本發(fā)明涉及生物傳感檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，具體地說(shuō)，涉及一種基于核酸層析生物傳感技術(shù)檢測(cè)阪崎腸桿菌的方法。

背景技術(shù)：

阪崎腸桿菌(克羅諾桿菌屬)是一種革蘭氏陰性、依靠周生鞭毛運(yùn)動(dòng)、無(wú)芽孢的兼性厭氧細(xì)菌。它是腸桿菌屬的一種條件致病菌，該菌引起的食源性疾病可導(dǎo)致嬰兒(尤其是新生兒)的腦膜炎、小腸結(jié)腸炎和菌血癥，報(bào)告病例的死亡率達(dá)20％-50％，幸存者常遺留嚴(yán)重的神經(jīng)系統(tǒng)疾病。近年來(lái)對(duì)食品(奶粉、巧克力、谷類食品、馬鈴薯、意大利面等)加工廠原料、生產(chǎn)環(huán)境及家庭中阪崎腸桿菌污染率的研究發(fā)現(xiàn)，阪崎腸桿菌在自然界中分布廣泛。在多起阪崎腸桿菌的暴發(fā)事件中發(fā)現(xiàn)，新生兒阪崎腸桿菌感染與嬰兒配方粉密切相關(guān)。

傳統(tǒng)的細(xì)菌檢測(cè)方法主要根據(jù)生理生化特征，但是傳統(tǒng)的檢測(cè)方法需要經(jīng)過(guò)前增菌、選擇性平板分離、生物化學(xué)鑒定等步驟，從取樣到確定結(jié)果需要5-7天，檢測(cè)周期長(zhǎng)，操作繁瑣，工作量大；利用抗原抗體反應(yīng)的特異性，對(duì)細(xì)菌進(jìn)行鑒別，已有半個(gè)多世紀(jì)的歷史，但是微生物抗體的篩選十分繁瑣，并且最終的檢測(cè)特異性不高；分子生物學(xué)檢測(cè)技術(shù)的不斷完善和發(fā)展，克服了傳統(tǒng)檢測(cè)方法實(shí)驗(yàn)操作繁瑣、耗時(shí)長(zhǎng)等問(wèn)題，也使得針對(duì)微生物開(kāi)展的快速檢測(cè)方法得到迅速發(fā)展，但是分子生物學(xué)方法的缺點(diǎn)在于不容易分析結(jié)果。隨著現(xiàn)代生物技術(shù)的發(fā)展，比傳統(tǒng)方法更快捷、更靈敏的生物傳感器新技術(shù)在食品安全檢測(cè)領(lǐng)域嶄露頭角。生物傳感器具備特異性強(qiáng)、靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)，可以簡(jiǎn)化分析檢測(cè)步驟，縮短分析時(shí)間，更重要的是使在線實(shí)時(shí)檢測(cè)成為可能，便于攜帶和野外作業(yè)，在食品安全領(lǐng)域得到了較快的發(fā)展。近年來(lái)，眾多新材料、新技術(shù)的開(kāi)發(fā)和應(yīng)用正成為研究的熱點(diǎn)，為生物傳感器的發(fā)展注入了新的活力，在微生物檢測(cè)領(lǐng)域顯示出巨大的應(yīng)用潛力。因此建立阪崎腸桿菌可靠的、快速的傳感器檢測(cè)方法，特別是能夠鑒定死活菌的方法，在日常監(jiān)控、市場(chǎng)篩查等方面具有重要意義。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種基于核酸層析生物傳感技術(shù)檢測(cè)阪崎腸桿菌的方法。

本發(fā)明構(gòu)思如下：開(kāi)發(fā)一種阪崎腸桿菌的快速和超靈敏檢測(cè)方法，特別是能夠鑒定死活菌的方法，建立基于疊氮碘化丙啶(pma)，環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)(lamp)和納米酶試紙的活菌檢測(cè)的連續(xù)級(jí)聯(lián)納米酶生物傳感器。在lamp反應(yīng)中，使用熒光素(fitc)修飾的和生物素(bio)修飾的引物測(cè)定阪崎腸桿菌的ompa基因。將pma與lamp組合，應(yīng)用于死活阪崎腸桿菌的分離。然后，使用納米酶探針制備基于磁性顆粒的免疫層析條(納米酶條)用于檢測(cè)擴(kuò)增信號(hào)，通過(guò)目視檢測(cè)或利用條形讀出器進(jìn)行結(jié)果判讀或定量，為現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)阪崎腸桿菌活菌提供快速、超靈敏和便捷的工具。

