本發(fā)明屬于臨床醫(yī)學(xué)病理技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種用于液基薄層細(xì)胞的免疫p16^ink4a抗原保存液及其制備方法。

背景技術(shù)：

宮頸癌是婦科最常見的女性生殖系統(tǒng)惡性腫瘤之一，發(fā)病率僅次于乳腺癌，位居女性惡性腫瘤第二位，嚴(yán)重威脅著女性的身體健康和生活質(zhì)量。中國是宮頸癌的高發(fā)國家，發(fā)生率及死亡率約占全世界的1/3。宮頸癌也是目前唯一病因明確，通過有效的早期診斷及治療可以完全治愈的癌癥。

當(dāng)前宮頸癌及癌前的病變的早期診斷分為“三階梯”。第一步為陰道脫落細(xì)胞學(xué)檢查，篩查出可疑病例。第二步為陰道鏡檢查，在陰道鏡下對(duì)可疑病例取活檢組織。然后進(jìn)行第三步活體組織檢查，最終確診。做為宮頸癌及癌前病變?cè)\斷的第一步，陰道脫落細(xì)胞學(xué)檢查起著非常重要的門戶作用，當(dāng)前脫落細(xì)胞學(xué)的主要檢查技術(shù)為液基薄層制片技術(shù)。液基薄層細(xì)胞制片術(shù)改良自傳統(tǒng)“巴氏涂片法”，使用獨(dú)特的細(xì)胞保存液和液基薄層制片機(jī)器，代替?zhèn)鹘y(tǒng)巴氏的手工涂片法，可制出均勻薄層的細(xì)胞有利于病理醫(yī)院鏡下觀察，降低了傳統(tǒng)巴氏的漏診率和假陽性、假陰性率。

然而液基薄層細(xì)胞制片術(shù)采用的依舊是非特異性的巴氏/he染色，并未從根源上彌補(bǔ)細(xì)胞學(xué)檢查的技術(shù)缺陷。受取材、染色、及病理醫(yī)生的主觀判斷等因素的影響，仍存在假陰性率高、靈敏度和特異性不理想等缺點(diǎn)。特別是對(duì)病理醫(yī)生的要求較高，且我國病理醫(yī)生缺乏、病理醫(yī)生的工作量大，易出現(xiàn)人為因素導(dǎo)致漏檢的情況。

尋找新的靈敏度和特異度更好的分子生物標(biāo)志物用于宮頸癌的早期診斷具有重要意義。

液基細(xì)胞學(xué)的技術(shù)缺陷促進(jìn)了宮頸癌及癌前病變篩查輔助技術(shù)的發(fā)展，當(dāng)前主要的輔助篩查技術(shù)為hpv檢測(cè)，目前hpv的檢測(cè)方法有多種，靈敏度和特異度較高的有雜交捕獲二代檢測(cè)系統(tǒng)(hc-ii)、熒光定量pcr技術(shù)等。

研究己揭示高危型人乳頭瘤病毒(humanpapillomavirus，hpv)的持續(xù)感染是導(dǎo)致宮頸癌的主要原因。目前已知的hpv亞型有近200種，大多數(shù)不會(huì)引起宮頸癌，只有14種高危型，是引起宮頸癌的主要原因。女性的一生中，感染hpv的風(fēng)險(xiǎn)超過50％，而這些感染者有90％以上可在一至兩年內(nèi)通過人體自身的免疫力清楚掉hpv，即轉(zhuǎn)陰自愈。因而hpv檢測(cè)作為一個(gè)篩查指標(biāo)明顯缺乏特異性，易導(dǎo)致病人的心理恐慌和過渡醫(yī)療。且hpv分子生物學(xué)檢測(cè)技術(shù)對(duì)實(shí)驗(yàn)環(huán)境和人員的要求較高，檢測(cè)價(jià)格較貴，限制了其在臨床上的廣泛應(yīng)用。

已知宮頸癌發(fā)生的主要原因是持續(xù)性的人乳頭瘤病毒(hpv)感染(99％以上)。hpv的持續(xù)感染會(huì)導(dǎo)致病毒的致癌基因蛋白e6和e7含量升高，e6和e7作用是可分別與人體抑癌基因蛋白p53和prb結(jié)合，e6通過抑制p53而阻斷凋亡，e7通過抑制prb使細(xì)胞周期失控，并導(dǎo)致p16^ink4a表達(dá)上調(diào)。

