被插在基因前。術語“標準雜交條件”系指對雜交和洗膜二者來說，鹽和溫度條件基本相等，為5×SSC和65℃。在一個方面，本發(fā)明涉及表達CNGM或神經識別分子尤其是L1，并且優(yōu)選地在星形細胞中表達的轉基因動物。這些動物增加中樞神經系統(tǒng)神經外延的能力。本發(fā)明也包括一種檢測系統(tǒng)，該檢測系統(tǒng)用于篩選通過干擾或增強CNGM神經識別活性而有效地調節(jié)靶哺乳動物細胞的神經外延的潛在藥物?！吧窠涀R別活性”或“神經粘附活性”意味著CNGM與另一分子結合后的任何生物學效應，包括對第二信使的胞內效應。在一個實例中，通過和對照比較，可將測試藥物和活化中樞神經系統(tǒng)神經生長調節(jié)劑的配基一起施用到細胞樣本中，或者給表達中樞神經系統(tǒng)神經生長調節(jié)劑的轉基因動物服用，確定其對調節(jié)劑與任何化學樣品或與測試藥物的結合活性的影響。至少一種本發(fā)明中樞神經系統(tǒng)神經生長調節(jié)劑，尤其是L1，的確定的特性是參與細胞內信使穩(wěn)定的基態(tài)水平的變化，包括Ca2+、pH和環(huán)核苷酸，以及蛋白激酶的活性變化，如蛋白激酶C、ppboc-src、酪蛋白II型激酶和已知磷酸化L1的另一激酶。更重要的是能修改檢測系統(tǒng)，鑒定要么在細胞質或者在細胞核中能與CNGMs或蛋白結合的藥物或其它物質，從而抑制或增強轉錄活性。該檢測可用于開發(fā)對特定的細胞活性，如神經生長或增加突觸效能有特異的藥物或者在時間和水平上增強上述活性的藥物。例如，上述藥物可用于調節(jié)對損傷有反應的神經生長，或者治療其它病理學病，如治療帕金森病、ALS、享廷頓舞蹈病和阿爾茨海默病的神經退化性疾病在另一個具體實施方案中，本發(fā)明研究了中樞神經系統(tǒng)神經生長調節(jié)劑活性的激動劑和拮抗劑。特別是，抑制神經元識別CNGM和L1能力的制劑和分子能用于阻斷神經生長，而上述生長是禁忌的，并如前面所述，含上述制劑的藥學組合物可以直接施用于靶位點。在另一實施方案中，激動劑可能是具有L1的結構域部分，特別是纖連蛋白III型同源重復2和3的序列的多肽，或者是針對那個區(qū)的抗體。這些抗體的每一個可潛在地應用于如L1的特殊CNGM具有進行嗜同結合能力之處(即，L1能結合自身，因而L1的抗體和L1片段本身能與L1結合)。本發(fā)明的一種診斷用途涉及在測定中應用本發(fā)明的CNGMs篩選蛋白激酶抑制劑。因為本文描述的CNGMs的活性是被磷酸化的，它們能夠的也有可能被特異的磷酸酶脫磷酸化。因此，阻斷特異性激酶或磷酸酶是調節(jié)這些神經識別蛋白活性的藥理學干涉途徑。同樣地，本發(fā)明涉及開發(fā)抗CNGMs的抗體，包括自然產生和重組制備的抗體。例如，可應用這些抗體篩選表達文庫，以獲得基因和編碼CNGMs的基因。上述抗體可能包括由熟知的遺傳技術制備的多克隆和單克隆抗體，以及雙特異(嵌合)抗體、和包括其他使它們適宜于用于與它們調節(jié)神經生長能力有聯(lián)系的其它診斷用途的功能抗體。特別地，由于它們與蛋白結合的特殊能力，抗中樞神經系統(tǒng)神經生長調節(jié)制的抗體可被選擇并包括在本發(fā)明的范圍之中，因而神經生長調節(jié)劑或據(jù)信與其有因果聯(lián)系的特異多肽的活性，通過應用適當標記數(shù)量的生長因子調節(jié)劑或抗體或其類似物，通過后面討論的分析方法直接進行分析。因而，CNGMs、它們的類似物和任何拮抗劑或對此產生的抗體能與各種診斷技術結合使用，包括免疫測定法，如應用由任一放射性物質加入所標記，用硼氫化鈉還原或放射性碘化標記的CNGM抗體的放射免疫測定法。在免疫測定中，可制備對照量的拮抗劑或相應的抗體或相似物的用一種酶，用一種特異結合配偶體和/或放射性元素標記，然后可導入細胞樣品中。標記材料或其結合配偶體有機會和標本中的位點反應后，所得到的物質可用熟知的技術檢測，這些技術可隨附加標記的性質而改變。例如，對于上述下列蛋白材料的目的，可選擇抗CNGMs的抗體并適當?shù)剡\用于實例中的分析方法中。在放射性標記，如用同位素3H、14C、32P、35S、36Cl、51Cr、57Co、59Fe、90Y、125I和186Re的實例中，可利用目前已知的可得到的計數(shù)方法。在標記是酶的例子中，可用本領域熟知的目前應用的比色法、分光光度測定法、熒光分光光度測定法、電流測定法、或氣體不定量法的任一種技術完成檢測。本發(fā)明包括一種檢測系統(tǒng)，它可被制備為檢測試劑盒的形式以定量分析神經生長調節(jié)劑的存在范圍，或者鑒別可模擬或阻斷它們活性的藥物或其他制劑。該系統(tǒng)或檢測試劑盒可包括按本文討論的放射性和/或酶技術之一制備的標記級分，將標記到神經生長調節(jié)劑、它們的激動劑和/或拮抗劑一種或多種另外的免疫化學試劑上，其中至少之一是游離或固定的配基，能任意和標記級分、其標記配偶體、一種待測的級分或它們的結合配偶體結合。在另一個實例中，本發(fā)明涉及某些治療方法，這些方法以中樞神經系統(tǒng)神經生長調節(jié)劑、其(或它們的)亞基、或其活性片段，或者確定擁有同樣活性的制劑或其他藥物的活性為基礎。第一種治療方法和CNGM、其活性片段、類似物、同源物、衍生物或模似物的存在和活性而導致中樞神經系統(tǒng)神經生長的促進作用有關，并且該方法包括施用對在宿主中促進中樞神經系統(tǒng)發(fā)育、再生或康復有效量的一種能調節(jié)CNGM產生和/或活性的制劑，相反地，可施用針對CNGM或蛋白的藥物或其他中和結合配位體來抑制或預防不需要的神經生長。而且，參與CNGMs或蛋白磷酸化或去磷酸化的特異激酶和磷酸酶的作用調節(jié)提供了一種調節(jié)基于CNGM/蛋白的活化作用，能伴有增強療效的調節(jié)劑或蛋白活性的方法。更具體地說，在本文一般所指的治療方法可包括通過藥用組合物的施用，治療各種病理學的或其他細胞機能障礙和紊亂的方法，藥用組合物可包括中樞神經系統(tǒng)神經生長調節(jié)劑或其亞單位活性的有效抑制劑或增強子，或者包括如根據(jù)本發(fā)明的另一方面制備和應用的藥物篩選測定法而開發(fā)出的其他相等有效的藥物。例如，針對中樞神經系統(tǒng)神經生長調節(jié)劑或蛋白的藥物或其他結合配偶體可施用于抑制或增強結合及第二信使活性。如上提述，本發(fā)明涉及L1CAMs的整個家族的發(fā)現(xiàn)，尤其是對L1的類似物名為CHL1。CHL1包括一個N端信號序列、6個免疫球蛋白(Ig)樣結構域、和4.5個纖連蛋白III型(FN)樣重復、一個跨膜結構域和一個C端，很可能細胞內的結構域約為100個氨基酸。CHL1在其胞外結構域中與雞Ng-CAM最為相似(約40％氨基酸的同一性)，接著相似的順序是小鼠L1、雞神經束蛋白、雞Nr-CAM、果蠅神經膠質蛋白、及蓑L1.1(分別為37～28％的氨基酸同一性)、小鼠F3、大鼠TAG-1和大鼠BIG-1(約27％氨基酸同一性)。與Ig超家族(如N-CAM、DCC、HLAR、rse)的其他成員的相似性為16～11％。細胞內結構域與小鼠和雞的Nr-CAM，小鼠和大鼠的神經束蛋白最為相似(約50％的氨基酸同一性)，接著相似的順序是雞神經束蛋白和Ng-CAM、果蠅神經膠質蛋白、及蓑L1.1和L1.2(約40％氨基酸的同一性)。除了前已識別的L1家族成員中(小鼠/人L1/大鼠NILE；雞Ng-CAM；雞/小鼠Nr-CAM；果蠅神經膠質蛋白；蓑L1.1和L1.2；雞/小鼠神經束蛋白/大鼠ADGP)高度全面的同源性和保守調節(jié)結構外，根據(jù)確定為2個鄰近的Ig樣結構域和FN樣重復的之內和之間距離的保安氨基酸殘基位置之間的氨基酸數(shù)目確定L1的特性標準。這些顯示6個Ig樣結構域中和鄰近的4個FN樣重復的共線性，F(xiàn)N樣重復在L1和含這些組件的分子之間明顯保守，這些組件(命名為L1家族盒)包括F3亞組(小鼠F3/雞F11/人CNTN1；大鼠BIG-1/小鼠PANG；大鼠TAG-1/小鼠TAX-1/雞軸突蛋白-1)的GPI連接形式。過去介紹為N-CAM樣分子的結直腸癌分子(DCC)與L1家屬盒一致。CHL1享有L1家族成員之中的其他結構特征是高度的N-葡糖苷連接的糖類(約為其分子量的20％，它包括HNK-1糖類結構和包括185kD的主帶及100和125kD的較小片段的蛋白片段帶型。至于L1家族成員之外，在神經系統(tǒng)和較晚發(fā)育階段觀察到CHL1的優(yōu)勢表達。為更詳細地說明本發(fā)明的優(yōu)選實施方案提供以下實例。然而，它們絕不應認為是限制本發(fā)明的廣泛范圍。實施例1GFAP-L1轉基因和轉基因小鼠的產生膠質纖維酸性蛋白(GFAP，Eng等，(1971)腦研究，28351-354)在小鼠中樞神經系統(tǒng)發(fā)育的晚期階段主要由星形細胞表達(Landry等(1990)神經科學研究雜志25194-203),因此GFAP基因的調節(jié)序列用于指導轉基因小鼠的成熟星形細胞的神經細胞粘附分子L1的表達。GFAP-L1轉基因(圖1)僅編碼神經細胞粘附分子L1，因為GFAP基因做ATP已被突變，隨L1編碼序列3′端之后的是翻譯終止和聚腺苷酸化信號(Toggs等(1994)自然367188-193)。這個構建物用于建立轉基因小鼠的三個不同的品系，命名為3418、3426和3427。如前所述，將小鼠L1cDNA(Moos等(1988)自然334701-703)插入到修飾過的鼠膠質纖維酸性蛋白(GFAP)的外顯子1中。(Toggs等(1994)自然367188-193)含蛋白的整個編碼序列和250個3′端未翻譯核苷酸的4.05kb的小鼠L1cDNA與修飾過的GFAP-L1轉基因融合。用SfiI消化將14.5kbGFAP-L1轉基因從修飾過的克隆載體中切下，接著電泳和從瓊脂糖凝膠中電洗脫。純化的DNA用T5E0.1(5mMTris-HCl，pH7.4，0.1mMEDTA)稀釋到終濃度為2μg/ml。大約2pl稀釋DNA顯微注射到從CB6F1雌性(超數(shù)排卵的)與C57B/6J雄性交配而來的受精卵的雄原核中。顯微操作存活的卵按下列所述的方法(Hogan等(1986)小鼠胚胎的操作，冷泉港實驗室，紐約)轉移到假孕寄養(yǎng)母鼠的子宮中。實施例2DNA印跡分析通過從尾活組織檢查分離的基因組DNA的DNA印跡分析(Southern(1975)分子生物學雜志98503-517)，分析小鼠轉基因整合進小鼠的基因組中。