本發(fā)明涉及醫(yī)學(xué)及生物化學(xué)，具體涉及一種檢測(cè)n末端b型利鈉肽原的熒光生物傳感器、其制備方法及應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、心力衰竭(heart?failure,hf)是最常見的心血管疾病之一，被定義為心臟結(jié)構(gòu)或功能性異常引起的癥狀或體征，最近幾年，其5年死亡率約為50％。n末端b型利鈉肽原(n-terminal?pro-brain?natriuretic?peptide,nt-probnp)是由probnp降解后的化學(xué)結(jié)構(gòu)之一，被廣泛用作心衰(主要是心室功能障礙)的生物標(biāo)志物，主要用于心衰診斷和預(yù)后評(píng)估。

2、目前，多種免疫分析方法已被應(yīng)用于nt-probnp的特異性檢測(cè)，包括熒光法、電化學(xué)法、化學(xué)發(fā)光法等，但其都大多將抗體作為識(shí)別原件，由于抗體在體外標(biāo)記過程中其3d結(jié)構(gòu)可能不穩(wěn)定，成本高昂，不便于推廣。因此，開發(fā)一種快速、靈敏、高選擇性以及成本低廉的檢測(cè)nt-probnp的方法對(duì)心衰的早期診斷及預(yù)后就有重要意義。

3、核酸適配體(aptamer)是短單鏈rna或基于dna的寡核苷酸，能夠通過非共價(jià)相互作用與多種配體結(jié)合，具有易于化學(xué)修飾、化學(xué)穩(wěn)定等優(yōu)點(diǎn)。相較于抗體，以核酸適配體作為識(shí)別原件的檢測(cè)方法更具優(yōu)勢(shì)。鈀納米片(palladium?nanosheets,pd?nss)是一種具有二維結(jié)構(gòu)的貴金屬納米材料，其在近紅外區(qū)吸收性質(zhì)良好，較大的比表面積以及尺寸可調(diào)性，以上特征奠定了它在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域廣泛應(yīng)用的基礎(chǔ)。

4、近年來，熒光生物傳感器的檢測(cè)方法由于其簡(jiǎn)單、低成本、靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)，在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域備受關(guān)注。其中，基于熒光共振能量轉(zhuǎn)移機(jī)制能夠有效避免背景信號(hào)的干擾，大大提高了檢測(cè)靈敏度，促使了其在生物學(xué)、藥學(xué)、醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的廣泛應(yīng)用。本發(fā)明就鈀納米片在近紅外區(qū)吸收特性好且與熒光染料cy5.5修飾的nt-probnp的核酸適配體(cy5.5-apt)的吸收光譜及發(fā)射光譜有重疊這一特點(diǎn)，構(gòu)建了一種基于熒光共振能量轉(zhuǎn)移/內(nèi)濾效應(yīng)雙機(jī)制猝滅熒光的生物傳感器，實(shí)現(xiàn)了對(duì)nt-probnp的快速、靈敏、特異性檢測(cè)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本發(fā)明的旨在提供一種檢測(cè)nt-probnp的熒光生物傳感器、其制備方法，并將其應(yīng)用到實(shí)際血漿樣本的nt-probnp的檢測(cè)中，其優(yōu)點(diǎn)在于快速、靈敏、高選擇性。

2、本發(fā)明所提供的方案具體步驟為：

3、第一方面，本發(fā)明提供了一種檢測(cè)nt-probnp的“關(guān)-開”型熒光生物傳感器，其特征在于，所述熒光生物傳感器包括鈀納米材料以及cy5.5-apt組成的復(fù)合納米探針。

4、其中，所述核酸適配體序列為：5’-cag?ggg?gac?ggg?tcg?ggt?tac?agc?tgagtgtgg?cc-3’。

5、第二方面，本發(fā)明提供了根據(jù)權(quán)利要求1所述的熒光生物傳感器的制備方法，包括以下步驟：

6、(1)以乙酰丙酮鈀為原料，通過化學(xué)合成法制備pdnss溶液。

7、(2)將pdnss溶液與cy5.5-apt渦旋混勻，得到pdnss與cy5.5-apt的復(fù)合納米探針。

8、第三方面，本發(fā)明還提供了一種檢測(cè)nt-probnp的方法，包括以下步驟：將上述復(fù)合納米探針與不同濃度的nt-probnp的標(biāo)準(zhǔn)品溶液(濃度為0.80、1.0、1.5、3.0、8.0、10、12、15、20、25、30pg/ml)，渦旋混勻，避光靜置后繪制其在690nm-750nm范圍內(nèi)的熒光光譜，根據(jù)其在675nm最大發(fā)射波長(zhǎng)處的熒光強(qiáng)度變化，其熒光恢復(fù)效率與nt-probnp濃度的對(duì)數(shù)在特定區(qū)間內(nèi)呈線性關(guān)系，以此建立相對(duì)應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