為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明目的，本發(fā)明首先提供用于檢測(cè)阪崎腸桿菌(enterobactersakazakii)的lamp引物組，包括(seqidno:1-4)：

外側(cè)正向引物f3：5’-tggtcccagttccacgata-3’；

外側(cè)反向引物b3：5’-acgccctgagctttgaaag-3’；

內(nèi)側(cè)正向引物fip：5’-taacctggtaaccaccgaacgctattcctaacgacggtccga-3’；

內(nèi)側(cè)反向引物bip：5’-gtacgttggcttcgaaatgggccagtgtcgcctttatacggc-3’。

其中，引物fip的5’端標(biāo)記生物素，引物bip的5’端標(biāo)記熒光素fitc。

本發(fā)明還提供一種納米酶核酸層析試紙條，所述試紙條的制備方法包括以下步驟：

1)fe3o4磁顆粒的制備；

2)納米酶探針(mnp)的制備：將fe3o4磁顆粒與生物素二抗進(jìn)行孵育，得到生物素二抗納米酶探針；

3)納米酶核酸層析試紙條的組裝：所述試紙條包括樣品墊、結(jié)合墊、硝酸纖維素膜和吸收墊，其中，所述硝酸纖維素膜上設(shè)有至少1條檢測(cè)線和1條質(zhì)控線；所述結(jié)合墊上固定有生物素二抗納米酶探針；

①分別用fitc抗體和生物素抗體在硝酸纖維素膜上劃出檢測(cè)線和質(zhì)控線，烘干；

②將上述樣品墊、結(jié)合墊、帶有檢測(cè)線和質(zhì)控線的硝酸纖維素膜以及吸收墊依次粘貼在底板(塑料襯板)上，完成試紙條的組裝。組裝好的試紙條的結(jié)構(gòu)示意圖見(jiàn)圖5。

步驟1)中利用水熱法合成fe3o4磁顆粒，具體為：將0.6-0.8gfecl3·6h2o溶解在20ml乙二醇中，然后加入1.5-2.0g醋酸鈉，劇烈攪拌30-40min，然后密封在高壓釜中，200℃加熱16-18h；磁顆粒產(chǎn)物用乙醇洗滌幾次，并在60℃下干燥；將二氯乙烷和n-羥基琥珀酰亞胺各5-8mg通過(guò)渦旋溶解在1ml去離子水中，制得混合液，然后將5-8mg磁顆粒加入混合液中，室溫下孵育30-40min，然后用磁鐵收集磁顆粒，用超純水洗滌兩次，即得fe3o4磁顆粒。

步驟2)具體為：將濃度100μg/ml的生物抗體加入50mmph6.0的醋酸鈉緩沖液中，然后與5-8mg的fe3o4磁顆?；旌?，將混合物渦旋混合，4℃孵育過(guò)夜；用ph7.0的pbs液洗滌兩次混合物，然后在50mmph7.2的tris緩沖液中室溫孵育30min；再用ph7.0的pbs液洗滌，即得到生物素二抗納米酶探針。

步驟3)中檢測(cè)線設(shè)在距硝酸纖維素膜下邊緣1.1cm的位置上，質(zhì)控線設(shè)在距硝酸纖維素膜下邊緣1.6cm的位置上。檢測(cè)線與質(zhì)控線之間的距離為4.5mm。按1.0μl/cm將fitc抗體和生物素抗體分別噴涂在硝酸纖維素膜的檢測(cè)線和質(zhì)控線上。其中檢測(cè)線和質(zhì)控線上包被的抗體的濃度均為0.5-2mg/ml?？贵w的最佳濃度為1mg/ml。

本發(fā)明中使用的生物素抗體購(gòu)自sigma公司，商品編號(hào)b7653，fitc抗體購(gòu)自sigma公司，商品編號(hào)f5636。生物素二抗為羊抗鼠igg。所用硝酸纖維素膜為millipore135s。