任力等人在“p16^ink4a和人乳頭瘤病毒檢測(cè)在液基細(xì)胞學(xué)篩查宮頸病變中的應(yīng)用”中通過選取8933名宮頸炎患者進(jìn)行液基薄層細(xì)胞學(xué)檢查，其中有64例呈不良反應(yīng)，應(yīng)用免疫組織化學(xué)sp方法檢測(cè)其p16^ink4a表達(dá)，同時(shí)采用實(shí)時(shí)定量pcr法檢測(cè)hpv表達(dá)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明的p16^ink4a表達(dá)與宮頸癌的發(fā)生、發(fā)展相關(guān)，并與宮頸病變分級(jí)及hpv感染高度相關(guān)，是篩查液基細(xì)胞學(xué)組織標(biāo)本宮頸病變的一個(gè)有用指標(biāo)(任力，狄文，何以豐等.p16～(ink4a)和人乳頭瘤病毒檢測(cè)在液基細(xì)胞學(xué)篩查宮頸病變中的應(yīng)用[j].診斷學(xué)理論與實(shí)踐，2008，7(1):80-82.)

韓雪松等人在“宮頸薄層液基細(xì)胞中p16^ink4a的表達(dá)在宮頸癌篩查中的意義”中通過選擇96例hpv陽性的宮頸液基層細(xì)胞學(xué)剩余標(biāo)本，制作液基薄片，利用sp免疫組化法檢測(cè)lct標(biāo)本中p16蛋白，并與組織活檢結(jié)果進(jìn)行對(duì)照，最終結(jié)果證明，p16蛋白異常表達(dá)與宮頸上皮內(nèi)瘤病變的發(fā)生有關(guān)，其可以作為宮頸上皮內(nèi)瘤的標(biāo)志物，輔助細(xì)胞學(xué)篩查(韓雪松，王鈁，徐琳等.宮頸薄層液基細(xì)胞中p16^ink4a的表達(dá)在宮頸癌篩查中的意義[j].中國實(shí)驗(yàn)診斷學(xué)，2011，15(4):656-659.)

目前，p16^ink4a做為高危hpv的代表和宮頸癌前病變的發(fā)展密切相關(guān)，具有較高的特異性和靈敏度，在宮頸組織活檢樣本中，已經(jīng)得到普遍被認(rèn)可與應(yīng)用。

液基細(xì)胞p16^ink4a免疫標(biāo)記染色即是利用p16^ink4a蛋白抗原與抗體的特異性結(jié)合原理，可從根本解決當(dāng)前液基細(xì)胞學(xué)的非特異性染色問題，避免宮頸癌前篩查易受病理醫(yī)生經(jīng)驗(yàn)和人員缺乏等影響因素。

p16^ink4a在細(xì)胞學(xué)中的應(yīng)用，首先需要一種合適的細(xì)胞保存液，傳統(tǒng)的液基細(xì)胞保存液具有裂解紅細(xì)胞、稀釋粘液、固定細(xì)胞等作用，可滿足液基薄層的制技術(shù)的要求，然而所使用的化學(xué)試劑易導(dǎo)致p16^ink4a抗原決定簇的封閉，對(duì)p16^ink4a抗原不能起到很好的保護(hù)作用，易導(dǎo)致染色結(jié)果的假陰性。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

為解決上述問題，本發(fā)明提供了一種用于液基薄層細(xì)胞的免疫p16^ink4a抗原保存液。本發(fā)明保存液不僅適用于傳統(tǒng)的液基細(xì)胞制片、染色，還適用于宮頸液基細(xì)胞p16^ink4a蛋白免疫標(biāo)記染色，利用抗原抗體的特異性結(jié)合，為液基細(xì)胞學(xué)技術(shù)提供特異性的染色方法，避免了傳統(tǒng)非特異性巴氏染色的缺陷。本發(fā)明還提供了用于液基薄層細(xì)胞的免疫p16^ink4a抗原保存液的制備方法。

