本技術(shù)總體上涉及生物標(biāo)志物的檢測和一種評價用于在生物標(biāo)志物發(fā)現(xiàn)或在受試者的醫(yī)學(xué)評價(如診斷測定)中使用的樣品或樣品集合的質(zhì)量或適用性的方法。

背景技術(shù)：

1、血液含有各種細(xì)胞和體液系統(tǒng)，用于對損傷或外來和傳染因子作出反應(yīng)。小的挑戰(zhàn)可誘發(fā)先天免疫系統(tǒng)(補(bǔ)體系統(tǒng)和諸如巨噬細(xì)胞的細(xì)胞)釋放信號和酶，導(dǎo)致血小板激活并觸發(fā)血液凝固。這些信號令人感興趣，因為它們可以直接參與防御和修復(fù)系統(tǒng)并充當(dāng)疾病的標(biāo)志物。然而，這種過程信號也可能對血液樣品制備或處理的效應(yīng)有反應(yīng)。如果樣品中的細(xì)胞裂解、如果血小板脫顆?；蛘呷绻a(bǔ)體系統(tǒng)被激活，則樣品被收集后可能在樣品中發(fā)生分析物濃度的變化，并且“高保真度”測量技術(shù)可檢測到所述變化。僅僅將血液暴露于空氣就可導(dǎo)致這些機(jī)制的意外激活。因此，改變樣品處理步驟的時間可改變血清或血漿的表觀組成，使得生理信息被在收集和處理期間賦予樣品的分析前變異性掩蔽。這些過程和蛋白質(zhì)對樣品處理中的細(xì)微變化的敏感性可損害它們作為生物標(biāo)志物的用途。

2、目前，多變量生物學(xué)的研究人員關(guān)注分析前樣品變化(通常稱為“批次效應(yīng)”)。可確定樣品質(zhì)量的程度在很大程度上限于視覺上明顯的變化，如紅色指示紅細(xì)胞裂解，并且渾濁指示高脂質(zhì)或其他污染物。這些相對粗糙的方法限制了除了最困難和最穩(wěn)健的蛋白質(zhì)測量之外的所有蛋白質(zhì)測量的可靠性。ostroff,r.等人(2010)j.proteomics73:649-666記錄了血清和血漿制備中的變化的一些復(fù)雜和非線性效應(yīng)。

3、需要特定的技術(shù)來確定是否符合樣品處理方案，以監(jiān)測合規(guī)性、拒絕低質(zhì)量樣品和/或?qū)λP(guān)注的分析物進(jìn)行校正。此類技術(shù)將改進(jìn)對生物標(biāo)志物研究、臨床診斷應(yīng)用、生物庫和藥物開發(fā)中所用的人或動物血液樣品的質(zhì)量的評價。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本技術(shù)包括用于評估樣品質(zhì)量的生物標(biāo)志物、方法、試劑、裝置、系統(tǒng)和試劑盒。本技術(shù)的生物標(biāo)志物是使用受樣品處理方案的變化影響的特定蛋白質(zhì)集合的測量值的線性回歸來鑒定的。在一些實(shí)施方案中，生物標(biāo)志物組包含對樣品處理敏感的蛋白質(zhì)。

2、在一些實(shí)施方案中，所述方法包括使用本文所述的基于多重慢解離率適體的測定來檢測生物標(biāo)志物，例如用于評估樣品質(zhì)量。在一些實(shí)施方案中，樣品是血液樣品、血漿樣品、血清樣品或尿液樣品。在一些實(shí)施方案中，樣品是血漿樣品或血清樣品。

3、在一些實(shí)施方案中，預(yù)測或估計樣品冷凍和解凍(凍融循環(huán))的次數(shù)。在一些實(shí)施方案中，樣品處理步驟包括樣品離心、傾析或抽吸經(jīng)離心上清液、以及冷凍傾析或抽吸的樣品中的一個或多個。

4、在一些實(shí)施方案中，提供了評估從受試者收集的樣品的質(zhì)量的方法，所述方法包括檢測所述樣品中的n種生物標(biāo)志物蛋白中的每一者的水平，其中n是至少1，并且其中所述n種生物標(biāo)志物蛋白中的至少1種、至少2種、至少3種、至少4種、至少5種、至少6種或至少7種選自lkha4、eif1b、ragp1、scfd1、pld3、甘露糖結(jié)合凝集素2、ilk1和rpl5，其中所述樣品是血清樣品。