在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，所述納米酶核酸層析試紙條的制備如下：

步驟1)中利用水熱法合成fe3o4磁顆粒，具體為：將0.6gfecl3·6h2o溶解在20ml乙二醇中，然后加入1.5g醋酸鈉，劇烈攪拌30min，然后密封在高壓釜中，200℃加熱16h；磁顆粒產(chǎn)物用乙醇洗滌幾次，并在60℃下干燥；將二氯乙烷和n-羥基琥珀酰亞胺各5mg通過(guò)渦旋溶解在1ml去離子水中，制得混合液，然后將5mg磁顆粒加入混合液中，室溫下孵育30min，然后用磁鐵收集磁顆粒，用超純水洗滌兩次，即得fe3o4磁顆粒。

步驟2)具體為：將濃度100μg/ml的生物素二抗加入50mmph6.0的醋酸鈉緩沖液中，然后與5mg的fe3o4磁顆粒混合，將混合物渦旋混合，4℃孵育過(guò)夜；用ph7.0的pbs液洗滌兩次混合物，然后在50mmph7.2的tris緩沖液中室溫孵育30min；再用ph7.0的pbs液洗滌，即得到生物素二抗納米酶探針。最后將納米酶探針?lè)稚⒌?ml的5％bsa-pbs溶液中。使用jeol2000fx200kv透射電子顯微鏡(tem)觀察納米酶探針的粒徑，mnp的尺寸分布顯示平均直徑為200nm，可用于納米酶?jìng)鞲衅鞯臉?gòu)建。

將樣品墊、固定有生物素二抗納米酶探針的結(jié)合墊、帶有檢測(cè)線和質(zhì)控線的硝酸纖維素膜以及吸收墊依次粘貼在底板上，即完成試紙條的組裝。

本發(fā)明還提供基于核酸層析生物傳感技術(shù)檢測(cè)阪崎腸桿菌的方法，包括以下步驟：

s1、提取待測(cè)樣品dna，以dna為模板，利用上述lamp引物組進(jìn)行l(wèi)amp-pcr擴(kuò)增反應(yīng)；

s2、取10μl步驟s1的lamp-pcr擴(kuò)增產(chǎn)物，與50μl反應(yīng)緩沖液混合后滴加到上述納米酶核酸層析試紙條的樣品墊上，5-20min(優(yōu)選反應(yīng)時(shí)間不小于15min)后，在測(cè)試線和質(zhì)控線上滴加2滴底物緩沖液，反應(yīng)5min后然后通過(guò)肉眼觀察顯色情況，判讀結(jié)果：陰性反應(yīng)：質(zhì)控線顯色，檢測(cè)線不顯色；陽(yáng)性反應(yīng)：質(zhì)控線、檢測(cè)線均顯色；失效反應(yīng)：若質(zhì)控線不顯色，則檢測(cè)失敗或試紙條失效。

對(duì)于定量測(cè)量，采用與條帶讀取器軟件組合的便攜式條帶讀取器記錄條帶的光學(xué)強(qiáng)度，根據(jù)光學(xué)強(qiáng)度計(jì)算出待測(cè)樣品中阪崎腸桿菌的含量。

其中，步驟s2中所述反應(yīng)緩沖液為：4×ssc，0.2m/m％吐溫-20。

本發(fā)明中使用的底物緩沖液為商品化試劑(購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)，含有20×dab和20×h2o2。

本發(fā)明中，lamp-pcr擴(kuò)增反應(yīng)的體系為：1×bstthermalbuffer，0.6mbetaine，0.5mmdntps溶液，1.6μmfip，1.6μmbip，0.2μmf3，0.2μmb3，3.6mmmgso4，8ubstdna聚合酶大片段，2μl模板，ddh2o補(bǔ)足至25μl。

lamp-pcr反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃30min，然后85℃3min。

在步驟s1之前，還包括對(duì)待測(cè)樣品進(jìn)行疊氮碘化丙錠處理的步驟，具體為：向1μl含有活菌或熱滅活細(xì)菌的待測(cè)樣品中加入終濃度為10μg/ml的疊氮碘化丙錠，避光孵育5min，然后使用500w鹵素光源將樣品曝光5min，將樣品管放置在遠(yuǎn)離光源20cm處并水平放置在冰上，每隔30s搖動(dòng)樣品管以保持對(duì)光源的均勻暴露；然后進(jìn)行dna提取。