9、其中，所述熒光生物傳感器中，pdnss濃度為20～60μg/ml，反應(yīng)體系ph為6.5～8.5，反應(yīng)時(shí)間為0～6min，孵育時(shí)間為0～20min。

10、其中，所述熒光傳感器的熒光恢復(fù)效率在nt-probnp濃度為0.8～30pg/ml范圍內(nèi)呈線性相關(guān)。

11、如上所述，本發(fā)明具有以下有益效果：

12、1.本發(fā)明構(gòu)建了一種熒光生物傳感器，利用熒光共振能量轉(zhuǎn)移/內(nèi)濾效應(yīng)的雙機(jī)制猝滅熒光的方法，大大提高了熒光猝滅效率，提高了檢測(cè)nt-probnp的靈敏度，且能夠?qū)崿F(xiàn)在短時(shí)間內(nèi)特異性檢測(cè)nt-probnp。

13、2.本發(fā)明利用核酸適配體作為識(shí)別原件，可避免抗體抗原間的交叉反應(yīng)，無需磁珠分離，成本低廉，便于推廣。

技術(shù)特征：

1.一種檢測(cè)n末端b型利鈉肽原的“關(guān)-開”型熒光生物傳感器，其特征在于，所述熒光生物傳感器包括鈀納米片以及熒光染料修飾的n末端b型利鈉肽原的核酸適配體組成的復(fù)合納米探針。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的熒光生物傳感器，其特征在于，所述n末端b型利鈉肽原的核酸適配體的序列為：5’-cag?ggg?gac?ggg?tcg?ggt?tac

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的熒光生物傳感器的制備方法，其特征在于，包括以下步驟：

4.一種檢測(cè)n末端b型利鈉肽原的方法，其特征在于，包括以下步驟：將上述復(fù)合納米探針與不同濃度的n末端b型利鈉肽原的標(biāo)準(zhǔn)品溶液渦旋混勻，避光靜置后繪制其在690nm-750nm范圍內(nèi)的熒光光譜，根據(jù)其在675nm最大發(fā)射波長(zhǎng)處的熒光強(qiáng)度變化，其熒光恢復(fù)效率與n末端b型利鈉肽原濃度的指數(shù)呈正比，以此構(gòu)建相應(yīng)的線性回歸方程，通過計(jì)算反應(yīng)溶液的熒光恢復(fù)效率可求得n末端b型利鈉肽原的濃度。

5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的檢測(cè)n末端b型利鈉肽原的方法，其特征在于，所述熒光生物傳感器反應(yīng)體系ph為6.5～8.5。

6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的檢測(cè)n末端b型利鈉肽原的方法，其特征在于，所述熒光生物傳感器反應(yīng)時(shí)間為0～6min。

7.根據(jù)權(quán)利要求4所述的檢測(cè)n末端b型利鈉肽原的方法，其特征在于，所述熒光生物傳感器孵育時(shí)間為0～20min。

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明提供了一種檢測(cè)N末端B型利鈉肽原的熒光生物傳感器、其制備方法及應(yīng)用。所述熒光生物傳感器主要由鈀納米片以及熒光染料修飾的N末端B型利鈉肽原的核酸適配體組成。由于鈀納米片與熒光染料修飾的N末端B型利鈉肽原的核酸適配體之間能夠發(fā)生熒光共振能量轉(zhuǎn)移以及內(nèi)濾效應(yīng)，導(dǎo)致體系熒光猝滅，熒光信號(hào)“關(guān)”，由于熒光染料修飾的核酸適配體對(duì)N末端B型利鈉肽原的特異性識(shí)別，使得熒光染料修飾的核酸適配體遠(yuǎn)離鈀納米片，體系熒光信號(hào)“開”，熒光恢復(fù)效率與N末端B型利鈉肽原的對(duì)數(shù)在濃度范圍為0.8?30pg/mL范圍內(nèi)具有良好線性關(guān)系，檢測(cè)限為0.21pg/mL。通過對(duì)體系熒光強(qiáng)度的變化實(shí)現(xiàn)在短時(shí)間對(duì)N末端B型利鈉肽原靈敏、快速、特異性檢測(cè)。

技術(shù)研發(fā)人員：張普,段佩瑩,王燚,孟小林
受保護(hù)的技術(shù)使用者：重慶醫(yī)科大學(xué)
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2024/12/26