5、在一些實(shí)施方案中，提供了方法，所述包括測量來自受試者的血清樣品中的n種生物標(biāo)志物蛋白中的每一者的水平，其中n是至少1，并且其中所述n種生物標(biāo)志物蛋白中的至少1種、至少2種、至少3種、至少4種、至少5種、至少6種或至少7種選自lkha4、eif1b、ragp1、scfd1、pld3、甘露糖結(jié)合凝集素2、ilk1和rpl5；以及基于所述n種生物標(biāo)志物蛋白的水平將所述樣品鑒定為分析樣品或陰性樣品，其中所述分析樣品是適合用于以下中的一項或多項中的樣品：蛋白質(zhì)生物標(biāo)志物發(fā)現(xiàn)分析、蛋白質(zhì)表達(dá)水平分析、診斷方法或預(yù)后方法，并且所述陰性樣品是不適合用作分析樣品的樣品。在一些實(shí)施方案中，在檢測之前將樣品冷凍和解凍。在一些此類實(shí)施方案中，確定在檢測之前樣品冷凍和解凍的次數(shù)。

6、在一些實(shí)施方案中，提供了方法。所述方法包括a)使來自受試者的血清樣品與一組捕獲試劑接觸，其中每種捕獲試劑對n種生物標(biāo)志物蛋白中的不同生物標(biāo)志物蛋白具有親和力，其中n是至少1，并且其中所述n種生物標(biāo)志物蛋白中的至少1種、至少2種、至少3種、至少4種、至少5種、至少6種或至少7種選自lkha4、eif1b、ragp1、scfd1、pld3、甘露糖結(jié)合凝集素2、ilk1和rpl5；以及b)用所述一組捕獲試劑測量n種生物標(biāo)志物蛋白中的每一者的水平。

7、在一些實(shí)施方案中，提供了用于比較從多個受試者收集的多個樣品的方法，所述方法包括檢測所述多個樣品中的每一個中的n種生物標(biāo)志物蛋白中的每一者的水平，其中n是至少1，并且其中所述n種生物標(biāo)志物蛋白中的至少1種、至少2種、至少3種、至少4種、至少5種、至少6種或至少7種是lkha4、eif1b、ragp1、scfd1、pld3、甘露糖結(jié)合凝集素2、ilk1和rpl5，其中所述樣品是血清樣品。在一些實(shí)施方案中，方法包括a)確定凍融循環(huán)次數(shù)，以及b)比較所述多個樣品中的每一個的確定的凍融循環(huán)次數(shù)。在一些實(shí)施方案中，方法包括將所述多個樣品鑒定為一致處理的或不一致處理的，其中一致處理的樣品都具有彼此在1、2、3、4或5次凍融循環(huán)內(nèi)的確定的凍融循環(huán)次數(shù)。在一些實(shí)施方案中，確定是基于將n種生物標(biāo)志物蛋白中的每一者的檢測水平與參考水平進(jìn)行比較，其中所述參考水平是具有1次凍融循環(huán)或2次凍融循環(huán)的樣品中存在的所述n種生物標(biāo)志物蛋白中的每一者的平均水平。在一些實(shí)施方案中，與參考水平相比的n種生物標(biāo)志物蛋白中的每一者的檢測水平指示凍融循環(huán)次數(shù)是大于1、大于2、大于3、大于4、大于5、大于7或大于10次凍融循環(huán)；或者其中在線性回歸模型中使用的所述n種生物標(biāo)志物蛋白中的每一者的水平預(yù)測所述凍融循環(huán)次數(shù)是大于1、大于2、大于3、大于4、大于5、大于7或大于10次凍融循環(huán)。在一些實(shí)施方案中，所述確定是基于具有至少0.65、至少0.7、至少0.75、至少0.8、至少0.85、至少0.9或至少0.95的r2值的n種生物標(biāo)志物蛋白的組。

8、在一些實(shí)施方案中，所述方法包括對多個樣品進(jìn)行蛋白質(zhì)生物標(biāo)志物發(fā)現(xiàn)分析、蛋白質(zhì)表達(dá)水平分析、診斷方法或預(yù)后方法。在一些實(shí)施方案中，所述方法包括基于多個樣品中的每一個的確定的凍融循環(huán)次數(shù)來修改蛋白質(zhì)生物標(biāo)志物發(fā)現(xiàn)分析、蛋白質(zhì)表達(dá)水平分析、診斷方法或預(yù)后方法中的蛋白質(zhì)的組；或?qū)⑺鰳悠分械囊环N或多種蛋白質(zhì)鑒定為受所述凍融循環(huán)次數(shù)影響；或?qū)⑺鰳悠分械囊环N或多種蛋白質(zhì)的水平鑒定為受所述凍融循環(huán)次數(shù)影響；或基于預(yù)測的凍融循環(huán)次數(shù)改變診斷、預(yù)后或健康評估相關(guān)測試中使用的蛋白質(zhì)；基于所述預(yù)測的凍融循環(huán)次數(shù)去除診斷、預(yù)后或健康評估相關(guān)測試中使用的蛋白質(zhì)。在一些實(shí)施方案中，所述生物標(biāo)志物蛋白的組的測量的生物標(biāo)志物蛋白的數(shù)量減少。