本發(fā)明進(jìn)一步提供含有所述用于檢測(cè)阪崎腸桿菌的lamp引物組和/或所述納米酶核酸層析試紙條的試劑盒。

本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn)：

(一)本發(fā)明首次開(kāi)發(fā)出pma、lamp與納米酶試紙相結(jié)合的納米酶生物傳感器。

(二)納米酶試紙首次成功地用于區(qū)分活菌細(xì)胞和死菌細(xì)胞。

(三)本發(fā)明的納米酶生物傳感器可用于阪崎腸桿菌活菌的現(xiàn)場(chǎng)診斷測(cè)試。

(四)提供一組新的lamp引物，可用于檢測(cè)阪崎腸桿菌的ompa基因。

(五)納米酶?jìng)鞲衅鲗?duì)阪崎腸桿菌的檢測(cè)下限可達(dá)10cfu/ml。

附圖說(shuō)明

圖1為本發(fā)明實(shí)施例1中阪崎腸桿菌lamp擴(kuò)增結(jié)果；其中，m為dnamarker，泳道1-3為阪崎腸桿菌陽(yáng)性擴(kuò)增，泳道4為陰性擴(kuò)增。

圖2為本發(fā)明實(shí)施例2中對(duì)生物傳感器的優(yōu)化；其中，(a)膜材料對(duì)生物傳感器峰面積的影響；(b)檢測(cè)線上fitc抗體濃度對(duì)生物傳感器峰面積的影響；(c)納米酶探針的用量體積對(duì)生物傳感器的峰面積的影響；(d)反應(yīng)時(shí)間對(duì)生物傳感器的峰面積的影響。

圖3為本發(fā)明實(shí)施例3中生物傳感器性能分析結(jié)果圖；其中，(a)傳感器重現(xiàn)性分析結(jié)果圖。(b)傳感器特異性分析結(jié)果圖。從左至右樣本分別是：雙蒸水，其他腸桿菌dna擴(kuò)增產(chǎn)物，其他非阪崎腸桿菌菌株dna擴(kuò)增產(chǎn)物，死阪崎腸桿菌菌株dna擴(kuò)增產(chǎn)物，活阪崎腸桿菌菌株dna擴(kuò)增產(chǎn)物；(c)傳感器穩(wěn)定性分析結(jié)果圖。從左至右為同一批傳感器每隔一周的測(cè)試結(jié)果。

圖4為本發(fā)明實(shí)施例4中阪崎腸桿菌檢測(cè)的線性曲線：峰面積隨lg(阪崎腸桿菌濃度)的變化。

圖5為本發(fā)明納米酶核酸層析試紙條的結(jié)構(gòu)示意圖。其中，1-樣品墊，2-硝酸纖維素膜，3-結(jié)合墊，4-吸收墊，5-測(cè)試線，6-質(zhì)控線，7-底板。

具體實(shí)施方式

以下實(shí)施例用于說(shuō)明本發(fā)明，但不用來(lái)限制本發(fā)明的范圍。若未特別指明，實(shí)施例均按照常規(guī)實(shí)驗(yàn)條件，如sambrook等分子克隆實(shí)驗(yàn)手冊(cè)(sambrookj&russelldw,molecularcloning:alaboratorymanual,2001)，或按照制造廠商說(shuō)明書(shū)建議的條件。

實(shí)施例1基于核酸層析生物傳感技術(shù)檢測(cè)阪崎腸桿菌的方法

1、實(shí)驗(yàn)材料

本實(shí)施例中所用阪崎腸桿菌與非阪崎腸桿菌菌株信息見(jiàn)表1。

表1所用的阪崎腸桿菌與非阪崎腸桿菌的信息

使用阪崎腸桿菌和其他細(xì)菌菌株來(lái)測(cè)定納米酶?jìng)鞲衅鞯奶禺愋?。在使用前將所有菌株?chǔ)存在-80℃的20％(v/v)甘油溶液中。隨后將其在lb培養(yǎng)基中過(guò)夜培養(yǎng)活化。通過(guò)分光光度法測(cè)定阪崎腸桿菌濃度。

