本發(fā)明涉及蛋白質(zhì)相互作用檢測(cè)方法，尤其涉及一種活細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)相互作用實(shí)時(shí)熒光顯示方法。

背景技術(shù)：

1、研究蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用，不僅可以從分子水平揭示蛋白質(zhì)的功能，而且對(duì)于研究生長(zhǎng)、發(fā)育、分化和凋亡等生命活動(dòng)規(guī)律至關(guān)重要，為探討重大疾病的機(jī)理、疾病治療、疾病預(yù)防和新藥開(kāi)發(fā)提供重要的理論基礎(chǔ)。

2、現(xiàn)有的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用的方法主要分為細(xì)胞體外檢測(cè)方法和細(xì)胞在體檢測(cè)方法兩種；其中，細(xì)胞體外檢測(cè)方法包括：免疫共沉淀、串聯(lián)親和純化、臨近標(biāo)記法、融合蛋白沉降技術(shù)等；這些方法主要依賴于抗體和質(zhì)譜技術(shù)，而基于抗體或質(zhì)譜技術(shù)，會(huì)產(chǎn)生大量的假陽(yáng)性結(jié)果，且整個(gè)檢測(cè)過(guò)程繁瑣，耗時(shí)長(zhǎng)。細(xì)胞在體的蛋白質(zhì)檢測(cè)方法包括：酵母雙雜交，免疫熒光共定位，蛋白質(zhì)互補(bǔ)測(cè)試，熒光共振能量轉(zhuǎn)移法等，這些方法雖然能在活細(xì)胞內(nèi)檢測(cè)蛋白質(zhì)相互作用，但是，這些方法都是基于蛋白分子之間的距離來(lái)間接判斷蛋白質(zhì)是否存在相互作用，且受蛋白表達(dá)量的干擾，存在較高的假陽(yáng)性和局限性。

3、基于上述原因，導(dǎo)致現(xiàn)有的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用的檢測(cè)方法存在較高的假陽(yáng)性，準(zhǔn)確性存在不足。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本發(fā)明的目的在于提供一種活細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)相互作用實(shí)時(shí)熒光顯示方法，能夠避免研究蛋白質(zhì)間的相互作用時(shí)出現(xiàn)假陽(yáng)性，提高檢測(cè)準(zhǔn)確性。

2、為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供了一種活細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)相互作用實(shí)時(shí)熒光顯示方法，包括：

3、建立蛋白質(zhì)熒光顯示序列快速克隆質(zhì)粒α，蛋白質(zhì)熒光顯示快速克隆質(zhì)粒β和蛋白質(zhì)熒光顯示快速克隆質(zhì)粒γ；

4、將蛋白a的cdna序列克隆入蛋白質(zhì)熒光顯示序列快速克隆質(zhì)粒α和蛋白質(zhì)熒光顯示序列快速克隆質(zhì)粒β，蛋白b的cdna序列克隆入蛋白質(zhì)熒光顯示序列快速克隆質(zhì)粒γ；

5、將蛋白質(zhì)熒光顯示序列快速克隆質(zhì)粒α、β、γ分別單獨(dú)轉(zhuǎn)導(dǎo)，將蛋白質(zhì)熒光顯示序列快速克隆質(zhì)粒α結(jié)合γ共轉(zhuǎn)染工具細(xì)胞，將蛋白質(zhì)熒光顯示序列快速克隆質(zhì)粒β結(jié)合γ共轉(zhuǎn)染工具細(xì)胞；

6、轉(zhuǎn)染后觀察五組細(xì)胞內(nèi)蛋白a、蛋白b產(chǎn)生的熒光信號(hào)變化，確定蛋白a、蛋白b之間是否存在蛋白質(zhì)間相互作用。

7、其中，所述轉(zhuǎn)染后觀察五組細(xì)胞內(nèi)蛋白a、蛋白b產(chǎn)生的熒光信號(hào)變化，確定蛋白a、蛋白b之間是否存在蛋白質(zhì)間相互作用具體包括：

8、當(dāng)?shù)鞍譨定向遷移到特定的細(xì)胞器或結(jié)構(gòu)區(qū)域時(shí)，該細(xì)胞器或結(jié)構(gòu)區(qū)域出現(xiàn)蛋白a的熒光顯示或者熒光強(qiáng)度增強(qiáng)，同時(shí)還攜帶蛋白b進(jìn)入該細(xì)胞器或結(jié)構(gòu)區(qū)域，該位置出現(xiàn)蛋白b的熒光信號(hào)或者熒光信號(hào)增強(qiáng)，表示蛋白a和蛋白b之間存在相互作用；

9、當(dāng)?shù)鞍譨定向遷移到特定的細(xì)胞器或結(jié)構(gòu)區(qū)域時(shí)，該細(xì)胞器或結(jié)構(gòu)區(qū)域出現(xiàn)蛋白a的熒光顯示或者熒光強(qiáng)度顯著增強(qiáng)，同時(shí)蛋白b的熒光信號(hào)顯示位置、強(qiáng)度未發(fā)生變化，表示蛋白a和蛋白b之間不存在相互作用。