9、在一些實(shí)施方案中，確定措施符合臨床試驗樣品收集和處理方案。在一些實(shí)施方案中，在多于一個樣品收集部位收集多個樣品。在一些實(shí)施方案中，將來自第一樣品收集部位的多個樣品與來自第二樣品收集部位的第二多個樣品進(jìn)行比較。在一些實(shí)施方案中，可以基于凍融循環(huán)次數(shù)去除多個樣品中的一個或多個。

10、在一些實(shí)施方案中，提供了方法，所述方法包括檢測樣品中的n種生物標(biāo)志物蛋白中的每一者的水平，其中n是至少1，并且其中所述n種生物標(biāo)志物蛋白中的至少1種選自lkha4、eif1b、ragp1、scfd1、pld3、甘露糖結(jié)合凝集素2、ilk1和rpl5。在一些實(shí)施方案中，樣品是血清樣品。在一些實(shí)施方案中，血清樣品是人血清樣品。在一些實(shí)施方案中，凍融循環(huán)次數(shù)用n種生物標(biāo)志物蛋白中的每一者的水平來確定。在一些實(shí)施方案中，凍融循環(huán)次數(shù)是大于1、大于2、大于3、大于4、大于5、大于7或大于10次凍融循環(huán)。在一些實(shí)施方案中，所確定的凍融循環(huán)次數(shù)來源于統(tǒng)計模型中n種生物標(biāo)志物蛋白中的每一者的水平的輸入。在一些實(shí)施方案中，統(tǒng)計模型是線性回歸模型。

11、在一些實(shí)施方案中，提供了方法，所述方法包括檢測樣品中的至少1、2、3、4、5、6、7或8種生物標(biāo)志物蛋白中的每一者的水平，其中生物標(biāo)志物蛋白選自lkha4、eif1b、ragp1、scfd1、pld3、甘露糖結(jié)合凝集素2、ilk1和rpl5。在一些實(shí)施方案中，樣品是血清樣品。在一些實(shí)施方案中，血清樣品是人血清樣品。在一些實(shí)施方案中，凍融循環(huán)次數(shù)用至少1、2、3、4、5、6、7或8種生物標(biāo)志物蛋白中的每一者的水平來確定。在一些實(shí)施方案中，凍融循環(huán)次數(shù)是大于1、大于2、大于3、大于4、大于5、大于7或大于10次凍融循環(huán)。在一些實(shí)施方案中，所確定的凍融循環(huán)次數(shù)是大于1、大于2、大于3、大于4、大于5、大于7或大于10次凍融循環(huán)，并且來源于統(tǒng)計模型中至少1、2、3、4、5、6、7或8種生物標(biāo)志物蛋白中的每一者的水平的輸入。在一些實(shí)施方案中，統(tǒng)計模型是線性回歸模型。在一些實(shí)施方案中，所述方法還包括修改蛋白質(zhì)生物標(biāo)志物發(fā)現(xiàn)分析、蛋白質(zhì)表達(dá)水平分析、診斷方法或預(yù)后方法中的蛋白質(zhì)的組；將所述樣品中的一種或多種蛋白質(zhì)鑒定為受影響；將所述樣品中的一種或多種蛋白質(zhì)的水平鑒定為受影響；改變診斷、預(yù)后或健康評估相關(guān)測試中使用的蛋白質(zhì)；或去除診斷、預(yù)后或健康評估相關(guān)測試中使用的一種或多種蛋白質(zhì)，各自基于線性回歸模型的結(jié)果。

12、在一些實(shí)施方案中，評估從受試者收集的樣品的質(zhì)量的方法包括檢測n種生物標(biāo)志物蛋白，其中所述n種生物標(biāo)志物蛋白中的一者或多者與在檢測之前樣品冷凍和解凍的次數(shù)相關(guān)。

13、在一些實(shí)施方案中，n是1，n是2，n是3，n是4，n是5，n是6，n是7，或者n是8。在實(shí)施方案中，測量另外的生物標(biāo)志物，并且n是9，n是10，n是11，n是12，n是13，n是14，n是15，n是16，n是17，n是18，n是19，或者n是20或更大。在一些實(shí)施方案中，所有n種生物標(biāo)志物蛋白選自表1中的列表。

14、在一些實(shí)施方案中，受試者是人受試者。在一些實(shí)施方案中，樣品是從全血樣品獲得的血清樣品。在一些實(shí)施方案中，通過本文的方法確定的凍融循環(huán)次數(shù)是1、2、3、4、5、7、10次或更多次凍融循環(huán)。在一些實(shí)施方案中，所述方法是在體外執(zhí)行。在一些實(shí)施方案中，近似凍融循環(huán)次數(shù)來源于統(tǒng)計模型中n種生物標(biāo)志物蛋白中的每一者的水平的輸入。在一些實(shí)施方案中，統(tǒng)計模型是線性回歸模型。