2、阪崎腸桿菌基因組提取

采用newindustry公司的細(xì)菌基因組dna提取試劑盒，具體步驟如下：

(1)取細(xì)菌培養(yǎng)液1.5ml，12000g離心1min，盡量吸盡上清。

(2)向細(xì)菌沉淀中加入200μl溶液a，振蕩至菌體充分懸浮。

(3)向管中加入20μl10mg/ml的蛋白酶k，充分混勻，期間可顛倒離心管混勻次數(shù)，直至樣品消化完全為止。消化完全的標(biāo)志是液體清亮及黏稠。

(4)向管中加入2000μl溶液b，充分混勻。如出現(xiàn)白色沉淀，可置于75℃15-30min，沉淀即會(huì)消失，不影響后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

(5)向管中加入220μl無(wú)水乙醇，充分混勻，此時(shí)可能會(huì)出現(xiàn)絮狀沉淀，不影響dna的提取，可將溶液和絮狀沉淀都加入吸附柱中，靜置2min。

(6)12000g離心1min，廢棄液，將吸附柱放入收集管中。

(7)向吸附柱中加入700μl漂洗液，12000g離心1min，廢棄液，將吸附柱放入收集管中。

(8)向吸附柱中加入500μl漂洗液，12000g離心1min，廢棄液，將吸附柱放入收集管中。

(9)12000g離心2min，將吸附柱置于室溫或50℃溫箱放置數(shù)分鐘，去除吸附柱中殘留的漂洗液。

(10)將吸附柱放入一個(gè)干凈的離心管中，向吸附膜中央懸空滴加500-200μl經(jīng)75℃水浴預(yù)熱的洗脫液，室溫放置2min，12000g離心2min。

(11)離心所得洗脫液再加入吸附柱中，室溫放置2min，12000g離心2min，即可得到高質(zhì)量的細(xì)菌基因組dna。

3、疊氮碘化丙錠處理

將1μl活菌或熱滅活細(xì)菌，加入終濃度為10μg/ml的pma。將樣品避光孵育5min，并混合使pma穿透進(jìn)入死細(xì)胞。然后使用500w鹵素光源將樣品曝光5min。將樣品管放置在遠(yuǎn)離光源20cm處并水平放置在冰上以避免過(guò)度加熱。每30s搖動(dòng)樣品管以保持對(duì)光源的均勻暴露。采用newindμstry公司的細(xì)菌基因組dna提取試劑盒分離阪崎腸桿菌的基因組dna，提取的基因組dna在制備后立即進(jìn)行l(wèi)amp反應(yīng)。在pma處理的熱滅活阪崎腸桿菌樣品中，沒(méi)有提取出基因組dna，并且樣品不能使用lamp進(jìn)行擴(kuò)增。而未采用pma處理的死活菌基因組dna都可以進(jìn)行擴(kuò)增。可見(jiàn)，通過(guò)pma處理消除了死菌的擴(kuò)增條帶，僅留下活菌的擴(kuò)增條帶。由此證明pma處理可以有效地消除死細(xì)菌的dna信號(hào)。

4、引物設(shè)計(jì)

根據(jù)文獻(xiàn)公布的阪崎腸桿菌基因ompa的保守區(qū)，通過(guò)日本榮巖株式會(huì)社環(huán)介導(dǎo)引物在線設(shè)計(jì)軟件lampprimerdesigningsoftwareprimerexplorerv4.0(https://primerexplorer.jp/lamp4.0.0/index.html)針對(duì)基因設(shè)計(jì)引物，包括2條外引物f3、b3和2條內(nèi)引物fip、bip(表2)。在fip的5’端標(biāo)記生物素，bip的5’端標(biāo)記熒光素(fitc)。引物由上海英維捷基生物有限公司合成，用于后續(xù)的篩選優(yōu)化。

表2lamp所用的引物序列

5、阪崎腸桿菌基因組的擴(kuò)增

使用環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增法對(duì)阪崎腸桿菌基因組進(jìn)行擴(kuò)增(表3)。