讓轉基因建立者小鼠交配，按同樣的方法篩選幼鼠以建立轉基因品系，將10μgDNA樣品用BamHI或者EcoRI和XbaI消化，接著在0.7％瓊脂糖凝膠上電泳分離，在堿性條件下轉移到HybondN+膜上(Amersham)。L1cDNA的3.3kb的EcoRI片段或從A1.5質粒純化(Maxwell等(1989)生物技術7276-280)的SV40晚期剪切和聚腺苷化位點的330bpHindIII片段，通過隨機引物法(BoehringerMannheim)用32πα-CTP標記，以用作探針。在5×SSPE，5×Denhardt溶液，0.5％(w/v)SDS和0.1mg/ml超聲的非同源DNA中，65℃下進行預雜交1小時。雜交過夜。所有DNA印跡最終嚴謹漂洗條件為65C下0.1×SSPE和0.1％SDS(w/v)。實施例3RNA印跡分析用致死劑量的水合氯醛麻醉致死成年小鼠(12周齡)，取出大腦，迅速地冷凍在液氮中。通過在液氮中研磨組織分離總細胞RNA。4摩爾的硫氰酸胍加到研磨過的組織中?？俁NA的分離按所述方法進行(Chomczynski等(1987)分析生物化學162156-159；Pagliusi等AMOG神經生物學研究雜志22113-119)。RNA的產量根據(jù)260nm的吸光值估測。將10μgRNA在1％的瓊脂糖甲醛凝膠中分級分離以用于RNA印跡分析(Thomas(1980)美國國家科學院院報77201-205)。隨機引物標記的L1cDNA探針用于同時檢測內源的6kbL1mRNA(Tacke等(1987)神經科學通訊8289-94)和轉基因來源的4.2kbL1mRNA。用ImageProgram(NIH，研究服務分部，NIMH)對原始底片的掃描影像(Arcus掃描儀，Agta-Gavaert)進行RNA印跡的光密度分析。來自轉基因動物全腦總RNA的RNA印跡分析顯示預期來自轉基因mRNA(圖2)的大小為(4.2kb)的L1轉錄物。這些轉錄物明顯地與為6kb和源自有絲分裂后神經元的內源L1mRNA不同。光密度法分析顯示，與內源L1mRNA水平相比(定級為100％)，源自轉基因L1mRNA的水平在品系3426、3427和3418中，分別為34％、13％和8％。實施例4動物對冷凍切片、免疫細胞化學和原位雜交實驗的培養(yǎng)物來說，對照動物取自年齡配對的正常C57bl/6J小鼠或非轉基因的同窩鼠。為了分離小腦神經元和制備星形細胞培養(yǎng)物，采用6天齡ICR非轉基因的幼鼠。背根神經節(jié)(DRG)的神經元從8天齡雞胚中制備。實施例5原位雜交為證實轉基因動物星形細胞體內表達L1，用原位雜交法分析視神經。選擇視神經是因為其僅含膠質細胞，沒有神經細胞體。一般而言，體內的星形細胞在發(fā)育的任何階段缺乏L1的表達(未發(fā)表的資料)。為在新鮮冷凍腦切片的冰凍切片中檢測L1mRNA，通過體外轉錄產生地高辛配基標記的cRNA(Dorris等(1993)組織化學99251-262)。將編碼L1細胞外部分的序列(Moos等(1988))亞克隆到pBluescriptKS+(stratagene)載體中。用XhoI或XbaI線性化所得的質粒后，分別用T7和T3啟動子轉錄L1插入片段而產生反義和有義cRNA探針。為產生GFAPcRNA探針，將編碼蛋白N端的GFAPcDNA的1.2kb片段(Lewis等(1984)美國國家科學院院報812743-2745；由N.JCowan博士惠贈)亞克隆到pBluescriptKS+載體中。通過轉錄所產生的質粒產生反義和有義cRNA探針，分別從T3和T7啟動子用EcoRI和XhoI線性化。為改善組織穿透作用，在堿性水解的條件分級反義和有義探針，得到平均片段長度約為300個核苷酸。按別處所述的方法(Dorris等(1993)；Bartsch等，神經科學雜志，印刷中)。在從成年動物制備(12周齡)的視神經的切片上進行。在非轉基因的對照中，L1轉錄物僅在視網(wǎng)膜神經細胞中檢測到，但在視神經中在損傷前(圖3A)和損傷后(圖3B)均未檢測到。相形之下，L1mRNA由來自轉基因小鼠視神經的膠質細胞表達(圖3C)。在神經遠端有髓部分和近端無髓部分均可檢測到L1mRNA陽性細胞。當與神經有髓遠端部分比較時，雜交信號的強度在無髓近端部分更高。用GFAPcRNA探針觀察無髓區(qū)和有髓區(qū)之間陽性細胞的相似分布和標記強度的相似差異性(比較圖3C和E)。不過，轉基因動物視神經中L1mRNA陽性細胞的數(shù)目總是明顯地比GFAP陽性細胞的數(shù)目低，有可能是由于L1cRNA探針的低敏感性。另一方面，L1mRNA的可檢測水平僅可在GFAP高水平表達的星形細胞中得到。這種閾值效應可能由于設計的GFAP-L1轉基因僅含2kb的GFAP5′側翼序列。體外研究顯示，轉錄起始位點上游2和6kb之間的區(qū)域含有增強GFAP驅動融合基因在C6細胞中表達的序列單元(Sarid(1991)神經科學雜志28217-228)。最后，GFAP外顯子1的修飾，包括大L1cDNA的導入可能降低與GFAPmRNA比較而言的嵌合mRNA的穩(wěn)定性并改變由位于修飾區(qū)上游和下游的調節(jié)GFAP序列所起的作用。視神經損傷后，L1表達的上調作用在轉基因的視神經(圖3D)而未在非轉基因的視神經(圖3B)中觀察到。表達L1的細胞數(shù)目和L1雜交信號的強度在相同的轉基因品系的不同個體中相似，但不同的轉基因品系有變化。與RNA印跡分析所獲的結果一致(見上)，L1mRNA陽性細胞在品系3426中最為豐富，基次為品系3427，最后為品系3418。在不同的品系中轉基因表達水平的這種變異性可能與許多因素有關，尤其是位于不同的轉基因整合位點兩側的鄰位宿主染色質區(qū)引起的效應(Proudfoot(1986)自然322562-565；Reik等(1987)自然328248-251；Sapienze等(1987)自然328251-254)。實施例6抗體業(yè)已描述了抗小鼠L1的多克隆兔抗體的產生和在L1免疫親和柱上的純化(Rathjen等(1984)；Martini等(1988))及抗小鼠肝細胞膜的多克隆抗體的制備(Lindner等(1983))；Pollerberg等(1985)?？笹FAP的小鼠單克隆抗體可商業(yè)購得(BoehringerMannheim)。對于蛋白印跡分析，通過辣根過氧化物酶連接的羊抗小鼠或兔抗體肉眼觀察多克隆和單克隆抗體(Dianova，Hamburg，德國)。對于免疫細胞化學法，使用異硫氰酸熒光素或異硫氰酸四甲基羅丹明結合的羊抗兔抗小鼠抗體檢測初級抗體(Dianova)。用于原位雜交的地高辛配基標記的cRNA探針通過連接針對地高辛的Fab片段的堿性磷酸酶來肉眼觀察(BoehringerMannheim)。實施例7神經元在冰凍切片上的維持為了分析是否來自轉基因動物的視神經比來自野生型動物的視神經更有助于軸突外延、小腦神經元被維持在損傷和對側非損傷視神經的冰凍切片上(圖7)。6～16周齡小鼠的視神經按Bartsch等，(1989)比較神經病學雜志284451-462所述的方法制備。簡言之，用液氮把損傷和非損傷的視神經包埋和冷凍在無血清激素已知的培養(yǎng)基中(Fischer(1986b)神經科學通訊28325-329)。組織切片(厚14μm)在Frigocut270冰凍切片機上(Jung-Reichardt)縱向切出，鋦在聚-L-賴氨酸包被(Sigma，0.001％在水中)的無菌玻璃蓋玻片上，在一無菌的小室中空氣干燥2-3小時。用培養(yǎng)基清洗切片5分鐘后，將從六日齡ICR小鼠來的Percoll梯度純化的小腦神經元(Keilhauer等(1985)自然316728-730)(100μl培養(yǎng)基中有6×104個細胞)加到每一蓋片上。細胞維持在37℃，5％CO2和95％空氣的濕潤環(huán)境的培養(yǎng)箱中。軸突外延還在抗體存在下測定。將切片與多克隆L1抗體或抗小鼠肝細胞膜的多克隆抗體(100μg/ml，用培養(yǎng)液廣泛透析和稀釋)在37℃預溫育1小時。移去抗體后，切片小心地用培養(yǎng)液清洗(室溫下5次，每次5分鐘)，然后加Percoll梯度純化的小腦神經元。2天后，冰凍切片培養(yǎng)物用在PBS中4％的多聚甲醛室溫固定30分鐘，測定軸突的長度。為避免測定中的“邊際效應”，我們沒有評價位于外緣包括蓋片20％的切片。用半自動的計算機影像分析程序(IBAS，Kontron，Zeiss)，測定了所有生長在這些切片上的軸突長度并算出每個神經細胞體的平均軸突長度。對每次實驗和視神經(損傷或非損傷)來說，生長在轉基因動物神經上的軸突平均長度和對照動物的相應值有關。用至少2只轉基因動物的損傷和對側非損傷的神經，進行了12次獨立的實驗。對轉基因動物來說，與非損傷的神經比較觀察到在損傷的神經上軸突長度增加。相反，在野生型動物損傷和非損傷視神經的軸突長度沒有明顯差異(圖8)。培養(yǎng)在來自轉基因動物未損傷視神經上的神經元軸突始終比培養(yǎng)在來自野生型動物未損傷神經上的神經元軸突要長。當用來自品系3426的切片時，觀察到軸突長度最大的增加約為300％。相似地，當和來自野生型動物的損傷神經比較時，在轉基因品系損傷神經上的軸突長度增加高達400％。轉基因視神經促軸突外延的活性與L1的表達水平成正相關(圖8)。表達高水平L1蛋白的品系3426的非損傷視神經比相比之下低水平表達L1的品系3427和3418(以降低順序)的非損傷視神經，更有力地增加軸突生長。在品系3426和3427的損傷視神經上(損傷28天后)，軸突生長比在野生型動物損傷的視神經上高4倍。在損傷視神經的神經生長增加對品系3426和3427相似(盡管和品系3427比較，損傷后品系3426顯示L1蛋白表達增加25％)的發(fā)現(xiàn)可能表明，在品系3427中L1的蛋白水平已經足以用來最大程度地誘導來自小腦神經元的軸突外延。從野生型動物來的非損傷視神經與抗L1或小鼠肝細胞膜的多克隆抗體預溫育沒有明顯地影響軸突長度(圖9)。相反，當來自轉基因品系3426的非損傷或損傷的視神經的冰凍切片和L1抗體預溫育時，軸突長度降低多于50％(圖9)。強烈地與視神經和小腦神經元結合的抗肝細胞膜的抗體(資料未顯示)并沒有顯示相似的抑制效應。令人感興趣的是，與沒有先前抗體預溫育來自野生型動物的受損傷視神經比較，來自野生型動物的損傷視神經與L1抗體預溫育誘導增加軸突生長。在相同的條件下抗小鼠肝細胞膜的抗體沒有顯示明顯的增加，這表明添加細胞表面反應性抗體本身并不干擾軸突外延。實施例8神經元在星形細胞單層培養(yǎng)物上的維持為了制備星形細胞單層，將來自6日齡小鼠的前腦清除各種非神經組織，按他處所述的方法解離(Schnitzer等，(1981)神經免疫學雜志1429-456；Fischer等(1982a)神經科學通訊29297-302；Keilhauer等(1985)。