本發(fā)明通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的：

一種用于液基薄層細(xì)胞的免疫p16^ink4a抗原保存液，包括以下成分及其濃度：nacl60-100mmol/l、kcl2-10mmol/l、乙二胺四乙酸二鈉1-5mmol/l、尿素30-50mmol/l、檸檬酸鈉1-5mmol/l、蔗糖5-20mmol/l、peg-4004-10mmol/l、多聚甲醛2％-3％、甘油2-10mmol/l和二硫蘇糖醇10-20mmol/l。

優(yōu)選地，所述用于液基薄層細(xì)胞的免疫p16^ink4a抗原保存液包括以下成分及其濃度：nacl75-90mmol/l、kcl6-8mmol/l、乙二胺四乙酸二鈉3-4mmol/l、尿素40-45mmol/l、檸檬酸鈉2.5-4mmol/l、蔗糖12-17mmol/l、peg-4005.6-8.4mmol/l、多聚甲醛2-3％、甘油7.5-9mmol/l和二硫蘇糖醇13-18mmol/l。

優(yōu)選地，所述用于液基薄層細(xì)胞的免疫p16^ink4a抗原保存液包括以下成分及其濃度：nacl85mmol/l、kcl7.5mmol/l、乙二胺四乙酸二鈉3.5mmol/l、尿素42mmol/l、檸檬酸鈉3.6mmol/l、蔗糖16mmol/l、peg-4006.5mmol/l、多聚甲醛2％、甘油8.4mmol/l和二硫蘇糖醇16.5mmol/l。

一種用于液基層細(xì)胞的免疫p16^ink4a抗原保存液的制備方法，包括以下步驟：

s1.準(zhǔn)確稱取nacl、kcl和尿素，依次溶于純化水中，攪拌使其全部溶解，得溶液i；

s2.準(zhǔn)確稱取乙二胺四乙酸二鈉并溶于純化水中，加熱使其完全溶解后冷卻至室溫，得溶液ii；

s3.準(zhǔn)確稱取檸檬酸鈉、蔗糖溶于純化水中，攪拌使其全部溶解，得溶液iii。

s4.將上述溶液i、溶液ii和溶液iii混合均勻后，然后加入peg-400、多聚甲醛和甘油，攪拌使其混合均勻，得溶液iv；

s5.將上述溶液iv調(diào)節(jié)ph值至7.5-8.0，得溶液v；

s6.向上述溶液v中添加二硫蘇糖醇，攪拌使其完全溶解，即得。

優(yōu)選地，所述步驟(5)中用乙酸/naoh調(diào)節(jié)ph值至7.8，所述步驟(6)所得溶液ph為7.0-8.0。

在本發(fā)明用于液基薄層細(xì)胞的免疫p16^ink4a抗原保存液中，nacl和kcl作為滲透壓穩(wěn)定劑，能夠有效維持體系滲透壓；尿素作為紅細(xì)胞處理劑，使本發(fā)明保存液中其無需添加裂解液即可將全部紅細(xì)胞徹底清除，同時(shí)完美保存有診斷價(jià)值的各種有核細(xì)胞形態(tài)；二硫蘇糖醇是本發(fā)明主要的粘液處理劑，其與其它成分有效結(jié)合，使本發(fā)明保存液分解粘液能力強(qiáng)，能夠最大限度釋放有診斷價(jià)值的細(xì)胞，并能防止堵塞膜孔。

本發(fā)明使用多聚甲醛固定液代替了傳統(tǒng)液基的乙醇/甲醇固定液，從而對(duì)p16^ink4a抗原具有更好的保護(hù)效果；乙二胺四乙酸二鈉是一種抗聚集試劑，能避免細(xì)胞堆積，peg-400不僅能保護(hù)細(xì)胞骨架的完整性，防止細(xì)胞水腫，而且作為保濕增容劑，其還能夠有效調(diào)和本發(fā)明保存液體系中其它成分，在本發(fā)明保存液體系濃度范圍內(nèi)，二者相互作用能夠發(fā)揮很好的穩(wěn)定和分散作用，保證保存液的穩(wěn)定性。