表3lamp反應(yīng)體系

lamp反應(yīng)程序?yàn)椋涸?5℃反應(yīng)30min，在85℃反應(yīng)3min使酶失活。本實(shí)驗(yàn)采用每管25μl的體系，其中作為陰性對(duì)照組不加阪崎腸桿菌基因組。取擴(kuò)增產(chǎn)物5μl，與1μl上樣緩沖液混合均勻，用2％瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，阪崎腸桿菌出現(xiàn)典型dna擴(kuò)增條帶(圖1)，非阪崎腸桿菌菌株不產(chǎn)生任何條帶，由此證明設(shè)計(jì)的引物對(duì)阪崎腸桿菌具有100％的特異性。

6、磁顆粒和納米酶探針的制備

根據(jù)水熱法合成磁顆粒。具體地，將0.6gfecl3·6h2o溶解在20ml乙二醇中，然后加入1.5g醋酸鈉，劇烈攪拌30min，然后密封在高壓釜中，200℃加熱16h；磁顆粒產(chǎn)物用乙醇洗滌幾次，并在60℃下干燥；將二氯乙烷和n-羥基琥珀酰亞胺各5mg通過(guò)渦旋溶解在1ml去離子水中，制得混合液，然后將5mg磁顆粒加入混合液中，室溫下孵育30min，然后用磁鐵收集磁顆粒，用超純水洗滌兩次，即得fe3o4磁顆粒。

將濃度100μg/ml的生物素二抗(羊抗鼠igg)加入50mmph6.0的醋酸鈉緩沖液中，然后與5mg的fe3o4磁顆粒混合，將混合物渦旋混合，4℃孵育過(guò)夜；用ph7.0的pbs液洗滌兩次混合物，然后在50mmph7.2的tris緩沖液中室溫孵育30min；再用ph7.0的pbs液洗滌，得到生物素二抗納米酶探針。最后將納米酶探針?lè)稚⒌?ml的5％bsa-pbs溶液中。使用jeol2000fx200kv透射電子顯微鏡(tem)觀察納米酶探針的粒徑，mnp的尺寸分布顯示平均直徑為200nm，可用于納米酶?jìng)鞲衅鞯臉?gòu)建。

7、納米酶?jìng)鞲衅鞯闹苽?/p>

納米酶核酸層析試紙條(納米酶試紙)的組裝：所述試紙條包括樣品墊、結(jié)合墊、硝酸纖維素膜和吸收墊，其中，所述硝酸纖維素膜上設(shè)有至少1條檢測(cè)線和1條質(zhì)控線。

①樣品墊和結(jié)合墊的制備：先在底板上粘貼雙面膠，然后粘貼結(jié)合墊，然后在結(jié)合墊之上粘貼樣品墊，樣品墊與結(jié)合墊重疊2-4mm。其中結(jié)合墊上固定有生物素二抗納米酶探針。

②分別將fitc抗體和生物素抗體用最佳緩沖液稀釋至最佳濃度1mg/ml。將稀釋好的fitc抗體溶液裝入biodot劃膜機(jī)噴頭2，固定在距nc膜下邊緣1.1cm的位置上，稀釋好的生物素二抗溶液裝入biodot劃膜機(jī)噴頭1，固定在距nc膜下邊緣1.6cm的位置上。檢測(cè)線(t線)與質(zhì)控線(c線)之間的距離為4.5mm，按1.0μl/cm分別噴涂在nc膜的t線和c線上。將已噴好的nc膜37℃烘干過(guò)夜后備用。用切條機(jī)切成3.8mm寬的試紙，將切好的試紙放入裝有干燥劑的包裝袋內(nèi)。

③將上述樣品墊、結(jié)合墊、帶有t線和c線的nc膜以及吸收墊依次粘貼在底板上，完成試紙條的組裝。

8、阪崎腸桿菌的檢測(cè)

在完成pma和lamp操作步驟之后，用納米酶試紙進(jìn)行檢測(cè)。檢測(cè)包含兩個(gè)反應(yīng)步驟：(1)雜交反應(yīng)；(2)信號(hào)增強(qiáng)。

取10μllamp-pcr擴(kuò)增產(chǎn)物，與50μl反應(yīng)緩沖液(4×ssc，0.2m/m％吐溫-20)混合后滴加到上述納米酶核酸層析試紙條的樣品墊上，反應(yīng)15min后，在測(cè)試線和質(zhì)控線上滴加2滴底物緩沖液(含有20×dab和20×h2o2的商品化試劑)，反應(yīng)5min然后通過(guò)肉眼觀察顯色情況，判讀結(jié)果：陰性反應(yīng)：質(zhì)控線顯色，檢測(cè)線不顯色；陽(yáng)性反應(yīng)：質(zhì)控線、檢測(cè)線均顯色；失效反應(yīng)：若質(zhì)控線不顯色，則檢測(cè)失敗或試紙條失效。