將細胞在BME培養(yǎng)基(Gibco)中，在聚-L-賴氨酸包被的(Sigma，0.001％在水中)細胞培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)14～20天，該BME培養(yǎng)基含10％馬血清和2mM谷氨酰胺。通過每次換培養(yǎng)基時搖晃培養(yǎng)瓶和以4天的間隔亞培養(yǎng)細胞移去污染的少突神經膠質細胞和神經元。培養(yǎng)14天后對GFAP免疫染色顯示多于90％的細胞是星形細胞。培養(yǎng)14天后，細胞被胰酶消化，并在聚-L-賴氨酸包被的玻璃蓋片單層培養(yǎng)5天。然后，將來自6日齡小鼠Percoll梯度純化的小腦神經元(Schnitzer等(1981))和來自8日齡雞胚胎的背根神經節(jié)(DRG)(Seilheimer等(1988)細胞生物學雜志107341-351)的神經元加到星形細胞單層上。與小腦神經元共培養(yǎng)6天和DRG神經元共培養(yǎng)12天后，共培養(yǎng)物用在PBS中的2％多聚甲醛固定，按實施例7所述的方法分析軸突長度。還在源自轉基因(品系3426)或非轉基因對照的單層星形細胞培養(yǎng)物中研究了來自小鼠小腦神經元或雞背根神經節(jié)(DRG)神經元的軸突外延(圖10，表1)。表1培養(yǎng)在從野生型小鼠(WT)和轉基因品系3426制備的星形細胞單層上的小腦神經元和背根神經節(jié)(DRG)神經元的軸突長度小腦神經元DRG神經元<顯示了沒有用任何抗體預保溫或用抗L1的多克隆抗體(抗L1)或抗小鼠肝細胞膜抗體(抗肝臟)處理后在星形細胞上的軸突長度。平均值±標準偏差來自一次四份重復二次獨立進行的實驗的至少100個神經元。當與使用野生型星形細胞的軸突長度比較時，在轉基因星形細胞上小腦或DRG神經元的軸突長度分別高約15％或50％(表1)。抗肝細胞膜抗體不影響來自野生型或轉基因動物的星形細胞單層上的軸突長度(圖10，表1)。星形細胞單層與L1抗體預溫育沒有明顯影響來自野生型動物細胞上的軸突長度。相反，它降低生長來自轉基因動物細胞上的小腦神經元或DRG神經元的軸突長度約40％。在本文中值得注意的是在本研究所用的直接抗小鼠L1的多克隆抗體和來自雞的神經元沒有反應(Martini等，1994a；資料未顯示)。不過，借助于免疫熒光分析，可顯示這些抗體如L1抗體與自轉基因動物的星形細胞及與小鼠小腦神經元一樣有效地結合(資料未顯示)。實施例9免疫熒光和Aurion-GP免疫金顯微術新鮮冷凍橫或縱切的野生型和轉基因動物視神經或星形細胞單層的L1和GFAP免疫染色按所述方法進行(Bartsch等(1989))為了雙標記法，我們首先用L1抗體(在PBS，1％BSA中，2μg/ml)4℃溫育活星形細胞30分鐘。用70％甲醇在-20％下滲透細胞10分鐘后，細胞和GFAP抗體4℃溫育30分鐘。為在冰凍切片培養(yǎng)實驗中定量軸突長度，根據(jù)廠家的說明(Aurion，免疫金試劑和輔助習慣標記法，Wageningen，荷蘭)略作修改，使用Aurion免疫R-Gent銀增強染色法。簡言之，培養(yǎng)物用4％多聚甲醛的PBS中室溫固定10分鐘，用50mM甘氨酸的PBS中溫育10分鐘，然后在封閉緩沖液(BB，0.5％BSA在PBS中)中處理15分鐘。用BB洗3次，每次5分鐘后，細胞和用BB稀釋的L1抗體(2μg/ml)室溫溫育30分鐘。接著，培養(yǎng)物用BB洗3次，每次5分鐘，在室溫下加用BB以1∶20稀釋的第二抗體1小時。用蒸餾水洗3次后，培養(yǎng)物用2％戊二醛的PBS室溫固定10分鐘，用蒸餾水洗3次。然后室溫下加入1∶1混合的增強劑和顯色劑。出現(xiàn)反應產物后，蓋片用蒸餾水洗3次，用甘油封片。在非轉基因小鼠的視神經中，L1免疫反應性局限在無髓視網(wǎng)膜神經節(jié)細胞軸突上(Bartsch等，(1989))。在來自轉基因動物未損傷的視神經中，也發(fā)現(xiàn)與細胞體和放射狀細胞外延有關的弱的L1免疫反應性(圖4A)。在轉基因的視神經中的這種L1免疫反應性強度損傷后明顯增加(圖4B)，并與在非損傷(圖4C)或損傷(未顯示)的野生型神經中找到的GFAP免疫反應性的分布相似。在制備自6日齡轉基因動物前腦的星形細胞培養(yǎng)物中，另外分析了L1的表達。自野生型動物的星形細胞上沒有可檢測到的L1免疫反應性(圖5D)。相反，L1陽性細胞存在于來自轉基因動物的培養(yǎng)物中(圖5A)。如由雙免疫染色所示，相同的細胞也證明對GFAP陽性(圖5B和E)，表明表達L1的細胞的確是星形細胞。因為L1的免疫染色在活細胞上進行，似乎有可能在轉基因動物中，L1在體內也暴露在星形細胞的細胞表面。實施例10蛋白印跡分析為進一步定量在GFAP-L1轉基因小鼠中L1的表達量，在蛋白印跡上分析來自野生型和轉基因成年小鼠的非損傷和損傷(損傷后15天)視神經勻漿物的去污劑提取物(圖6)。來自8周齡動物損傷(損傷15天后)和對側非損傷的視神經被清除不含非神經組織，然后冷凍在液氮中。應注意的是僅用神經有髓遠端區(qū)，而不用L1免疫反應性的神經無髓或部分有髓近端區(qū)。在4℃用BransonB15超聲器超聲5分鐘前，凍融神經10次。然后將組織在勻漿緩沖液中(1％TritonX-100，2M尿素，5mM芐脒，0.1mM碘乙酰胺，1mM苯甲基磺酰氟，溶在PBS中的5mM-對甲苯磺酰賴氨酰氯甲酮鈉)用Dounce勻漿器勻漿。勻漿物以16,000g，4℃離心15分鐘變清。按Wessel等(1984)所述的方法，將上清用甲醇/氯仿處理以沉淀蛋白。測定上清液中的蛋白含量(Pierce)。在還原條件下7％板膠上SDS-PAGE后，蛋白(25μg)通過蛋白印跡用多克隆L1抗體(0.4μg/ml)分析。辣根過氧化物酶連接的二抗(2μg/ml)由ECL蛋白印跡檢測試劑盒(Amersham)檢測。免疫印跡的光密度分析用ImageProgram(NIH，研究服務分部，NIMH)，在原始底片的掃描影像(Arcus掃描儀，Agfa-Gavaet)進行。免疫印跡的光密度分析說明在轉基因動物未損傷視神經中的L1表達比在野生型動物未損傷視神經中高約40％和13％(分別為品系3426和3427)。與野生型動物損傷視神經比較，在損傷的轉基因神經中的L1表達高310％和200％(分別為品系3426和3427)。來自野生型動物的損傷和對側未損傷的視神經之間比較顯示、L1蛋白表達在損傷側面降低約40％。相反，當與非損傷對側面比較時，L1的蛋白量在品系3427和3426的損傷神經中增加了約30％。對非損傷和損傷的視神經來說，在品系3426中L1的表達水平比在品系3427中分別高約35％和25％。實施例11視神經體內軸突生長6-8周齡的老GFAP-L1轉基因小鼠和野生型小鼠眼眶內壓碎，14天后，用熒光素標記的生物素酯通過順行標記法示蹤標記視網(wǎng)膜神經節(jié)細胞軸突。結果在圖11和12顯示。每一個點代表1只動物。實施例12神經細胞粘附分子L1的纖連蛋白III型同源重復2和3的邊界部分鑒定被為促軸突生長和信號轉導的結構域為確定涉及軸突外延的神經細胞粘附分子L1的結構域，制備抗L1的單克隆抗體并研究它們對培養(yǎng)物中的小腦神經元軸突外延的影響。當11個抗體被底物包被時，只有抗體557B6同L1一樣有力促進軸突生長，增加細胞內Ca2+水平和刺激肌醇磷酸的轉換，其中抗體557.B6識別位于在纖連蛋白III型同源重復2和3之間的邊界的包含氨基酸818～832的一個合成肽表示的表位。這些發(fā)現(xiàn)暗示軸突外延和這些第二信使的變化互相關聯(lián)。上述的相關性被Ca2+通道拮抗劑和百日咳毒素能抑制L1和抗體557.B6所致的軸突外延所證實。這些觀察首次表明結合于細胞表面L1的獨特位點作為明顯的信號轉導結構域，增加肌醇磷酸的轉換和提高胞內Ca2+水平，其中通過該信號轉導區(qū)，識別事件似乎被匯集以觸發(fā)軸突外延。實施例13在神經移植的外周神經中的L2/HNK-1免疫反應性前運動軸突有關的施旺細胞的優(yōu)先表達在成年小鼠中，糖類表位L2/HNK-1(下文稱為L2)通過髓鞘化腹根和肌肉神經的施旺細胞來表達，但很少由背根或皮膚神經的施旺細胞的髓鞘化的來表達。由于被底物包被的L2糖脂促進培養(yǎng)運動神經元而不是感覺神經元的外延，因而L2可通過體內再生運動軸突影響肌肉神經的優(yōu)先移植。因此，通過指導運動或感覺軸突進入8周齡小鼠股神經的肌肉和皮膚分支中來分析再生軸突對由神經移植的施旺細胞引起的L2表達的影響。來自皮膚分支的再生軸突并不導致在肌肉或皮膚神經分支中免疫細胞化學上可檢測的L2表達。來自肌肉分支的軸突再生導致由皮膚分支的少數(shù)施旺細胞引起的L2弱表達，而促進由肌肉分支的許多施旺細胞引起的L2強表達。因而在它們與運動軸突接觸而表達L2的能力上以前和運動軸突聯(lián)系的髓鞘化施旺細胞與以前和感覺軸突聯(lián)系的髓鞘化施旺細胞不同。在神經移植的關鍵階段這種L2表達的上調作用可能提供運動軸突再生進入合適的肌肉通路，比那些再生進入不合適的感覺通路的軸突具有優(yōu)勢。實施例14L1鞏固在小雞中對被動回避任務的記憶在一次試驗被動回避任務中，如果小亮珠包有苦味的氨茴酸甲脂時，學會了抑制它們啄小亮珠的趨向性的訓練數(shù)目的小雞，導致了時間依賴的細胞和分子級聯(lián)，在前腦的2個不連續(xù)區(qū)，中間內側超紋狀體腹溝(IMHV)和Lobusparolfactorius(LOP)中，重建突觸前和后的要素中達到了頂點(Rose(1991)神經科學動向14390-397)。級聯(lián)涉及由增強巖藻糖摻入所證實的2種明顯的糖蛋白合成波，其在訓練后，在IMHV和LPO中發(fā)生變化的次數(shù)。2種波對用于回避任務的長時(即，加24小時)記憶保留是必需的，其中通過啄試驗中的干珠小雞來證實記憶遺忘，否則它們將回避以前的苦珠。假如L1在介導細胞-細胞接觸中有作用，進行本研究是為了確定L1是否是參與糖蛋白合成的任一種或二種波和學習有關的糖蛋白，及對記憶形成是否是必需的。如果真是這樣，在與訓練有關的適當時間施用抗L1的抗體將阻止長時記憶必需的突觸重建，因此產生對任務的遺忘。相似地，如果L1分子的細胞外區(qū)域在突觸重建和穩(wěn)定化需要的識別和粘附過程中起作用，那么與外源分子嗜同結合的外源使用的細胞外結構域片段可能干擾這種過程?？贵w和片段按照已建立的免疫接種方法(Rathjen等(1984)進行免疫接種，通過用免疫親和純化的L1(Ng-CAM，8D9)免疫接種在兔中制備多克隆抗體。