保存液體系中的化學(xué)物質(zhì)往往容易導(dǎo)致p16^ink4a抗原決定簇封閉，從而導(dǎo)致染色結(jié)果的假陰性。本發(fā)明保存液體系中添加有檸檬酸鈉、蔗糖和甘油，其與本發(fā)明體系中其它成分共同作用，能夠保護(hù)p16^ink4a抗原決定簇不受其它化學(xué)試劑的影響而封閉。

本發(fā)明保存液中各成分能夠有效結(jié)合在一起，使本發(fā)明保存液與現(xiàn)有技術(shù)相比具有以下優(yōu)勢(shì)：

(1)本發(fā)明保存液在普通液基薄層制片中不僅能夠很好的保存細(xì)胞的形態(tài)，對(duì)粘液樣本和血液樣本的也有很好的處理效果；

(2)本發(fā)明保存液不僅能保存細(xì)胞形態(tài)還能長時(shí)間保護(hù)p16ink4a抗原決定簇；

(3)本發(fā)明保存液成分簡單、價(jià)格低廉、操作方便，大大節(jié)省了制備樣品的時(shí)間，易于推廣。

附圖說明

圖1：本發(fā)明保存液對(duì)血液樣本中的紅細(xì)胞裂解情況；

圖2：本發(fā)明保存液對(duì)粘液樣本中粘液、細(xì)胞形態(tài)的觀察；

圖3：p16^ink4a免疫標(biāo)記陰性染色；

圖4：p16^ink4a免疫標(biāo)記陽性染色；

圖5：本發(fā)明保存液保存的細(xì)胞p16^ink4a蛋白免疫標(biāo)記染色；

圖6：cps03細(xì)胞保存液保存的細(xì)胞p16^ink4a蛋白免疫標(biāo)記染色；

圖7：thinprep保存液保存的細(xì)胞p16^ink4a蛋白免疫標(biāo)記染色。

具體實(shí)施方式

下面將結(jié)合說明書附圖和實(shí)施例進(jìn)一步的詳細(xì)說明本發(fā)明。需要指出的是，以下說明僅僅是對(duì)本發(fā)明要求保護(hù)的技術(shù)方案的舉例說明，并非對(duì)這些技術(shù)方案的任何限制。本發(fā)明的保護(hù)范圍以所附權(quán)利要求書記載的內(nèi)容為準(zhǔn)。

peg-400購于無錫市千聚恒貿(mào)易有限公司；cps03細(xì)胞保存液和thinprep細(xì)胞保存液由本公司廣州江元醫(yī)療科技有限公司提供。

實(shí)施例1一種用于液基薄層細(xì)胞的免疫p16^ink4a抗原保存液

所述用于液基薄層細(xì)胞的免疫p16^ink4a抗原保存液，由以下成分及其濃度組成：nacl85mmol/l、kcl7.5mmol/l、乙二胺四乙酸二鈉3.5mmol/l、尿素42mmol/l、檸檬酸鈉3.6mmol/l、蔗糖16mmol/l、peg-4006.5mmol/l、多聚甲醛2％、甘油8.4mmol/l和二硫蘇糖醇16.5mmol/l。

所述用于液基薄層細(xì)胞的免疫p16^ink4a抗原保存液的制備方法，包括以下步驟：

s1.準(zhǔn)確稱取nacl、kcl和尿素，依次溶于純化水中，攪拌使其全部溶解，得溶液i；

s2.準(zhǔn)確稱取乙二胺四乙酸二鈉并溶于純化水中，加熱使其完全溶解后冷卻至室溫，得溶液ii；

s3.準(zhǔn)確稱取檸檬酸鈉、蔗糖溶于純化水中，攪拌使其全部溶解，得溶液iii。

s4.將上述溶液i、溶液ii和溶液iii混合均勻后，然后加入peg-400、多聚甲醛和甘油，攪拌使其混合均勻，得溶液iv；

s5.將上述溶液iv用乙酸/naoh調(diào)節(jié)ph值至7.8，得溶液v；

s6.向上述溶液v中添加二硫蘇糖醇，攪拌使其完全溶解，使溶液ph值為7.5，即得。

實(shí)施例2一種用于液基薄層細(xì)胞的免疫p16^ink4a抗原保存液

所述用于液基薄層細(xì)胞的免疫p16^ink4a抗原保存液，由以下成分及其濃度組成：nacl60mmol/l、kcl2mmol/l、乙二胺四乙酸二鈉1mmol/l、尿素30mmol/l、檸檬酸鈉1mmol/l、蔗糖5mmol/l、peg-4004mmol/l、多聚甲醛2％、甘油2mmol/l和二硫蘇糖醇10mmol/l。

