本發(fā)明屬于禽白血病病毒檢測(cè)領(lǐng)域，尤其涉及一種雞傳染性喉氣管炎活疫苗中a、b、j亞群禽白血病病毒的檢測(cè)方法。

背景技術(shù)：

禽白血病病毒(avianleukosisvirus，alv)屬于反轉(zhuǎn)錄病毒科，d反轉(zhuǎn)錄病毒屬，可引起禽類(lèi)的良性、惡性可傳播腫瘤性疾病。alv分為a-k共11個(gè)亞群，其中a、b、c、d、e、j、k這7個(gè)亞群可自然感染雞，a、b、j亞群在臨床易分離到，k亞群為近期發(fā)現(xiàn)的新亞群。alv引起的臨床感染和亞臨床癥狀給世界養(yǎng)禽業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。在雞群中，由alv感染造成的死亡率有1％-2％，偶爾可達(dá)到20％甚至更高。除此之外，alv還能造成亞臨床感染，造成產(chǎn)蛋率下降，影響機(jī)體免疫抑制，降低疫苗免疫的成功率，嚴(yán)重影響生產(chǎn)性能。

alv既可以通過(guò)種蛋垂直傳播，也可以通過(guò)接觸水平傳播。此外，使用污染了alv的活疫苗也可能會(huì)造成病毒的傳播。盡管目前部分大型種禽公司開(kāi)展了對(duì)alv的凈化工作并取得成效，但臨床生產(chǎn)中仍時(shí)有禽白血病的發(fā)生，而且表現(xiàn)各異，因此活疫苗中外源性禽白血病病毒的檢測(cè)對(duì)于禽白血病的凈化和防控具有極其重要的意義。

市售商品化活疫苗中a、b、j亞群禽白血病病毒的檢測(cè)方法主要是采用直接pcr的方法，但是直接pcr檢測(cè)可能因?yàn)椴《竞可俣霈F(xiàn)漏檢的情況；另外，也可能出現(xiàn)直接pcr擴(kuò)增出的目的片段是基因片段而不是完整的活病毒的情況。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種有效、準(zhǔn)確、可靠的雞傳染性喉氣管炎活疫苗中a、b、j亞群禽白血病病毒的檢測(cè)方法。

為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案：

雞傳染性喉氣管炎活疫苗中a、b、j亞群禽白血病病毒的檢測(cè)方法，采用dmem對(duì)商品化雞傳染性喉氣管炎活疫苗進(jìn)行稀釋?zhuān)缓蠼臃Ndf-1細(xì)胞，37℃作用1h后換成含1％fbs的dmem進(jìn)行培養(yǎng)7天；收集細(xì)胞培養(yǎng)上清進(jìn)行禽白血病病毒p27群特異性抗原alv-p27檢測(cè)；對(duì)alv-p27陽(yáng)性樣品收集細(xì)胞培養(yǎng)物并抽取cdna，用亞群特異性引物進(jìn)行a、b、j亞群禽白血病病毒的鑒定，其對(duì)應(yīng)陽(yáng)性孔細(xì)胞，用亞群特異性單抗進(jìn)行ifa檢測(cè)。

上述檢測(cè)方法，按以下步驟操作進(jìn)行：

(1)無(wú)菌條件下將2mldmem(dulbecco’smodifiedeaglemedium)加入商品化雞傳染性喉氣管炎活疫苗中，使其溶解；

(2)將溶解的疫苗使用dmem進(jìn)行倍比稀釋?zhuān)♂尡壤謩e為1∶2、1∶4、1∶8、1∶16、1∶32、1∶64，采用各稀釋比例的疫苗稀釋液作用于單層df-1細(xì)胞1h，隨后換成含1％fbs(foetalbovineserum)的dmem維持培養(yǎng)至7天后，通過(guò)觀察細(xì)胞生長(zhǎng)狀況，篩選出疫苗的最優(yōu)稀釋比例為1∶16，然后進(jìn)行a、b、j亞群禽白血病病毒檢測(cè)；