再用8D9單克隆抗體(Lagenaur和Lemmon(1987)美國國家科學院院報8477533-7757)柱，使用建立的方法(Rathjen等(1984))從一日齡雞腦中分離L1。用G蛋白瓊脂糖凝膠(PharmaciaLKB)按廠家的說明，從第三次免疫接種后所獲的血清中分離抗體。顯示有6個免疫球蛋白樣(Ig-I-VI)和5個纖連蛋白III型同源重復(FN1-5)在大腸桿菌中的重組表達的融合蛋白按Appel等(1993)所述的方法制備雞亞細胞部分的十二烷基磺酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)和免疫印跡將全部來自數(shù)日齡雞腦的腦勻漿、粗膜、可溶性部分(Burchuladze等(1990)腦研究535131-138)和突觸后密體(Murakami等(1986)神經化學雜志46340-348)的50μg蛋白，在還原條件下的5-15％聚丙烯酰胺梯度凝膠上用SDS-PAGE(Laemmli(1970)自然227146-148)分離，然后按(Burnette(1981)分析生物化學112195-203)的方法將它們轉移到硝酸纖維素膜上。在與用含5％脫脂奶粉，pH7.2的Tris-緩沖鹽溶液以1∶000稀釋的L1抗體溫育過夜后，按前述方法(Scholey等(1993)神經科學55499-509)檢測免疫反應性帶。訓練和測驗步驟將在溫箱中孵化兩種性別的數(shù)日齡POss結實小雞成對養(yǎng)在小圈中，按Lossner和Rose(1983)神經科學雜志4113571363)所述的方法，預先訓練小雞啄小(2.5mm)白珠，然后訓練啄用氨茴酸甲酯包被的較大(4mm)鉻珠。啄苦味的鳥顯示刻板的厭惡反應，激烈搖頭，并遠離該珠。訓練后24小時，通過顯示與訓練中相同的干鉻珠測驗每只動物。在動物回避試驗珠中顯示被動回避學習能力的保留。在這種方案的每次重復試驗中，訓練和檢測了24～36只小雞。雖然有時在注射生理鹽水的小雞中輕微降低回避率，80％以上的訓練過、未注射的小雞在這些條件下檢測時一般回避珠子。相反，用水包被的珠訓練出的小雞試驗時拼命地啄干珠，它們的回避值很少是5～10％以上。所有訓練和檢測由一個不知道預先處理動物的實驗者按常規(guī)進行。注射L1抗體、FN1-5和IgI-VI片段在0.9％生理鹽水中透析過夜，調整濃度L1為1mg/ml和片段為250μg/ml。小雞從每半球10μlL1抗體接受雙側顱內注射進中間內側超紋狀體腹部(IMHV)，對照動物接受相似的生理鹽水注射。應用特別設計的頭夾和袖式Hamilton注射器獲得準確的輸送IMHV(Davis等(1982)藥理生物化學。行為學17893-896)。訓練或檢測前接受這種不論是生理鹽水還是抗體體積的注射的小雞未顯示明顯的行為影響，訓練中仍準確地啄珠。新孵化小雞的大腦的胞外大體積意味著這種體積的注射可被很好耐受，并可獲得沒有泄漏的效果。以前的報告證實(Scholey等(1993))注射后數(shù)小時，抗體從注射點緩慢擴散。注射設置的準確性通過死后對大腦的肉眼檢查進行常規(guī)檢驗。在實驗的每次重復中，采用注射生理鹽水和抗體或片段的小雞的平衡組。在L1實驗中，在與訓練有關的8個時間點中的一點；訓練前2小時或30分鐘，或者訓練后+1小時、+3小時、+4小時、+5.5小時、+8小時或+12小時用生理鹽水或抗體注射小雞組。根據(jù)以前的觀察，可預見在或者訓練前30分鐘或者訓練后5.5小時注射的鳥中，任何效果均可觀察到，在這些時間點上重復的數(shù)目相應地較大(對于抗體注射分別為N＝17，28，17，19，18，21，19和18)。在-30分鐘或者+5.5小時注射L1片段FN1-5和IgI-VI，在24小時時檢測保留率。由X2的統(tǒng)計學法比較注射生理鹽水和L1抗體或L1片段的小雞各組的保留率。結果顯示在圖13和14中。實施例15在長期強化中涉及L1和NCAM用標準技術制備來自鹵代烷烴麻醉雄性Wistar大鼠(180-220g)橫向海馬切片(400μm)。將切片放置在一個界面小室中，開始時讓其室溫下在高滲(320mOsm/kg)的人工腦脊液(ACSF)中恢復45分鐘。然后將水浴溫度升高到30C，培養(yǎng)基改變?yōu)閴毫φ５腁SCF(307mOsm/kg)，其中含(用mM表示)NaCl，1240；KCl，25；MgSO4，2.0；CaCl2，2.5；KH2PO4，1.25；NaHCO3，26.0；葡萄糖，10；蔗糖，4；用95％O2/5％CO2(pH7.4)冒泡；灌流率0.75ml/min。通過放在CA1區(qū)放射層中的彎曲鉑依線(直徑50μm)刺激舍弗爾并行/連合纖維。測試刺激包括每30秒持續(xù)100μs的單相脈沖，調整刺激強度以得到30％的最大EPSP幅度(沒有重疊群體峰的最大EPSP)靠2根位于離每邊刺激電極約300μM遠的玻璃微吸管(2MNaCl，1～5MΩ)，從CA1放射層記錄EPSP的值穩(wěn)定記錄至少15分鐘后，用改進的微注射系統(tǒng)(Nanoliter注射儀，WPI)將抗體或蛋白片段噴到在一個記錄電極(小心調整電極在30％)附近(50～75μm)的CA1樹突區(qū)上，除非另有說明，每10秒連續(xù)傳送5nl直到實驗結束。由于明顯的原因洗去抗體后接著誘導LTP是不可能的，但在每一切片中，通過從沒有使用抗體的第二電極的記錄可證實是否能誘導LTP。雖然噴射微吸管的頂端沒有穿過切片，當噴射開始時有時可觀察到EPSP幅度的小量降低這種強度人為現(xiàn)象與噴射物質的性質無關。除非另有說明，將蛋白在20mMPBSpH7.4中透析，濃度系指吸管濃度。開始微噴射后20分鐘，用一爆發(fā)刺激(TBS)范式誘導LTP，該范式由間隔4秒的3串波組成；每串由100Hz5個脈沖的10個高頻率爆發(fā)及爆發(fā)由200ms所分隔組成(Reichardt等(1991)神經科學年評14531-570)。刺激脈沖的持續(xù)時間在TBS中加倍。LTP的誘導可完全被10μMD(-)-2-氨基-5-戊酸(D-AP5；Tocris)的灌流所阻止。應用EPC-9膜片鉗增強儀及“盲目的”膜片鉗方法，從CA1神經元獲得全細胞記錄。溫浴溫度為30℃。用1.5mmOD硼硅酸鹽玻璃拉膜片電極，其電阻為3～8MΩ。吸管既不用火光滑也不加層。電極常規(guī)地放在含(用mM)葡糖酸鉀，129；KCl，5；MgCl2，1；CaCl2，1；N-1-(羥乙基哌嗪)-N′-(2-乙磺酸)，5；1，2-雙(2-氨基苯氧基)乙烷-N，N，N′，N′-四乙酸(BAPTA)，5；Na-ATP，10和Na-GTP，0.3，用KOH調整pH為7.3的溶液中，系列電阻沒有被補償。反應以3～4個信號的平均值取樣，或者打印出來作肉眼分析，或者貯存在硬盤中作進一步分析。用設計比較和對比分析的方差分析進行統(tǒng)計學評價；時間被認為重復測定一個水平的從屬變量。按前所述產生抗L1(Rathjen等(1984))，抗IgI-VI(Hynes等(1992))和抗肝細胞膜的抗體(Linder(等(1983))。結果顯示在圖15按所述(Hynes等(1992)的方法進行L1的Ig樣區(qū)域和FNIII型同源性重復I-V在細菌中的表達和純化。按所述(Larson等(1986)科學232985-988；Bailey等(1992)科學256645-649)的方法產生抗NCAM和軸突蛋白-1的抗體。從核糖核酸酶B來的寡苷露糖苷糖肽和來自脫唾液酸球蛋白(asialofetuin)的對照糖肽的制備已有描述(Larson等(1986)。結果顯示在圖16。在使用抗體或糖肽前起始20分鐘，應用30μM非NMDA阻斷劑6-氰基-7-硝基喹喔啉-2，3-二酮分離NMDA受體介導的EPSP在每次實驗結束時，可證實D(-)-2-氨基-5-膦?；焖?D-AP5；30μM；Tocris)完全抑制這些反應。結果在圖17顯示。實施例16L1產生神經保護效應進行實驗進一步說明L1對中樞神經系統(tǒng)神經組織的活性。具體地說，將小鼠中腦細胞等份試樣進行平板接種，并培養(yǎng)在具有如下制備的培養(yǎng)基的4個不同的板上第一個對照板僅用聚-L-賴氨酸包被；第二個板有用聚-L-賴氨酸和L1包被；第三個對照板用聚-L-賴氨酸和層粘連蛋白包被；第四個板用聚-L-賴氨酸、層粘連蛋白和L1包被。所有平板接受等量細胞并培養(yǎng)在相同的條件下。7天后，將這些平板都進行染色以證實多巴胺的存在，然后觀察。用L1包被的板顯示比對照更多的生長，為200％～400％。用層粘連蛋白包被的板顯示更大的軸突外延，但細胞并不比用L1包被的板多。結果說明和暗示L1產生很大的神經保護效應，因為通過生長的細胞數(shù)目測定的細胞成活率明顯地比對照增加。實施例17可溶性L1(L1-FC)在神經存活中有功能活性并且是有效的制劑按在神經元1457-66，1995所述的步驟以重組L1-FC融合蛋白的形式在COS細胞中制得可溶性L1。重組蛋白由蛋白A親和層析純化，并被用作覆蓋在塑料瓶上的底物，或者作為以約1-10μg/ml加到培養(yǎng)基中的溶性分子。體外維持培養(yǎng)7天后檢測來自第17天的大鼠胚胎中腦神經元的軸突外延和存活。多巴胺能神經元由免疫染色多巴胺-β-羥化酶(DBH)加以識別，并用IBAS形態(tài)測定設備定量。將加有可溶性L1-Fc的培養(yǎng)物維持在聚-DL-鳥氨酸(PORN)上，并將底物覆蓋的L1-Fc加到在前已涂PORN的頂部(在Appel等，神經科學雜志(34764-4775，1993中已描述的條件下)。NCAM-Fc用作對照。表DBH-神經元在體外7天后的存活和軸突生長</tables>平均值至少來自3次獨立實驗±SEM-數(shù)量來自單位視野--測定每個神經元所有軸突(總軸突長度)的長度(以μm表示)神經細胞之間的識別是機能神經系統(tǒng)發(fā)育的一個重要的必要條件。識別分子在細胞表面表達，在那里它們介導鄰近細胞之間的相互作用，如鈣粘著蛋白，或者介導細胞表面和胞外基質之間的相互作用，如整聯(lián)蛋白(Takeichi，1991；Ruoslathi，1988；Hynes，1992)。識別分子最重要的家族包括免疫球蛋白(Ig)樣結構域。Ig樣結構域反映了免疫球蛋白和細胞粘附分子的共同祖先，其中兩者涉及特異的識別事件(Edelman，1970)。在神經系統(tǒng)中，迄今為止Ig超家族包括多于24種不同的分子。有些含Ig樣結構域的分子在細胞外結構域中有許多功能；作為細胞因子和神經營養(yǎng)素的受體既有識別特性又有高親和力的感受功能(Tannahill等，1995；Pulido等，1992)。