所述用于液基薄層細(xì)胞的免疫p16^ink4a抗原保存液的制備方法與實(shí)施例1類似。

實(shí)施例3一種用于液基薄層細(xì)胞的免疫p16^ink4a抗原保存液

所述用于液基薄層細(xì)胞的免疫p16^ink4a抗原保存液，由以下成分及其濃度組成：nacl100mmol/l、kcl10mmol/l、乙二胺四乙酸二鈉5mmol/l、尿素50mmol/l、檸檬酸鈉5mmol/l、蔗糖20mmol/l、peg-40010mmol/l、多聚甲醛2.5％、甘油10mmol/l和二硫蘇糖醇20mmol/l。

所述用于液基薄層細(xì)胞的免疫p16^ink4a抗原保存液的制備方法與實(shí)施例1類似。

實(shí)施例4一種用于液基薄層細(xì)胞的免疫p16^ink4a抗原保存液

所述用于液基薄層細(xì)胞的免疫p16^ink4a抗原保存液，由以下成分及其濃度組成：nacl75mmol/l、kcl6mmol/l、乙二胺四乙酸二鈉3mmol/l、尿素40mmol/l、檸檬酸鈉2.5mmol/l、蔗糖12mmol/l、peg-4005.6mmol/l、多聚甲醛3％、甘油7.5mmol/l和二硫蘇糖醇13mmol/l。

所述用于液基薄層細(xì)胞的免疫p16^ink4a抗原保存液的制備方法與實(shí)施例1類似。

實(shí)施例5一種用于液基薄層細(xì)胞的免疫p16^ink4a抗原保存液

所述用于液基薄層細(xì)胞的免疫p16^ink4a抗原保存液，由以下成分及其濃度組成：nacl90mmol/l、kcl8mmol/l、乙二胺四乙酸二鈉4mmol/l、尿素45mmol/l、檸檬酸鈉4mmol/l、蔗糖17mmol/l、peg-4008.4mmol/l、多聚甲醛2.3％、甘油9mmol/l和二硫蘇糖醇18mmol/l。

所述用于液基薄層細(xì)胞的免疫p16^ink4a抗原保存液的制備方法與實(shí)施例1類似。

對(duì)比例1一種用于液基薄層細(xì)胞的免疫p16^ink4a抗原保存液

所述用于液基薄層細(xì)胞的免疫p16^ink4a抗原保存液，由以下成分及其濃度組成：nacl85mmol/l、kcl7.5mmol/l、乙二胺四乙酸二鈉3.75mmol/l、尿素42mmol/l、peg-4006.5mmol/l、多聚甲醛2％和二硫蘇糖醇16.5mmol/l。

所述用于液基薄層細(xì)胞的免疫p16^ink4a抗原保存液的制備方法與實(shí)施例1類似。

與實(shí)施例1的區(qū)別在于，保存液中不含有檸檬酸鈉、蔗糖及甘油。

試驗(yàn)例1液基薄層制片觀察

按照標(biāo)準(zhǔn)取樣規(guī)程，用一次性宮頸刷刷取女性患者宮頸移形區(qū)的細(xì)胞樣本(包含粘液較多樣本和血液樣本)，然后將取樣刷放入本發(fā)明實(shí)施例1制備得到的保存液中保存細(xì)胞。用全自動(dòng)沉降式制片機(jī)(jy-3200)進(jìn)行自動(dòng)制片和巴氏染色，然后顯微鏡下拍照，試驗(yàn)結(jié)果如圖1，圖2所示。

由圖1可知，經(jīng)實(shí)施例1制備得到的保存液保存的血液樣本中的紅細(xì)胞被全部裂解，制片和染色后觀察不會(huì)出現(xiàn)遮擋上皮細(xì)胞、干擾鏡下觀察現(xiàn)象。