(3)按1∶16稀釋疫苗，疫苗稀釋液以24孔板復(fù)孔作用于單層df-1細(xì)胞1h，隨后換成含1％fbs的dmem維持培養(yǎng)至7天；

(4)收集細(xì)胞培養(yǎng)物上清，進(jìn)行alv-p27抗原檢測(cè)；alv-p27陽(yáng)性樣品收集細(xì)胞培養(yǎng)物抽取cdna，用亞群特異性引物進(jìn)行a、b、j亞群禽白血病病毒的鑒定，其對(duì)應(yīng)陽(yáng)性孔細(xì)胞，用亞群特異性單抗進(jìn)行ifa檢測(cè)；

(5)鑒定為陽(yáng)性者則取同一批號(hào)另一瓶疫苗按照上述步驟進(jìn)行復(fù)檢，以排除操作污染的可能性。

alv-p27抗原檢測(cè)所用試劑盒為idexxalv-p27試劑盒。

稀釋液為gibco生產(chǎn)的dmem。

維持培養(yǎng)液為含1％fbs的dmem。

由于傳染性喉氣管炎病毒感染df-1細(xì)胞后會(huì)有溶細(xì)胞的表現(xiàn)，且疫苗中傳染性喉氣管炎病毒含量高，破壞細(xì)胞快，但alv病毒含量少，在細(xì)胞中復(fù)制較慢。據(jù)此，發(fā)明人建立了一種雞傳染性喉氣管炎活疫苗中a、b、j亞群禽白血病病毒的檢測(cè)方法，采用dmem對(duì)商品化雞傳染性喉氣管炎活疫苗進(jìn)行稀釋?zhuān)缓蠼臃Ndf-1細(xì)胞，37℃作用1h后換成含1％fbs的dmem進(jìn)行培養(yǎng)7天；收集細(xì)胞培養(yǎng)上清進(jìn)行禽白血病病毒p27群特異性抗原alv-p27檢測(cè)；對(duì)alv-p27陽(yáng)性樣品收集細(xì)胞培養(yǎng)物并抽取cdna，用亞群特異性引物進(jìn)行a、b、j亞群禽白血病病毒的鑒定，其對(duì)應(yīng)陽(yáng)性孔細(xì)胞，用亞群特異性單抗進(jìn)行ifa檢測(cè)。該法可以使活病毒在細(xì)胞中進(jìn)行增殖，彌補(bǔ)了直接pcr檢測(cè)的不足，同時(shí)具有有效、準(zhǔn)確、可靠等特點(diǎn)，對(duì)于禽白血病的防控具有重要的意義。實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明，該法成功從雞傳染性喉氣管炎活疫苗中檢測(cè)出一株alv-j并命名為gx14yyd2。

附圖說(shuō)明

圖1是商品化雞傳染性喉氣管炎活疫苗培養(yǎng)條件優(yōu)化的結(jié)果圖，圖中：從上至下、從左至右的稀釋比例分別為1∶2、1∶4、1∶8、1∶16、1∶32、1∶64。

圖2是本發(fā)明雞傳染性喉氣管炎活疫苗中a、b、j亞群禽白血病病毒的檢測(cè)方法的流程圖。

圖3是具體實(shí)施方式中使用分型引物對(duì)純化后細(xì)胞培養(yǎng)物的pcr鑒定結(jié)果圖，圖中：m為dl2000dnamaker；1為陰性對(duì)照；2為alv-a擴(kuò)增結(jié)果；3為alv-b擴(kuò)增結(jié)果；4為alv-j擴(kuò)增結(jié)果。

圖4是間接免疫熒光檢測(cè)結(jié)果圖，圖中分別為毒株gx14yyd2在df-1細(xì)胞中針對(duì)j亞群?jiǎn)慰筰fa結(jié)果；毒株gx14yyd2在df-1細(xì)胞中針對(duì)a亞群?jiǎn)慰筰fa結(jié)果；毒株gx14yyd2在df-1細(xì)胞中針對(duì)b亞群?jiǎn)慰筰fa結(jié)果；陰性對(duì)照結(jié)果。

具體實(shí)施方式

1.疫苗

市售商品化雞傳染性喉氣管炎活疫苗。

2.方法

2.1引物設(shè)計(jì)