Ig樣結構域的三維結構與FN樣重復相似(Main等，1992；Leahy等，1992)，它也是幾種胞外基質分子中。如纖連蛋白、鍵生蛋白家族成員及其他分子的結構基元(Williams和Barclay，1988；Baron等1992；Erickson，1993)。Ig超家族的神經識別分子具有獨特的短暫性的spatlel和細胞類型特異的表達類型(綜述見Edelman1988；Schachner，1991，1994；Rathjen和Josseli，1991；Rutiehauser，1993)。這個家族的識別分子在所有促細胞粘附和軸突外延部分結構性重疊。某些識別分子強烈地嗜同，即自身結合配偶體，而其他優(yōu)先地嗜異，即它們與非自身配偶體結合，非自身配偶體常包括Ig超家族的其他成員或胞外基質分子(Brummendorf和Rathjen，1993，1994)。對神經識別分子單獨的Ig樣結構域和/或FN樣重復的功能特性的目前了解顯示了在識別、軸突生長和排斥中的不同的，并且重疊的功能特性(Gennarini等，1991；Frel等，1992；Taylor等，1993；Appel等，1993，1995；Pesheva等，1993；Feisenfeld等，1994；Hoim等，1995)。在Ig超家族神經識別分子中，與神經識別分子L1有關的分子家族顯示在功能和結構方面驚人的相似性。它們是有效的軸突生長促進劑，在發(fā)育過程相對晚期表達，大部分在軸突發(fā)生開始階段表達。它們主要地由神經元表達，盡管L1家族的某些成員也存在于促軸突外延的膠質細胞上(Martini和Schachner1986；Bixby等，1988；Seilheimer和Schachner，1988)。在下面的實驗中，鑒定和分析了L1家族的另一成員，它被命名為L1的幾乎相等的同源物(CHL1)。它含有6個Ig樣結構域和FN樣重復，其中4個是與其他L1家族成員的FN樣重復高度同源。部分FN樣重復位于分子的近膜區(qū)，這是L1有關分子中最可能變化的區(qū)域。CHL1與L1家族的成員共享的其他特征是其在神經系統(tǒng)中數(shù)量占優(yōu)勢，在發(fā)育晚期表達及其高度的N-糖基化水平，包括HNK-1糖類的表達。實施例18材料和方法動物ICR小鼠和Wistar大鼠用于組織制備。抗體直接抗重組表達CHL1(氨基酸499-1063(圖18和19))和L1(氨基酸126～1981(Appel等，1993))的胞外部分的多克隆抗體，按所述的方法(Rathjen和Schachner，1984)在兔中產生。為引起抗CHL1的抗體，將200μg純化的peplitle注射到兔子中，接著以3周間隔另外加注射100μg共4次。用硫酸銨沉淀法從血清中濃縮L1抗體(13.5mg/ml)。用單克隆大鼠抗體412識別HNK-1糖表位(Kruse等，1984)?？鼓z質原纖維酸性蛋白(GFAP)的單克隆抗體從Boehringer(Mannhelm)得到?？筄1抗原的單克隆抗體已有描述(Sommer和Schachner，1981)。神經粘附分子的純化用單克隆抗體柱從成年小鼠腦粗膜部分的去污劑提取物中，免疫親和純化L1、N-CAM和MAG(Rathjen和Schachner，1984；Falssner等，1985；Poltorak等，1987)。cDNA文庫和篩選來自8日齡小鼠腦Poly(A)+RNA的λgt11文庫的制備和用免疫親和純化的多克隆L1抗體篩選該文庫，按所述的方法(Tacke等，1987)進行。為得到較長的cDNA克隆，構建了一個新的DNA文庫從6～14日齡小鼠腦中，用硫氰酸胍/酸性苯酚法(Chomezynski和Sacchi，1987)純化RNA。用二次先后過寡(dT)纖維素柱(Sambrook等，1989)富集Poly(A)-RNA。用cDNA合成試劑盒(Amersham)，將8微克的poly(A)+RNA用于寡(dT)引物雙鍵cDNA的合成。按大小挑選cDNA，用含SalI位點的DraII銜接子連接到質粒pXMD1上(Kluxen等，1992)。為繁殖和擴增文庫，使用大腸桿菌菌株TOP10(Invitrogen，荷蘭)。為了篩選，將各等份試樣以約2×104細菌/膜的密度(138cm3)直接接種在尼龍膜(BIODYNETMPall)上。影印濾膜37℃溫育過夜，接著，裂解細菌(0.5MNaOH；1.5MNaCl)，中和濾膜(3MNaCl；0.5MTris-HClpH8.0)，在2×SSC中清洗，空氣干燥，在80℃烤2小時。尼龍膜被預雜交，和按廠家的方案隨機引物法(BoehringerMannheim)放射性標記的CHL1(來自λgt11文庫)的1kb片段(HincII/KpnI)雜交，在高嚴謹條件下42℃洗膜，然后按別處所述的方法(Sambrook等，1989)對X光片曝光。根據(jù)標準方法(Sambrook等，1989)，通過限制作圖和測序進一步表征6個陽性克隆。含4.43kbCHL1插入片段的一個克隆(pX#2)用于進一步分析。DNA測序和序列分析通過雙脫氧鏈終止法(Sanger等，1977)，用雙鏈DNA作T7DNA聚合酶(Pharmacia)的模板和合成寡核苷酸作引物，測定核苷酸序列。收集cDNA序列，用DNASTAR程序(DNASTAR，Inc，倫敦)分析。除非另有說明，氨基酸序列用JolunHein法排序(Hein，1990)(缺口補償＝11，缺口長度補償＝5，K元組＝2)。蛋白序列比較為計算相似性指數(shù)(％)以比較保守氨基酸殘基之間的距離，幾種含6個Ig樣結構域和至少4個FN樣重復的不同蛋白在Ig樣結構域(半胱氨酸系指S-S鍵)和FN樣重復(色氨酸和酪氨酸/苯丙氨酰)中的保守氨基酸殘基被排序。確定了這些保守位置之間的氨基酸殘基數(shù)目。這稱為共有距離。計算距離的平均值，即L1家族成員中共有距離和標準偏差(SD)。SD值四舍五入到下一位整數(shù)。比較每種蛋白與平均距離的距離、如果該距離值與平均值±SD(＝共有距離)相等，可認作吻合。對每種單獨的蛋白計算與19共有距離的吻合數(shù)(相似性指數(shù)＝吻合數(shù)/19×100)。例如，在CHL1蛋白中16個距離值與共有距離吻合，而所有指標中的3種不吻合。這致使CHL1的相似性指數(shù)為16/19或84％。實施例19細胞培養(yǎng)和在COS-1細胞中的CHL1和L1的表達將克隆pX#2的4.43kb插入片段連接到Sall消化的pXMD1中(Kluxen等，1992，Kluxen和Lobbert，1991)。小鼠L1cDNA(Moos等，1988)的亞片段(EcoRI(質粒多接頭)/Pvull4048堿基對)用T4DNA聚合酶處理并連接到pXMD1中。在37℃，有5％CD2的增濕環(huán)境下將COS-1細胞培養(yǎng)在添加有10％(v/v)胎牛血清的DMEM(0.1％葡萄糖中)。DEAE-葡聚糖介導的DNA轉染按所述的方法(Kluxen等，1992)作一些修改而進行，簡言之，細胞以約10,000細胞/cm2接種。一天后，用DMEM(0.45％葡萄糖)洗二次，用轉染液取代培養(yǎng)基，轉染液由添加有10％(v/v)Nu-血清(BectonDickinson，瑞士)，0.4mg/ml(w/v)DEAE葡聚糖(Pharmacia)，50μM氯喹和1.25μg/mlDNA(每10cm平皿4ml)的DMEM組成。細胞溫育在37℃和5％CO2中4小時。然后移去培養(yǎng)基，將細胞在含10％＝甲基亞砜(v/v)的磷酸鹽緩沖液(pH7.3)中溫育2分鐘。用DMEM(0.45％葡萄糖)洗2次后，加添加10％(v/v)胎牛血清和20μg/ml慶大霉素的DMEM，并將細胞培養(yǎng)在該培養(yǎng)基中。24小時后，細胞在有0.01％胰蛋白酶和0.0004％EDTA的Hanks平衡鹽溶液(HBSS)中溫育37℃5分鐘后被分離，為進行免疫細胞化學，將細胞以約20,000細胞/cm3密度重新接種在包含涂有聚-L-賴氨酸玻璃蓋片(直徑為11mm)的24孔板中(Falcon)，并繼續(xù)培養(yǎng)24小時為了蛋白印跡分析，將細胞重新接種在組織培養(yǎng)平皿上，并繼續(xù)培養(yǎng)48小時。將PC12細胞培養(yǎng)在涂有膠原的組織培養(yǎng)平皿中的含10％(v/v)胎牛血清和5％(v/v)馬血清的DMEM中。為了用神經生長因子(NGF)誘導細胞，在約50％鋪滿時從單層移去培養(yǎng)基，代之以添加100ng/ml7s-NGF(Sigma，瑞士)的減少血清含量(5％馬血清)的培養(yǎng)基。培養(yǎng)2天后，細胞用0.1％胰蛋白酶和0.04％EDTA溫育后分離，收集細胞，進行RNA提取星形細胞原代培養(yǎng)根據(jù)McCarthy和DeVellis(1980)修改過的方法(Guenard等1994)制備，并在體外培養(yǎng)1～2周后用于免疫染色。少突神經細胞的原代培養(yǎng)按Laeng等(1994)所述的方法制備，體外培養(yǎng)12天。實施例20反義RNA的產生將克隆pX#2的4.43kb插入片段連接到Sall消化的pBSIISK(Stratagene)，接著缺失(ApaI載體)/AvrII(3330堿基對(圖18))片段以獲得編碼蛋白胞外部分的CHL1的cDNA片段(見圖18和19)通過T4DNA聚合酶處理L1cDNA(Moos等，1988)的EcoRI(質粒多接頭)/EcoNI(3304堿基對)片段的連接制備相似的L1構建體并將其連接到SmaI消化的pBSIISK-上。質粒用Xbal消化，按所述方法(Melton等，1984)用T7RNA聚合酶用于合成32P標志的反義RNA。RNA印跡分析用OligotexTM直接mRNA法(QIAGENInc，Dusseldorf，德國)按廠家說明，從新生和9日齡小鼠的不同組織中制備聚(A)-mRNA。聚(A)-mRNA和RNA標志(RNA梯帶，GIBCO/BRL)在0.8％甲醛/瓊脂糖凝膠上進行電泳，然后在20×SSC中毛細管轉移法(Southern，1975)轉移到Hybond-N膜上(Amersham)。紫外交聯(lián)后(UV-Stratalinker1800，Stratagene，LaJolla，CA)，用亞甲基藍法(Sambrook等，1989)核實轉移和轉移到膜上的RNA量。65℃預雜交2小時后，在雜交緩沖液中(5×SSC，2.5×Denhart溶液，50mMNa2PO4(pH6.5)，0.1％SDS，1mMEDTA，2μg/ml鮭精DNA，50％甲酰胺)，用特異于CHL1和L132P標記的反義RNA探針65℃雜交濾膜過夜。