由圖2可知，經(jīng)實(shí)施例1制備得到的保存液保存的粘液較多的樣本中粘液被打散，白細(xì)胞成均勻狀態(tài)，制片和染色后觀察不會(huì)出現(xiàn)遮擋上皮細(xì)胞、干擾鏡下觀察現(xiàn)象。

由圖1和圖2可知，經(jīng)實(shí)施例1制備得到的保存液在普通液基薄層制片中不僅能夠很好的保存細(xì)胞的形態(tài)，對(duì)粘液樣本和血液樣本的也有很好的處理效果。

試驗(yàn)例2不同樣本p16^ink4a免疫標(biāo)記染色觀察

按照標(biāo)準(zhǔn)取樣規(guī)程，用一次性宮頸刷刷取女性患者宮頸移形區(qū)的細(xì)胞樣本(包含組織學(xué)確診的宮頸病變樣本和無病變樣本)，然后將取樣刷放入本發(fā)明實(shí)施例1制備得到的保存液中保存細(xì)胞。用全自動(dòng)沉降式制片機(jī)(jy-3200)進(jìn)行自動(dòng)制片、用組織染色機(jī)(jy-6000)進(jìn)行p16^ink4a免疫標(biāo)記染色，然后顯微鏡下拍照，試驗(yàn)結(jié)果如圖3、圖4所示。

由圖3可知，p16^ink4a免疫標(biāo)記陰性染色，細(xì)胞形態(tài)清晰，無背景干擾；由圖4可知，p16^ink4a免疫標(biāo)記陽性染色，細(xì)胞形態(tài)清晰，陽性著色清晰易辨，p16^ink4a抗原保存較好。

試驗(yàn)例3宮頸癌細(xì)胞株sihap16^ink4a免疫標(biāo)記染色觀察

將宮頸癌細(xì)胞株siha分別在本發(fā)明實(shí)施例1制備得到的保存液、cps03細(xì)胞保存液和thinprep保存液中常溫保存5天后進(jìn)行液基薄層制片和p16^ink4a蛋白免疫標(biāo)記染色。結(jié)果如圖5、圖6及圖7所示。

由圖5、圖6及圖7可知，發(fā)明實(shí)施例1制備得到的保存液保存的細(xì)胞p16^ink4a蛋白免疫標(biāo)記染色程度和效果明顯優(yōu)于cps03細(xì)胞保存液和thinprep細(xì)胞保存液。

試驗(yàn)例4不同保存液對(duì)保存細(xì)胞的影響觀察

將宮頸癌細(xì)胞株siha分別在本發(fā)明實(shí)施例1制備得到的保存液、cps03細(xì)胞保存液、thinprep保存液以及對(duì)比例1制備得到的保存液中常溫保存5天后進(jìn)行液基薄層制片和p16^ink4a蛋白免疫標(biāo)記染色，同時(shí)進(jìn)行細(xì)胞形態(tài)觀察，對(duì)p16^ink4a蛋白免疫標(biāo)記染色程度以及陽性染色細(xì)胞比例進(jìn)行觀察和統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果如表1所述。

表1不同保存液對(duì)保存細(xì)胞的影響觀察

由表1可知，實(shí)施例1保存液不僅能保存細(xì)胞形態(tài)還能長時(shí)間保護(hù)p16^ink4a抗原決定簇；cps03保存液、thinprep保存液及對(duì)比例1保存液僅能保存細(xì)胞的形態(tài)。實(shí)施例1與對(duì)比例1相比，說明在本發(fā)明保存液中檸檬酸鈉、蔗糖和甘油的添加對(duì)p16^ink4a抗原決定簇具有明顯的保護(hù)作用。

綜上可知，本發(fā)明保存液不僅適用于傳統(tǒng)的液基細(xì)胞制片、染色，還適用于宮頸液基細(xì)胞p16^ink4a蛋白免疫標(biāo)記染色，利用抗原抗體的特異性結(jié)合，為液基細(xì)胞學(xué)技術(shù)提供特異性的染色方法，避免了傳統(tǒng)非特異性巴氏染色的缺陷。