對(duì)于定量測(cè)量，使用與條帶讀取器軟件組合的便攜式條帶讀取器記錄條帶的光學(xué)強(qiáng)度，根據(jù)光學(xué)強(qiáng)度計(jì)算出待測(cè)樣品中阪崎腸桿菌的含量。

為了驗(yàn)證本發(fā)明所建立的生物傳感器在實(shí)際樣品檢測(cè)過(guò)程中的準(zhǔn)確性，本發(fā)明對(duì)一定濃度的阪崎腸桿菌進(jìn)行加標(biāo)回收驗(yàn)證。從當(dāng)?shù)爻匈?gòu)買嬰幼兒奶粉通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)和菌落計(jì)數(shù)法檢測(cè)阪崎腸桿菌陰性。然后將阪崎腸桿菌以10，10³和10⁵cfu/ml的濃度摻入奶粉中混勻。依次進(jìn)行pma處理、基因組提取、lamp擴(kuò)增、核酸試紙條顯色，峰面積讀取、定量分析，結(jié)果顯示阪崎腸桿菌的回收率在105±2.5％至108.7±6.4％的范圍內(nèi)，表明本發(fā)明建立的傳感器檢測(cè)方法可以用于實(shí)際樣品的檢測(cè)(表4)。

表4納米酶?jìng)鞲衅鳈z測(cè)奶粉阪崎腸桿菌含量

實(shí)施例2納米酶核酸試紙條的優(yōu)化

根據(jù)水熱法合成fe3o4磁顆粒，然后將磁顆粒與生物素二抗(羊抗鼠igg)進(jìn)行孵育，制備納米酶探針。分別利用fitc抗體和生物素抗體在nc膜上的t線和c線位置劃線，烘干后組裝成納米酶核酸試紙條。為了提高納米酶?jìng)鞲衅鞯撵`敏度，通過(guò)比較包括膜材料的性能，檢測(cè)區(qū)fitc抗體的濃度，納米酶探針的量，反應(yīng)時(shí)間來(lái)系統(tǒng)地分析。結(jié)果證明使用millipore135s硝酸纖維素膜的納米酶?jìng)鞲衅鞯男阅芨?圖2a)。使用1mg/mlfitc抗體和1mg/ml羊抗鼠igg，獲得的信號(hào)峰面積最高(圖2b)。此外，納米酶探針的量影響納米酶探針和樣品之間的雜交效率，并且使用10μl的納米酶探針是最佳體積(圖2c)。試紙條顯色反應(yīng)時(shí)間不小于15min(圖2d)。

實(shí)施例3納米酶?jìng)鞲衅鞯男阅軝z測(cè)

該納米酶?jìng)鞲衅鞯脑砣缦拢菏紫?，用pma處理樣品(步驟1)。pma可以選擇性地穿透死細(xì)胞損傷的細(xì)胞膜，與細(xì)胞內(nèi)的dna結(jié)合，并使其不能用于隨后的lamp擴(kuò)增，但是如果是活細(xì)胞完整的細(xì)胞膜時(shí)，pma就不能進(jìn)入細(xì)胞。然后，使用lamp在短時(shí)間內(nèi)產(chǎn)生許多bio-和fitc-連接的雙鏈體dna(步驟2)。在靶物質(zhì)ompa特異性序列存在下，被四種引物識(shí)別并擴(kuò)增。第三是納米酶核酸試紙的可視化判讀(步驟3)。通過(guò)物理吸附將fitc抗體和羊抗鼠igg固定在硝酸纖維素膜上，以分別形成檢測(cè)區(qū)(tl)和質(zhì)控區(qū)(cl)。如果樣品是陽(yáng)性的，經(jīng)過(guò)lamp擴(kuò)增，靶物質(zhì)的5’末端用生物素標(biāo)記，3’端用fitc標(biāo)記，樣品溶液再與納米酶探針結(jié)合。然后，結(jié)合物與檢測(cè)區(qū)的fitc抗體雜交。所形成的結(jié)合物繼續(xù)沿條帶遷移并通過(guò)納米酶探針和羊抗鼠igg反應(yīng)，在質(zhì)控區(qū)顯色。在將dab/h2o2酶底物應(yīng)用于檢測(cè)區(qū)和質(zhì)控區(qū)時(shí)，納米酶和dab/h2o2酶底物之間的酶促反應(yīng)將產(chǎn)生顏色反應(yīng)以增強(qiáng)視覺(jué)效果。在不存在活阪崎腸桿菌的情況下，只有質(zhì)控區(qū)顯色。