然后濾膜在0.1×SSC中65℃洗3次，0.1％SDS洗1小時，對X光片曝光。實施例21在大腸桿菌中重組CHL1蛋白的表達和純化編碼第6個Ig樣結構域(IgVl)和FN樣重復1.45(見圖18和19b)的CHL1(Mscl；1791個堿基對(起源于來自CHL1克隆的λgt11的載體克隆位點和5′端)和BsmA1；3494個堿基對)的1.7kbcDNA片段亞克隆到pET載體的唯一的BamHI限制位點上(Studier和Moffatt，1986)質粒的正確序列由測序證實。用這種質粒轉化大腸桿菌菌株BL21(DE3)。重組蛋白的表達和用陰離子交換層析純化按Appel等(1993)的方法進行。SDS-PAGE和考馬斯染色顯示一條預期分子量(70kD)的主帶，其含量至少為總蛋白的80％(未顯示)。組織級分通過將組織在40mMTris-HCl(pH7.4)，150mMNaCl，5mMEDTA，5mMEGTA，1mM苯甲基磺酰氟(PMSF)，1％TritonX-100中勻漿，在不斷攪動下4℃維持3小時而制備全組織的去污劑裂解物?？扇懿糠滞ㄟ^100,000g離心從不溶物質中分離。為制備去污劑裂解物的膜級分，組織在1mMNaHCO2(pH7.9)，0.2mMCaCl2，0.2mMMgCl2，1mM亞精胺，5μg/mlaprotinin，10μg/ml大豆胰蛋白酶抑制劑，1mMPMSF和0.5碘乙酰胺中4℃勻漿。然后分離膜和可溶級分，膜沉淀重新懸浮于溶解緩沖液中(20mMTris-HCl(pH7.9)，0.15MNaCl，1mMEDTA，1mMEGTA，0.5％TrtonX-100，5μg/mlAprotinin，10μg/ml大豆胰蛋白酶抑制劑，1mMPMSF和0.5mM碘乙酰胺)。瞬時轉染的COS-1細胞用HBSS洗二次，在含1mMEDTA的HBSS中37℃溫育10分鐘。然后用火光滑的Pasteur吸管分離細胞，200g，4C離心10分鐘收集細胞。細胞在20mMTris-HCl(pH7.4)，150mMNaCl，1mMEDTA，1mMEGTA，1mM碘乙酰胺，1mMPMSF和1％MP-40中裂解，上清通過離心(13000g)變清。蛋白測定按Bradford(1976)所述的方法進行。蛋白印跡分析將蛋白用在還原條件下，在8％或10％平板膠中的SDS-PAGE(Laemmil，1970)分離，并根據(jù)Faissner等(1985)的方法轉移到硝酸纖維素濾膜上(0.45μM，BA85；Schleicher&amp;Schuell，Dassel，德國)用于免疫檢測，其中使用CHL1抗血清(稀釋1∶500，對ECL為1∶10000)、L1多克隆抗體(稀釋1∶1000，對ECL為1∶15000)、或單克隆抗體412(稀釋1∶1000，對ECL為1∶1000)堿性磷酸酶偶聯(lián)的第二抗兔或抗大鼠的IgG。按照廠家的說明使用ECL蛋白印跡檢測試劑(Amersham)和X-光片檢測通過增強化學發(fā)光(ECL)法，或者用BCIP和NBT作顯色底物來檢測結合抗體。實施例22酶聯(lián)免疫吸附測定酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)除蛋白以100ng/ml濃度包被外，按Husmann等(1992)所述的方法進行。所用的CHL1抗血清有幾種稀釋度，為1∶250～1∶2×106之間。CHL1的去糖基化來自7日齡小鼠的腦組織勻漿(200μl，蛋白濃度6mg/ml)的去污劑裂解物通過離心分離成可溶性級分和不溶性物質(見組織級分)，然后按廠家的說明(BoehringerMannheim，德國)用0.5單位的N-糖苷酶F或2.5單位的O-糖苷酶，或這些濃度的二種酶溫育。裂解物由SDS-PAGE在10％膠上分離。蛋白轉移到硝酸纖維素濾膜上，用抗重組CHL1蛋白片段的CHL1抗血清(1∶500稀釋)溫育(見圖18)免疫沉淀來自9天齡小鼠腦組織勻漿(300μl，蛋白濃度5mg/ml)去污劑裂解物的可溶級分(見組織級分)在5ml含1％NP40和30μlG瓊脂糖(Pharmacia/LKB)的緩沖液中(20mMTris-HCl(pH7.4)，150mMNaCl，5mMEDTA)，和10μlCHL1抗血清或抗L1的多克隆抗體5℃溫育過夜。用含0.1％NP40，0.05％SDS的緩沖液，然后20mMTris-HCl(pH7.4)相續(xù)清洗后，瓊脂糖珠在5x樣品緩沖液(250mMTris-HCl(pH6.6)，10％SDS，50％甘油，0.5％溴酚藍、25％B-巰基乙醇)中煮10分鐘，上清用SDS-PAGE在10％膠中分離。應用蛋白印跡分析，將蛋白轉移到硝酸纖維素濾膜上并用抗L1的多克隆抗體、CHL1抗血清、或單克隆抗體412檢測。間接免疫熒光為進行細胞表面染色(Schmtzer和Schachner，1981)，植在蓋片上的CHL1和模擬(僅載體)轉染的COS-1細胞在含10％胎牛血清、10mMHepes(pH7.3)和002％NaN3的DMEM中，與第一抗體(CHL1抗血清(1∶100稀釋)或L1多克隆抗體(1∶200稀釋)室溫下溫育30分鐘，然后和第二抗體溫育。免疫染色后，細胞用4％多聚甲醛的磷酸鹽緩沖液(pH7.3)中的固定，放在含2.5％碘化鉀的Moviol(Hoechst)中。為進行星形細胞和少突神經膠質細胞的雙免疫熒光染色，按用于轉染COS-1細胞所述的方法溫育針對細胞表面抗原的第一抗體。隨后，用甲醇-20℃滲透細胞后，將細胞與抗細胞間抗原的第一抗體一起溫育。實施例23原位雜交為產生地高辛標記的來自CHL1和L1相應部分相同大小的反義cRNA探針，使用用于RNA印跡分析的相同構建體。有義探針從在相反方向有插入片段的相似構建體產生。使用T7RNA聚合酶產生并接著堿處理以獲得250個核苷酸的平均長度片段來制備所有cDNA探針。原位雜交按所述的方法進行(Bartsch等，1992，Dorries等，1994)。結果和討論CHL1cDNA的鑒別用抗來自腦免疫純化L1的多克隆抗體(Tacke等，1987)篩選編碼細胞粘附分子L1的cDNA克隆的λgt11表達文庫，鑒別出克隆311。它含有與L1同源的部分cDNA(根據(jù)Lipman和Pearson(1985)為34.1％)和一個編碼704個氨基酸包括細胞質部分的2112個堿基對(bp)的開放閱讀框。為分離全長的cDNA克隆，該克隆的DNA片段用于篩選不同的cDNA文庫。分離到6個單獨的克隆。2個克隆含42和4.4kb的插入片段，包括L1幾乎相等同源物(CHL1)的整個編碼區(qū)。進一步研究了含4.4kb插入片段的克隆。DNA和推導的氨基酸序列及結構特征4.4kb的插入片段編碼295bp的5′非翻譯區(qū)、3627bp的開放閱讀框、和518bp的3′非翻譯區(qū)(圖18)。雖然3′端有一寡(A)序列，該序列上游清晰的共有聚腺苷酸化信號缺失。AUG起始密碼子(296位，圖18)的側翼序列與翻譯起始的理想共有序列并不相一致(Kozak，1987)。不過，基于二個證據(jù)，這種AUG當作翻譯起始密碼子。在所有3個閱讀框中的終止密碼子位于它的上游之前，接在它之后的是具有預期在殘基24或25之后具有裂解位點的潛在信號序列(根據(jù)vonHeijen的算法(1986)，分別為8.65和4.0分)(圖18)。翻譯開放閱讀框產生預測分子量為134.9kD的1209個氨基酸的蛋白，表現(xiàn)為膜內在糖蛋白的特性。推定的胞外結構域由1081個氨基酸組成，具有18個潛在的N-糖基化位點(圖18和19a)和60個以上潛在的O-糖基化共有位點(未顯示)(Pisano等，1993)，根據(jù)Kyte和Doolittle(1982)的親水性分析判斷，接著是23個氨基酸的跨膜結構域(圖19c)。該結構域的兩側，其N端為一極性殘基，其C端為-堿性氨基酸，與終止轉移信號一致(圖18)。胞內區(qū)域由105氨基酸殘基組成。胞外區(qū)含有2個為L1家族特征的重復結構域的主要結構基元與Ig樣結構域有同源性的685個氨基酸的一段序列和與FN樣重復有同源性的472個氨基酸的一段序列(圖1和2a)。全部6個Ig樣結構域含有位于47～54氨基酸處，互相分離的半胱氨酸殘基的特定對(圖19)在每個結構域(DXGXYCXAXN)中，位于與第二個半胱氨酸殘基周圍保守氨基酸的C2型簇相連的β鏈B末端的保守脯氨酸(第6個Ig樣結構域除外)把Ig樣結構域分配到C2群上(Williams和Barclay，1988)。在Ig樣結構域和跨膜區(qū)之間是與纖連蛋白中與FN樣重復同源的4個結構域(Kornblihtt等，1985)。大約100個氨基酸的這些結構域的每一個，分別在N和C端區(qū)中、含高度保守的色氨酸(除第一個FN樣重復例外)和酪氨酸/苯丙氨酸殘基。有趣的是，第5個FN樣重復，與L1家族的其他成員相反，僅有一個基本的半個FN樣重復(圖18)。是否這種一半的FN樣重復表示幾種可供選擇的剪接形式之一仍有待于用除RNA印跡分析之外的方法確定，其中剪接形式的一種包含完全的FN樣重復。在本文值得注意的是通過6個單獨分離的克隆的限制分析未發(fā)現(xiàn)可變剪接的跡象(未顯示)。對Nr-CAM/BRAVO觀察第5個FN樣結構域的可變剪接，從其中分離了缺乏第5個FN樣重復的cDNA同I型(Grumet等1991；Kayyem等，1992)。在雞神經束蛋白中缺少第5個FN樣結構域(Volkmer等，1992)也極有可能由于可變剪接，因為其大鼠同源物，錨蛋白結合糖蛋白(ABGP)(Davis等，1993)含有第5FN樣結構域。因而，CHL1增加了L1家族的一項新結構特征，僅表達4個半FN樣重復(圖19)。CHL1的另一結構特征是在第二個Ig樣結構域存在RGD序列(氨基酸185-187)(圖18)。這個三肽原初鑒別為纖連蛋白第十III型結構域中的一個細胞附著位點(Pierschbacher和Rusolathi，1984)，并對整聯(lián)蛋白的結合起作用(綜述見Rusolathi和Pierschbacher，1987)FN樣重復的三維結構分析顯示RGD基元位于β鏈F和G之間(Main等，1992)。這種基元在L1家族的其他成員中也發(fā)現(xiàn)。在雞Ng-CAM(Burgoon等，1991)和該種同源物雞神經束蛋白及大鼠ABGP的第三FN樣重復中，RGD序列在β鏈F和G之間的相同位置被發(fā)現(xiàn)。RGD基元也在L1中找到(在L1小鼠和大鼠(NILE)中有2個，在人L1中有1個(Moos等，1988；Hlavin和Lemmon，1991；Prince等，1991)。