10、其中，所述蛋白質(zhì)熒光顯示序列快速克隆質(zhì)粒α表達(dá)帶有一種特定定位信號(hào)肽并融合了一種第一熒光信號(hào)的融合蛋白。

11、其中，所述蛋白質(zhì)熒光顯示快速克隆質(zhì)粒β表達(dá)融合了一種第一熒光信號(hào)的融合蛋白。

12、其中，所述蛋白質(zhì)熒光顯示快速克隆質(zhì)粒γ表達(dá)融合了一種第二熒光信號(hào)的融合蛋白。

13、本發(fā)明的一種活細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)相互作用實(shí)時(shí)熒光顯示方法，融合一種熒光信號(hào)肽(如綠色熒光蛋白)的蛋白a定位，然后檢測(cè)另一個(gè)融合了另一種熒光信號(hào)肽(如紅色熒光蛋白)的蛋白b定位是否發(fā)生改變，從而鑒定蛋白質(zhì)a與蛋白質(zhì)b是否具有相互作用。本方法通過(guò)改變蛋白的定位，使兩個(gè)蛋白之間只有存在真正的相互作用、直接結(jié)合方能使結(jié)合蛋白隨遷移蛋白發(fā)生定向位移，融合的熒光信號(hào)使得蛋白是否發(fā)生細(xì)胞器或區(qū)域遷移在活細(xì)胞實(shí)時(shí)可見(jiàn)、且現(xiàn)象明顯，可以顯著提高對(duì)蛋白質(zhì)間是否存在相互作用的判斷準(zhǔn)確性。整個(gè)技術(shù)方法簡(jiǎn)便、快速、可靠，避免背景技術(shù)所提及相關(guān)技術(shù)的復(fù)雜性、間接判斷導(dǎo)致的假陽(yáng)性等問(wèn)題；本方法利用不同細(xì)胞器的信號(hào)肽來(lái)構(gòu)建，因此適用于所有的真核細(xì)胞；本方法使用質(zhì)粒進(jìn)行構(gòu)建，而表達(dá)同種生物的蛋白的質(zhì)粒相同，因此可以在同種生物的不同細(xì)胞中高通量的檢測(cè)不同蛋白質(zhì)相互作用，從而構(gòu)建真核生物的蛋白互作網(wǎng)絡(luò)；本方法用于活細(xì)胞中，可實(shí)時(shí)進(jìn)行熒光顯像，從而觀察特定條件下的蛋白互作。本方法可利用普通熒光顯微鏡進(jìn)行觀察，使檢測(cè)方法更簡(jiǎn)便，對(duì)設(shè)備要求低。本發(fā)明能夠避免研究蛋白質(zhì)間的相互作用時(shí)出現(xiàn)假陽(yáng)性，提高檢測(cè)準(zhǔn)確性。

技術(shù)特征：

1.一種活細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)相互作用實(shí)時(shí)熒光顯示方法，其特征在于，包括：

2.如權(quán)利要求1所述的一種活細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)相互作用實(shí)時(shí)熒光顯示方法，其特征在于，

3.如權(quán)利要求2所述的一種活細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)相互作用實(shí)時(shí)熒光顯示方法，其特征在于，

4.如權(quán)利要求3所述的一種活細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)相互作用實(shí)時(shí)熒光顯示方法，其特征在于，

5.如權(quán)利要求4所述的一種活細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)相互作用實(shí)時(shí)熒光顯示方法，其特征在于，

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明涉及蛋白質(zhì)相互作用檢測(cè)方法技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種活細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)相互作用實(shí)時(shí)熒光顯示方法，包括：建立蛋白質(zhì)熒光顯示序列快速克隆質(zhì)粒α、β和γ；將蛋白A的cDNA序列克隆入蛋白質(zhì)熒光顯示序列快速克隆質(zhì)粒α和蛋白質(zhì)熒光顯示序列快速克隆質(zhì)粒β，蛋白B的cDNA序列克隆入蛋白質(zhì)熒光顯示序列快速克隆質(zhì)粒γ；將蛋白質(zhì)熒光顯示序列快速克隆質(zhì)粒α、β、γ分別單獨(dú)轉(zhuǎn)導(dǎo)，將蛋白質(zhì)熒光顯示序列快速克隆質(zhì)粒α結(jié)合γ、β結(jié)合γ共轉(zhuǎn)染工具細(xì)胞；轉(zhuǎn)染后觀察五組細(xì)胞內(nèi)蛋白A、蛋白B產(chǎn)生的熒光信號(hào)變化，確定蛋白A、蛋白B之間是否存在蛋白質(zhì)間相互作用；本發(fā)明能夠避免研究蛋白質(zhì)間的相互作用時(shí)出現(xiàn)假陽(yáng)性，提高檢測(cè)準(zhǔn)確性。

技術(shù)研發(fā)人員：陳典剛,李光輝,王欣欣,劉博,陳旭
受保護(hù)的技術(shù)使用者：中國(guó)人民解放軍陸軍軍醫(yī)大學(xué)第二附屬醫(yī)院
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2024/12/30