引物參照文獻(xiàn)設(shè)計(jì)，并由上海華大生物工程有限公司合成，alv的分型引物見(jiàn)表1。

表1引物序列

2.2市售商品化雞傳染性喉氣管炎活疫苗培養(yǎng)條件的優(yōu)化

無(wú)菌條件下將2mldmem(dulbecco’smodifiedeaglemedium，gibco生產(chǎn)，c11995500bt，500ml/瓶)加入商品化雞傳染性喉氣管炎活疫苗中，使其溶解；將溶解的疫苗使用dmem進(jìn)行倍比稀釋?zhuān)♂尡壤謩e為1∶2、1∶4、1∶8、1∶16、1∶32、1∶64，稀釋后不同濃度的疫苗種df-1細(xì)胞，37℃繼續(xù)孵育1h，1h后棄上清液，更換為含1％fbs(foetalbovineserum，胎牛血清)的dmem，在37℃，5％co2條件下培養(yǎng)7天。然后熒光倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞狀態(tài)，結(jié)果如圖1所示，1∶2，1∶4，1∶8可見(jiàn)細(xì)胞脫落較多，1∶16，1∶32和1∶64細(xì)胞生長(zhǎng)良好，故采用其最小稀釋度1∶16為最優(yōu)條件。

2.3病毒分離

采用前述中最優(yōu)稀釋倍數(shù)(1∶16)稀釋后的疫苗以24孔板復(fù)孔作用于單層df-1細(xì)胞1h，隨后換液含1％fbs的dmem維持培養(yǎng)至7天。一部分細(xì)胞培養(yǎng)上清置于-80℃直至進(jìn)行alv-p27抗原的檢測(cè)，剩下的細(xì)胞培養(yǎng)物凍融3次后用通用型柱式基因組dna抽提試劑盒按照產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)提取cdna樣品，置于-20℃直至進(jìn)行pcr檢測(cè)。

2.4病原鑒定

用alv-p27抗原檢測(cè)試劑盒(alv-p27試劑盒，idexx生產(chǎn)，99-09254，5*96)并按試劑盒的說(shuō)明對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)上清進(jìn)行p27抗原的檢測(cè)。

以收集的細(xì)胞培養(yǎng)物按試劑盒說(shuō)明書(shū)提取cdna分別進(jìn)行a、b、j亞群的pcr檢測(cè)。alv-a/b的pcr反應(yīng)程序?yàn)?4℃預(yù)變性5分鐘，94℃變性45秒，50℃退火45秒，72℃延伸2分鐘，共35個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸10分鐘。alv-j的pcr反應(yīng)程序?yàn)?4℃預(yù)變性5分鐘，94℃變性45秒，56℃退火45秒，72℃延伸2分鐘，共35個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸10分鐘。1％瓊脂糖凝膠電泳鑒定pcr產(chǎn)物。結(jié)果如圖3所示，alv-a和alv-b為陰性，alv-j為陽(yáng)性。

將上述在37℃，5％co2條件下培養(yǎng)7天后的細(xì)胞孔，用pbs洗滌3次，每次5min；然后用4℃保存的冷乙醇∶丙酮(v/v＝2∶3)固定細(xì)胞5min，pbs洗滌3次，每次5min；將alv-j單抗je9按1∶250稀釋?zhuān)謩e加至試驗(yàn)組和空白對(duì)照組細(xì)胞孔中，每孔150μl，在37℃濕盒中孵育3h，pbs洗滌3次，每次5min；加入fitc標(biāo)記的兔抗鼠熒光抗體，按1∶300稀釋?zhuān)靠?50μl，在37℃濕盒中繼續(xù)孵育1h。pbs洗滌3次后在倒置熒光顯微鏡下觀察。

如圖4所示，抗alv-a和alv-b單克隆抗體呈陰性反應(yīng)，抗alv-j單克隆抗體呈陽(yáng)性反應(yīng)，感染組df-1細(xì)胞胞漿中可見(jiàn)明顯的綠色熒光，而陰性對(duì)照組中未見(jiàn)綠色熒光。結(jié)果表明，實(shí)驗(yàn)用市售商品化雞傳染性喉氣管炎活疫苗中檢測(cè)到一株alv-j(命名為gx14yyd2)。

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<110>廣西大學(xué)

<120>雞傳染性喉氣管炎活疫苗中a、b、j亞群禽白血病病毒的檢測(cè)方法

<130>雞傳染性喉氣管炎活疫苗中a、b、j亞群禽白血病病毒的檢測(cè)方法

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