所有L1RGO序列在第六Ig樣結構域中找到，但是比在纖連蛋白的FN樣組件中的RGDs處在不同的氨基酸環(huán)境。至于在L1中，在CHL1中的三肽位于第二Ig樣結構域的β鏈E上。目前仍不清楚這些蛋白中的RGD序列是否具有功能活性。在這方面值得注意的是在第二個FN樣結構域中含RGD基元的F3/F11家族(Brummendorf和Rathjen，1993，1994)的一個成員TAG-1(Furley等，1990)所誘導的軸突延伸依賴于B、整聯(lián)蛋白和L1(Felsenfeld等，1994)。這種觀察提出在TAG-1的第二FN樣重復和β1整聯(lián)蛋白之間有直接實際的相互作用的可能性。在第6Ig樣結構域的β鏈C中，CHL1也含DGEA序列(氨基酸555～558)(圖18)。這種序列沒有在L1家族的其他成員中找到DGEA序列也和含這種基元的I型膠原的α2β1整聯(lián)蛋白識別有關(Staatz等，1991)CHL1和Ig超家族的其他識別分子的結構相似性CHL1的氨基酸序列和翻譯的EMBL基因序列數(shù)據(jù)庫比較表明，CHL1與109個氨基酸的長序列有87.2％相同，與以前在人腦中鑒別的93個氨基酸長的序列有79.6％的相同(登記號HS2431和HSXT02610(Adams等，1992，1993))。因而，在人類中似乎存在高度保守的CHL1分子。從翻譯的EMBL基因序列數(shù)據(jù)庫中取如下序列和CHL1比較，這些序列是小鼠、人類和大鼠的L1/NILE、雞Ng-CAM、雞Nr-CAM、蓑L1.1(Tongiorgi等，1995)、雞神經束蛋白/大鼠ABGP、果蠅神經膠質蛋白(Bieber等，1989)，小鼠F3/雞F1/人類CNTN1(Gennarini等，1989；Ranscht，1988；Brummendorf等，1989；Berglund和Ranscht，1994)、大鼠TAG-1/雞軸突蛋白-1/人類TAX-1(Furley等，1990；Hasler等，1993；Tsiotra等，1993)和大鼠BIG-1/大鼠PANG(Yoshihara等，1994；Connelly等，1994)的序列。比較顯示在如下的表1中。表1CHL1和其他L1相關分子的胞外部分的序列相似性比較L1家族成員的胞外區(qū)互相比較，和其他分子及與Ig超家族的其他神經細胞粘附分子的比較。數(shù)值表示按Hein(1990)的方法排序后的氨基酸同一性的百分率。物種在括號中顯示c＝雞、d＝果蠅、h＝人類、m＝小鼠、r＝大鼠，zf＝蓑鲉。表2L1相關分子的胞內部分序列相似性的比較L1家族成員(包括種同源分子)的胞內區(qū)互相比較，和Ig超家族的其他神經細胞粘附分子的比較。數(shù)值表示根據(jù)Hein(1990)的方法排序后氨基酸一致性的百分率。物種顯示在括號中c＝雞、d＝果蠅、h＝人類、m＝小鼠、r＝大鼠，及zf＝蓑鲉。小鼠、大鼠和人類的L1是相同的。小鼠NrCAM和神經束蛋白分別是91個和86個氨基酸殘基的部分序列。</tables>表3L1家族成員和含C2結構域的Ig超家族的其他成員之間的結構關系(續(xù))本表顯示Ig樣結構域中保守氨基酸之間(涉及S-S鍵的半胱氨酸Ig1、Ig2、Ig3、Ig4、Ig5和Ig6)，F(xiàn)N樣重復(第二個β-鏈的色氨酸和第6個β-鏈的酪氨酸/苯丙氨酸FN1、FN2、FN3和FN6)，和這些結構域之間(1-2、2-3、3-4、4-5、和5-6；FN1-FN2、FN2-FN3、和FN3-FN4)的殘基數(shù)目。第6Ig樣結構域的第二個半胱氨酸的保守氨基酸和第1FN樣重復的第一個色氨酸之間的距離(Ig6-FN1)反映Ig樣結構域和FN樣重復之間的距離。表明了L1相關分子的各個距離的平均值和標準差(SD)。給出的DCC、HLAR、rse、NCAM、MAG、神經肌肉蛋白和纖連蛋白(III)作為對照。相似性指數(shù)在右邊欄給出。？＝沒有保守性氨基酸*＝沒有用于平均值和SD計算。CHL1與雞Ng-CAM(在胞外結構域氨基酸的一致性為37％、表1)和小鼠Nr-CAM(在胞內結構域氨基酸的一致性為64％，表2)極為相似。然而一致性的程度，尤其在胞外部分，不足以認為這些蛋白是物種同源物。最近，小鼠Nr-CAM的部分cDNA克隆(Moscoso和Scanes，1995)已被鑒別出來。小鼠Nr-CAM幾乎與雞Nr-CAM一致(99％)(見表2)。因此，CHL1不可能是小鼠中的Nr-CAM同源物。CHL1是在小鼠中已有L1、Nr-CAM、神經束蛋白(Moscoso和Sanes，1995)的L1家族的第4個成員，并且CHL1在人類中具有高度保守的物種同源物(Adams等，1992，1993)?？紤]到雞和小鼠Nr-CAM和雞和小鼠神經束蛋白的胞內序列的相似性(分別為99％和87％，表2)，小鼠L1和雞Ng-CAM幾乎不可能是種同源物，因為它們僅顯示其胞內結構域1％的一致性(表2)然而，可望Ng-CAM可成為小鼠中具有高度保守的胞內結構域的L1家族的第5個成員。有趣的是，小鼠L1和雞Ng-CAM的嗜異相互作用促進軸突外延(Lemmon等，1989)，這暗示L1家族的成員可相互作用。除了L1家族成員的全部結構的相似性外(表1和表3)，在細胞質區(qū)域能鑒別出極為高度保守的區(qū)域(圖20)。這種驚人的同源性對迄今為止已鑒別的所有物種中含胞內結構域的L1家族成員L1、CHL1、Nr-CAM、Ng-CAM、神經束蛋白、神經膠質蛋白、和蓑L1.1是明顯的，對蓑L1.2(Tongiorgi等，1995)和小鼠Nr-CAM和神經束蛋白(Moscoso和Sanes，1995)的部分序列也明顯(表2)在這個區(qū)域的二段序列中，接近和部分在跨質膜片段中的一段與位于C末端(圖20I，III)的另一段幾乎相同。另一段在L1、Ng-CAM、Nr-CAM、神經束蛋白、L1.1和L1.2，但不在CHL1中保守的氨基酸序列(表2)含有由可變剪接起源，僅在神經元中表達的RSLE基元(在圖3中，II)(Grumet等，1991；Miura等，1991；Volkmer等，1992)。因為在這些蛋白之間胞內區(qū)極為高度保守，所有L1家族的成員可用于相同的信號轉導通路以活化軸突延伸。已經表明ABGP、L1和Nr-CAM的細胞質區(qū)域能和針對細胞骨架支架的與錨蛋白連系的細胞識別相互作用(Davis等，1993，Davis和Bennett，1994)。實施例24在胞外結構域中的為L1家族成員分類的所必需的結構的鑒別為進一步研究L1家族成員身份的一般標準，我們調查研究了Ig超家族幾個成員中的Ig樣結構域中高度保守的氨基酸的位置(半胱氨酸系指S-S鍵)和FN樣重復(色氨酸，酪氨酸/苯丙氨酸)(表3)。含6個Ig樣區(qū)域和至少4個FN樣重復的分子(L1家族和連接GPIF3/F11亞組(Brummendorf和Rathien，1993))顯示分隔這些保守氨基酸的非常穩(wěn)定的氨基酸數(shù)目?？紤]5個不同的距離參數(shù)1)分隔形成每個Ig樣區(qū)域的半胱氨酸(S-S)鍵的保守半胱氨酸的氨基酸數(shù)目(表3，Ig1、Ig2、Ig4、Ig5和Ig6欄)；2)在-Ig樣結構域的第二個半胱氨酸和下一個Ig樣結構域的第一個半胱氨酸之間，反映2個鄰近Ig樣結構域之間距離的氨基酸數(shù)目(表3，1-2、2-3、3-4、4-5和5-6欄)；3)在第6個Ig樣結構域的最后一個保守的半胱氨酸和第一個FN樣重復的保守色氨酸之間，反映Ig樣結構域組件和FN樣重復組件之間距離的氨基酸數(shù)目(表3，IgG-FN1欄)；4)在每個單獨的FN樣重復的保守色氨酸、酪氨酸/苯丙氨酸之間的氨基酸數(shù)目(表3，F(xiàn)N1、FN2、FN3和FN4欄)；5)在一FM樣重復的酪氨酸/苯丙氨酸和下一個FN樣重復的色氨酸之間，反映2個鄰近的FN樣重復之間距離的氨基酸數(shù)目(表3，F(xiàn)N1-FN2、FN2-FN3和FN3-FN4欄)。為獲得比較L1樣分子的高度嚴格條件，為了計算平均距離和標準差，我們沒有考慮極有可能由于可變剪接而明顯偏離平均數(shù)的少數(shù)數(shù)值(神經膠質蛋白Ig2，2-3；Nr-CAM和ABGPIg6-FN1；F3Ig4、FN3Ng-CAM；FN2，F(xiàn)N3(表3，用*標記))。因為第1和第6個Ig樣區(qū)域的S-S鍵之間的氨基酸數(shù)目(Ig1，標準差(SD)3Ig6；SD＝4)和FN樣3和4重復的保守色氨酸、酪氨酸/苯丙氨酸之間的氨基酸數(shù)目(FN3SD＝4；FN4SD＝3)稍有可能變化，但所有其他距離參數(shù)對不同的分子來說仍明顯地穩(wěn)定(FN1-FN2SD＝0；FN2和2-3SD＝2(表3))?；谶@些標準，我們計算了與表3列出的平均值有關的幾種Ig樣分子的相似指數(shù)(見材料和方法)。對于L1、CHL1、Ng-CAM、Nr-Cam、ABGP、L1.1、TAG-1和BIG-1，得到的相似指數(shù)為74-95％(表3)。對果蠅的神經膠質蛋白，確定的值略低(66％)，這極有可能反映了脊椎動物和昆蟲之間的進化距離。F3和其種同源物缺少保守性，特別是在它們的Ig樣結構域中，但是仍顯示63％的相似性指數(shù)。構成強烈保守共線性(如在第一FN樣重復末端的FxVxAxNxxG(8x)S(4x)TxxAxPxxxP或第三FN樣重復的最后2個β鏈之間的NxxGxGPxs(未顯示)的某些保守氨基酸序列支持F3屬于L1家族的觀點。有趣的是，在鄰近結構域(Ig樣結構域或FN樣重復)之間的氨基酸數(shù)目在這些分子中甚至更保守，表示各個結構域之間的距離是重要的結構特征，即對神經識別分子行使功能是關鍵的(表3，1-2、2-3、3-4、4-5、5-6、FN1-FN2、FN2-FN3和FN3-FN4欄)。因而，這種順序(共線性)和間隔的保守性可用于更一般地解釋L1家族成員的胞外結構域。應用剛確定的標準，這些成員含在N端6個Ig樣區(qū)域接著4個FN樣重復的組件。我們將這一結構特征稱為L1家族盒。因此，L1家族的所有成員享有L1家族盒的獨特特征，并另有具有高度保守氨基酸。這些結果提示這些分子來源自一個含L1家族盒的共同祖先L1樣的分子，這個分子可能通過基因復制而散布其潛在的功能，以適應在更復雜的神經系統(tǒng)中細胞相互作用多樣化的進化需求。因而一般的L1家族可以再分為“經典的”L1家族成員(L1、CHL1、Ng-CAM、Nr-CAM、神經束蛋白、神經膠質蛋白、L1.1)和F3/F11亞組(F3/F11/CNTN1、BIG-1/PANG、和TAG-1/軸突蛋白-1/TAX-1)“經典的”L1家族成員含一個可變的第5FN樣重復、一個跨膜結構域和一個高度保守的胞內結構域。