通過(guò)以下幾個(gè)方面評(píng)估納米酶?jìng)鞲衅鞯男阅?。第一，重現(xiàn)性在評(píng)價(jià)生物傳感器中具有重要的意義。通過(guò)使用100cfu/ml的活阪崎腸桿菌(圖3a)測(cè)試生物傳感器的再現(xiàn)性，共測(cè)試五次。光學(xué)響應(yīng)的相應(yīng)rsd值為1.5％，表明該納米酶?jìng)鞲衅骶哂袃?yōu)異的再現(xiàn)性。由于樣品在實(shí)際中總是不同細(xì)菌種類的混合物，我們?cè)噲D使檢測(cè)方法具有更高的特異性。為了評(píng)價(jià)納米酶?jìng)鞲衅鞯奶禺愋?，使用雙蒸水，阪崎腸桿菌死菌的dna，阪崎腸桿菌活菌的dna和其他腸桿菌屬細(xì)菌菌株dna和其它非腸桿菌屬細(xì)菌菌株dna。結(jié)果如圖3b所示，未觀察到假陽(yáng)性。非阪崎腸桿菌和阪崎腸桿菌死菌的響應(yīng)保持與背景信號(hào)一樣低，表明非特異性吸附在該實(shí)驗(yàn)條件下對(duì)反應(yīng)系統(tǒng)沒(méi)有顯著影響阪崎腸桿菌活菌檢測(cè)。前期通過(guò)利用lamp擴(kuò)增也進(jìn)一步提升了納米酶?jìng)鞲衅鞯母咛禺愋?。?duì)于穩(wěn)定性(壽命)研究，是在室溫下儲(chǔ)存1-5周后測(cè)試納米酶?jìng)鞲衅鞯男阅?。結(jié)果如圖3c所示，納米酶?jìng)鞲衅鲗?duì)100cfu/ml阪崎腸桿菌的反應(yīng)保持幾乎相同，表明該納米酶?jìng)鞲衅鞣€(wěn)定性良好。

實(shí)施例4納米酶?jìng)鞲衅黛`敏度驗(yàn)證

為了評(píng)定納米酶?jìng)鞲衅鞯撵`敏度，在最佳實(shí)驗(yàn)條件下測(cè)量含有不同濃度的阪崎腸桿菌活菌(范圍從0至10⁵cfu/ml)的樣品溶液，然后測(cè)量tl線的吸收峰面積，三個(gè)平行實(shí)驗(yàn)。在最小至最大范圍內(nèi)，對(duì)阪崎腸桿菌濃度的響應(yīng)的所得圖是線性的，并且相關(guān)方程為峰面積＝18854lg阪崎腸桿菌濃度+3115.6，相關(guān)系數(shù)r²為0.9818，適合定量檢測(cè)。其中，阪崎腸桿菌濃度單位為cfu/ml。

雖然，上文中已經(jīng)用一般性說(shuō)明及具體實(shí)施方案對(duì)本發(fā)明作了詳盡的描述，但在本發(fā)明基礎(chǔ)上，可以對(duì)之做一些修改或改進(jìn)，這對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見(jiàn)的。因此，在不偏離本發(fā)明精神的基礎(chǔ)上所做的這些修改或改進(jìn)，均屬于本發(fā)明要求保護(hù)的范圍。

序列表

<110>中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)

<120>基于核酸層析生物傳感技術(shù)檢測(cè)阪崎腸桿菌的方法

<130>khp171113515.5

<160>4

<170>patentinversion3.3

<210>1

<211>19

<212>dna

<213>人工序列

<400>1

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