15、在一些實(shí)施方案中，樣品被鑒定為通過質(zhì)量評估或未通過質(zhì)量評估。在一些這樣的實(shí)施方案中，鑒定至少部分地基于樣品中的n種生物標(biāo)志物蛋白的檢測水平。在一些實(shí)施方案中，鑒定至少部分地基于所確定的凍融循環(huán)次數(shù)。在一些實(shí)施方案中，如果樣品被鑒定為通過質(zhì)量評估，則所述樣品進(jìn)行進(jìn)一步分析，或者如果樣品被鑒定為未通過質(zhì)量評估，則丟棄所述樣品。

16、在一些實(shí)施方案中，本文提供了評估多個樣品的質(zhì)量的方法，所述方法包括檢測來自多個受試者的多個樣品中的n種生物標(biāo)志物中的每一者的水平。在一些這樣的實(shí)施方案中，確定凍融循環(huán)次數(shù)并在多個樣品之間進(jìn)行比較。在一些這樣的實(shí)施方案中，確定多個樣品之間的樣品處理的一致性。

17、在一些實(shí)施方案中，所述方法包括使來自受試者的樣品的生物標(biāo)志物蛋白與一組捕獲試劑接觸，其中所述一組捕獲試劑中的每種捕獲試劑特異性結(jié)合至正被檢測的一種生物標(biāo)志物蛋白。在一些實(shí)施方案中，所述方法包括使來自受試者的樣品的生物標(biāo)志物蛋白與一組捕獲試劑接觸，其中所述一組捕獲試劑中的每種捕獲試劑特異性結(jié)合至正被檢測的不同的生物標(biāo)志物蛋白。在一些實(shí)施方案中，每種捕獲試劑是抗體或適體。在一些實(shí)施方案中，每種生物標(biāo)志物捕獲試劑是適體。在一些實(shí)施方案中，至少一種適體是慢解離率適體。在一些實(shí)施方案中，至少一種慢解離率適體包含至少1個、至少2個、至少3個、至少4個、至少5個、至少6個、至少7個、至少8個、至少9個或至少10個具有修飾的核苷酸。在一些實(shí)施方案中，每種慢解離率適體以≥20分鐘、≥30分鐘、≥60分鐘、≥90分鐘、≥120分鐘、≥150分鐘、≥180分鐘、≥210分鐘或≥240分鐘的解離率(t1/2)結(jié)合至其靶蛋白。在一些實(shí)施方案中，所測量的每種蛋白質(zhì)的水平由相對熒光單位(rfu)或蛋白質(zhì)濃度確定。

18、在一些實(shí)施方案中，提供了一種試劑盒，所述試劑盒包含n種生物標(biāo)志物蛋白捕獲試劑，其中n是至少1，并且所述捕獲試劑中的至少1種、至少2種、至少3種、至少4種、至少5種、至少6種或至少7種結(jié)合至lkha4、eif1b、ragp1、scfd1、pld3、甘露糖結(jié)合凝集素2、ilk1或rpl5。在一些實(shí)施方案中，每種捕獲試劑結(jié)合至不同的生物標(biāo)志物蛋白。在一些實(shí)施方案中，n是1，n是2，n是3，n是4，n是5，n是6，n是7，n是8，n是9，n是10，n是11，n是12，n是13，n是14，n是15，n是16，n是17，n是18，n是19，或者n是20或更大。在一些實(shí)施方案中，試劑盒包含來自多個樣品處理組的捕獲試劑。

19、在一些實(shí)施方案中，n種生物標(biāo)志物蛋白捕獲試劑中的每一者特異性結(jié)合至選自表1的生物標(biāo)志物蛋白。在一些實(shí)施方案中，n種生物標(biāo)志物捕獲試劑中的每一者是抗體或適體。在一些實(shí)施方案中，每種生物標(biāo)志物捕獲試劑是適體。在一些實(shí)施方案中，至少一種適體是慢解離率適體。在一些實(shí)施方案中，至少一種慢解離率適體包含至少1個、至少2個、至少3個、至少4個、至少5個、至少6個、至少7個、至少8個、至少9個或至少10個具有修飾的核苷酸。在一些實(shí)施方案中，每種慢解離率適體以≥20分鐘、≥30分鐘、≥60分鐘、≥90分鐘、≥120分鐘、≥150分鐘、≥180分鐘、≥210分鐘或≥240分鐘的解離率(t1/2)結(jié)合至其靶蛋白。在一些實(shí)施方案中，試劑盒用于檢測來自受試者的樣品中的n種生物標(biāo)志物蛋白。在一些實(shí)施方案中，試劑盒用于評估樣品或多個樣品的質(zhì)量。