F3/F11亞組的共同特征是由GPI連接到膜上，迄今為止未鑒別出可變的第5FN樣重復。兩個亞組的細胞外結構域含L1家族盒。Ig超家族的其他成員，如N-CAM(Cunninham等，1987，Barthels等，1987)、MAG(Arquint等，1987；Lai等，1987；Salzor等，1987)，神經肌肉蛋白(Kanla等，1993)、和rse(Mark等，1994)或含Ig結構域和/或FN樣重復的纖連蛋白(Kornblihtt等，1985)，顯示明顯不同的距離參數(shù)，說明它們互相之間及與L1家族的成員之間的更少關系(表3)。有趣的是，按照距離參數(shù)(相似指數(shù)分別為42％和50％)，人白細胞共同相關抗原基因(HLAR)(Strell等，1988)和在結直腸癌中缺失的腫瘤抑制基因產物(DCC)(Fearon等，1990)與L1家族緊密相關。檢查保守氨基酸顯示，盡管DCC似乎缺少第5和第6個Ig樣結構域，按Fearon等(1990)和Pierceall等(1994)的以前建議，DCC確實與L1家族比與N-CAM更緊密相關。最近研究顯示DCC主要在大腦中表達，在其細胞表面表達蛋白的DCC轉染成纖維細胞的底物上，大鼠PC12細胞的軸突外延被促進(Pierceall等，1994)。雖然HLAR也顯示相對高的相似指數(shù)，其與L1家族的關系并明顯。實施例25CHL1mRNA和蛋白的組織分布為了研究在神經系統(tǒng)中是否CHL1與L1家族的其他成員共同具有優(yōu)勢表達，我們在mRNA和蛋白水平分析3在各種組織中CHL1的表達。在RNA印跡分析中，CHL1核酸探針和約8kb占優(yōu)勢的mRNA帶雜交(圖21)，該帶明顯地比用L1探針(約6kb)(Tacke等，1987)檢測的mRNA大小要大。較小和較弱的RNA帶(圖21a，泳道3)極有可能是由于和核糖體RNA互相雜交。8kbRNA在小腦、腦負小腦和脊髓中檢出，卻未在背根神經節(jié)(DRG)中檢出(圖21a)。相反，L1核酸探針與來自DRG的RNA顯示有強雜交信號(圖21a)。CHL1mRNA也可在9日齡大鼠小腦和6日齡大鼠脊髓中檢出，但不可在用和不用NFG培養(yǎng)的大鼠PC12細胞中或在COS-1細胞中檢出(圖21b)在所有分析的其他組織(胸腺、肺、肝、腸、脾和腎中)，沒有雜交信號可檢測到(圖21a)。為鑒別CHL1蛋白，產生了抗細菌表達的CHL1蛋白片段的抗體除開與其他已知的L1家族成員高度同源區(qū)如跨膜區(qū)或胞內區(qū)外，將表示第6Ig樣結構域和第4FN樣重復部分的1.7kbcDNA片段(圖18和19b)克隆到pET表達載體中。得到的蛋白片段被表示為通過陰離子交換層析純化的，SDS-PAGE后用考馬斯藍染色而檢測的70kD，蛋白印跡分析(圖22a)和ELISA(未顯示)顯示來自2只兔的抗血清與CHL1蛋白片段反應，但不和純化的L1、N-CAM或MAG反應?？捎^察到與CHL1肽共純化的細菌蛋白或CHL1片段的降解產物的某些反應(圖22a，泳道4)。為進一步檢測抗體的特異性和確定它們是否識別表達CHL1的天然細胞表面，用抗體檢測了瞬時轉染的COS-1細胞，免疫細胞化學顯示CHL1在轉染CHL1細胞中的細胞表面表達，但不在用載體模擬轉染的細胞中表達(圖23)。這些結果也說明推定的信號序列是有功能的，而且開放閱讀框是正確的。盡管第1個CHL1cDNA克隆通過用免疫親和純化的抗來自腦L1的多克隆抗體進行篩選從表達文庫分離得到，未觀察到抗重組表達的L1Ig樣結構域的抗體的不同制備物與轉染CHL1細胞的反應(未顯示)。直接抗分子胞外部分的CHL1抗體(圖19)也沒有和轉染L1的的細胞反應(未顯示)。因此有可能用于篩選表達文庫的L1多克隆抗體與CHL1和L1之間最同源的CHL1C端胞內部分反應。用CHL1的抗血清鑒別幾種組織中的免疫反應性蛋白(來自9日齡小鼠的腦、肝、肺、腎和腸，圖23b)。將在0.5％TritonX-100中的粗膜級分、可溶和不可溶級分用蛋白印跡法分析?？筁1的多克隆抗體用作對照。CHL1抗體識別在腦膜不可溶和可溶級分中的185、165和125kD的三條不同帶。185kD帶僅在可溶級分中微弱地可檢測到，而125kD.帶在不可溶級分中不明顯(圖23b，泳道1和2)，表示185kD帶可能是CHL1的膜結合形式，而125和165kD形式可能是蛋白酶解片段。轉染CHL1的COS細胞和全腦組織的蛋白印跡分析后觀察到相似的免疫反應帶型(未顯示)。相似的帶型也在L1(Faissner等，1985Sadoul等，1988)、Ng-CAM(Grumet等，1984)和NrCAM(Kayyem等，1992)的實驗中觀察到。不過、在第三FN樣結構域中蛋白裂解的雙堿基共有序列(L1“SKR”Ng-CAM“SRR”Nr-CAM“SRR”Nr-CAM“SRRSKR”)在CHL1中不存在。像L1家族的其他成員一樣，發(fā)現(xiàn)CHK1僅在發(fā)育較晚期階段表達。用蛋白印跡分析，它不能在15天前胚胎的腦中檢測到(未顯示)。在全肝組織的去污劑可溶級分中檢測出一條50kD的免疫反應帶。這條帶極有可能是由于CHL1的抗體與CHL1相關蛋白的某種交叉反應性，因為用RNA印跡分析未見到肝中有CHL1特異的mRNA(圖22a)。CHL1免疫反應性也不能在所測試的其他組織中檢測到(圖23b)。在中樞神經系統(tǒng)中，L1家族的成員主要由神經元表達。因此，我們感興趣的是CHL1是否和L1共同擁有這種表達類型。進行原位雜交實驗以鑒別在出生后幼小小鼠的視網(wǎng)膜、視神經和小腦皮層中合成CHL1和L1的細胞。在7日齡小鼠的視網(wǎng)膜中，L1(圖24a)和CHL1mRNA(圖24b)由神經節(jié)細胞表達。另外L1轉錄物也能在位于內核層中的無長突細胞和水平細胞中檢測到(圖24a)。相反，CHL1mRNA僅在位于中間核層的內(即；ritread)邊緣的少數(shù)細胞中偶爾能檢測到(圖24b)。在視神經中的膠質細胞不含有可檢測的L1轉錄物水平(圖24a)。明顯相反的是，CHL1mRNA強烈地由位于視神經近端(即近視網(wǎng)膜)區(qū)的膠質細胞表達(圖24b)，CHL1的低水平表達在位于該神經更遠端區(qū)的膠質細胞中可見(圖24b)。第二周齡小鼠的小腦皮層中，L1mRNA可在位于分子層中的星形細胞和籃狀細胞中以及位于內粒層中的高爾基細胞和粒細胞中檢測到(圖24d)。當切片和CHL1反義cRNA探針雜交時，相同的細胞類型被標記(圖24e)，除開位于分子層中間部分的細胞難以檢測到CHL1轉錄物(比較圖24d和e)。作為陰性對照，切片和相應的有義cRNA探針雜交、沒有標記的細胞可檢測到(對視網(wǎng)膜和視神經，用CHL1有義cRNA探針雜交，見圖24c)。為了說明體外的膠質細胞是否表達CHL1，從出生后幼小的小鼠或大鼠前腦制備純化的星形細胞或少突神經膠質細胞的培養(yǎng)物。使用特異地檢測在轉染COS-1細胞的細胞表面上的CHL1相同的多克隆CHL1抗體。分別用抗GFAP的抗體或抗O1抗原的抗體鑒別星形細胞和少突神經膠質細胞。星形細胞培養(yǎng)物含一些被多克隆CHL1(圖25a，b)和單克隆GFAP(圖25b，e)抗體雙標記的細胞。然而，分析少突神經膠質細胞培養(yǎng)物，顯示沒有CHL1和O1抗原的共定位，說明成熟的少突神經膠質細胞在體外不表達可檢測的CHL1水平。聯(lián)合觀察表明CHL1和L1顯示重疊，但也有不同的表達類型。最引人注目的是，CHL1而不是L1在體內由神經系統(tǒng)的某些膠質細胞表達，這提示L1家族的不同成員行使不同的功能。對CHL1糖蛋白的糖基化分析和HNK-1糖類的檢測由于CHL1觀察到的分子量(185kD)比計算分子量(134.9kD)大得多，分析了糖類對分子量的作用和糖類修飾的類型。來自7日齡小鼠的粗腦膜的去污劑可溶和不可溶級分進行酶促去糖基化。N-糖苷酶F(PNGasoF)處理后，所有CHL1免疫反應蛋白的分子量降低(圖26)185kD帶移到150kD，165kD帶移到135kD，及125kD帶移到110kD用一種已知裂解連接半乳糖β(1-3)N-乙酰半乳糖胺二糖的絲氨酸和蘇氨酸的酶(Glasgow等，1977)β-糖苷糖處理導致略為增加遷移率185kD和165kD帶分別移到約180和160kD，而125kD帶沒有移動。這些觀察表示大多數(shù)糖類分子量是由于N-連接的糖類。用二種酶一起處理(圖26)引起比用單酶處理見到的更大遷移，從185到145kD，提示并不是所有糖基化位點，最有可能O-糖基化位點被單獨的O-糖苷酶所裂解。結果顯示CHL1含有大約其分子量的30％為N-糖苷連接的糖類。幾種神經細胞粘附分子帶有HNK-1糖類，如L1(Kruse等，1984)、TAG-1(Dodd等，1988)、Nr-CAM(Grumet等，1991)、F3(Gennarini等，1989)，N-CAM(Kruse等，1984)、髓鞘相關蛋白MAG(McGarry等1983；Kruse等，1984)和Po(Bollenson和Schachner，1987)。因此，我們分析CHL1是否帶有HNK-1糖類。用CHL1抗體從9日齡小鼠全腦組織的去污劑裂解物中免疫沉淀CHL1。作為對照，用多克隆抗體從相同的腦提取物中相似的方法免疫沉淀L1。用直接抗HNK-1糖類的單克隆抗體412的蛋白印跡分析顯示，兩種免疫沉淀物含有被單克隆抗體412所識別的預期為CHL1(圖27)或L1(未顯示)的分子量的帶。因為像L1家族的其他成員一樣，HNK-1糖類涉及細胞與細胞的粘附和結合層粘連蛋白(Keilhauer等，1985；Kunemund等，1988；Hall等，1993，1995)，CHL1可能通過HNK-1糖類與層粘連蛋白相互作用。結論以上實驗把CHL1加入為神經識別分子L1家族的另一成員，神經識別分子L1家族在上述不同的物種如人類、大鼠、小鼠、雞、蓑和果蠅中發(fā)現(xiàn)，因而構成系統(tǒng)發(fā)育保守的分子家族，其全部成員在發(fā)育晚期由神經元和神經元的亞組開始的軸突形式中表達。存在許多L1相關分子的事實表明結構上相似而功能上極有可能為不同的促軸突生長的分子的自然需要，也表明作為可能決定軸突尋找目標的精細調節(jié)的一級分子的L1家族的進化。下列按字母順序列出的參考文獻，涉及實施例18-25。Adams，M.D，Dubnick，M.，Kerlavage.A.R.，Moreno，R.，Kelley，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