本發(fā)明涉及蜂蜜中多種煙堿類(lèi)藥物殘留量測(cè)定的檢測(cè)方法，尤其涉及一種固相萃取-液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜法同時(shí)測(cè)定蜂蜜中多種煙堿類(lèi)藥物殘留量的方法。
背景技術(shù)：
：蜂蜜因自身富含多種維生素、礦物質(zhì)和氨基酸以及人體可直接吸收的單糖(葡萄糖、果糖)等多種類(lèi)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，且對(duì)于便秘、胃和十二指腸潰瘍病等都有良好的輔助醫(yī)療作用，同時(shí)可提高人體免疫力，因此作為一種營(yíng)養(yǎng)豐富的食品越來(lái)越被廣大消費(fèi)者所接受。伴隨人民生活水平的提高，對(duì)蜂蜜的需求量也不斷增加，其質(zhì)量安全直接關(guān)系到人體健康。煙堿類(lèi)藥物屬于一類(lèi)新型高效、低毒、內(nèi)吸性強(qiáng)、殘效期長(zhǎng)、殘留量低的廣譜性殺蟲(chóng)劑。自20世紀(jì)80年代中期第一個(gè)煙堿類(lèi)殺蟲(chóng)劑吡蟲(chóng)啉問(wèn)世，到目前為止已有十幾個(gè)產(chǎn)品商品化或即將商品化，如呋蟲(chóng)胺(dinotefuran)、噻蟲(chóng)胺(clothianidin)、吡蟲(chóng)啉(imidacloprid)、啶蟲(chóng)脒(acetamiprid，又名吡蟲(chóng)清)等。其廣泛用于水稻、玉米、南瓜等農(nóng)作物的害蟲(chóng)防治，市場(chǎng)占有率很高。研究表明煙堿類(lèi)殺蟲(chóng)劑的作用機(jī)制主要是通過(guò)選擇性控制昆蟲(chóng)神經(jīng)系統(tǒng)煙堿型乙酰膽堿酯酶受體，阻斷昆蟲(chóng)中樞神經(jīng)系統(tǒng)的正常傳導(dǎo)，從而導(dǎo)致害蟲(chóng)出現(xiàn)麻痹進(jìn)而死亡。它可有效防治同翅目、鞘翅目、雙翅目和鱗翅目等害蟲(chóng)，對(duì)用傳統(tǒng)殺蟲(chóng)劑防治產(chǎn)生抗藥性的害蟲(chóng)也有良好的活性，既可有效地防治蔬菜、水稻和果樹(shù)等各種重要經(jīng)濟(jì)作物上發(fā)生的蚜蟲(chóng)、粉虱、葉蟬、飛虱、薊馬和蝽等刺吸式害蟲(chóng)以及一些鱗翅目和鞘翅目害蟲(chóng)，也可用于伴侶動(dòng)物牛寄生蟲(chóng)和衛(wèi)生害蟲(chóng)如蜚蠊、蒼蠅和白蟻的防治。已有研究表明，當(dāng)蜜蜂接觸新煙堿類(lèi)殺蟲(chóng)劑時(shí)，會(huì)迷失回巢方向，蜂王繁殖能力顯著下降，從而導(dǎo)致蜂群的數(shù)量明顯減少。藥物的使用使得蜜源植物和蜜蜂體內(nèi)的藥物殘留可能導(dǎo)致蜂產(chǎn)品受到污染，從而威脅消費(fèi)者的身體健康。伴隨著人民生活水平、食品安全意識(shí)的提高和蜂蜜需求的增加，煙堿類(lèi)農(nóng)藥在蜂蜜中的殘留問(wèn)題日益突出。為此歐盟法規(guī)規(guī)定了蜂蜜中新煙堿類(lèi)農(nóng)藥的最大殘留量為：啶蟲(chóng)脒、氟啶蟲(chóng)酰胺和吡蟲(chóng)啉50μg/kg，噻蟲(chóng)胺、呋蟲(chóng)胺、烯啶蟲(chóng)胺和噻蟲(chóng)嗪10μg/kg，噻蟲(chóng)啉200μg/kg。因此建立蜂蜜中煙堿類(lèi)藥物殘留量測(cè)定的方法，具有重要的科學(xué)意義和社會(huì)意義。煙堿類(lèi)藥物作為有效的殺蟲(chóng)劑，其在食品中殘留量的測(cè)定主要集中在植物源性產(chǎn)品中，目前我國(guó)已經(jīng)制定的植物源性食品中藥物殘留檢測(cè)也基本涵蓋了煙堿類(lèi)藥物。例如gb/t19648-2006水果和蔬菜中500種農(nóng)藥及相關(guān)化學(xué)品殘留量的測(cè)定氣相色譜-質(zhì)譜法，gb/t20769-2008水果和蔬菜中450種農(nóng)藥及相關(guān)化學(xué)品殘留量的測(cè)定液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法，gb/t23205-2008茶葉中448種農(nóng)藥及相關(guān)化學(xué)品殘留量的測(cè)定液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法等。近幾年伴隨著煙堿類(lèi)藥物對(duì)蜜蜂影響的深入研究，特別是歐盟制定了該類(lèi)藥物的限量以來(lái)，研究人員陸續(xù)通過(guò)液液萃取-分散固相萃取、quechers凈化和固相萃取凈化等前處理技術(shù)，采用高效液相色譜法和液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法對(duì)蜂蜜中煙堿類(lèi)藥物殘留進(jìn)行測(cè)定，然而尚未檢索到蜂蜜中10種煙堿類(lèi)藥物殘留在蜂蜜中同時(shí)測(cè)定的研究報(bào)道。為了給蜂蜜產(chǎn)品的質(zhì)量安全提供必要的技術(shù)支持，建立蜂蜜中烯啶蟲(chóng)胺、呋蟲(chóng)胺、噻蟲(chóng)嗪、噻蟲(chóng)胺、吡蟲(chóng)啉、啶蟲(chóng)脒、噻蟲(chóng)啉、氟啶蟲(chóng)酰胺、氯噻啉和吡呀酮(表1)殘留量同時(shí)測(cè)定的檢測(cè)方法非常重要。表1各類(lèi)化合物的基本信息編號(hào)名稱英文名稱cas號(hào)分子式分子量1烯啶蟲(chóng)胺nitenpyram120738-89-8c11h15cln4o2270.722呋蟲(chóng)胺dinotefuran165252-70-0c7h14n4o3202.213噻蟲(chóng)嗪thiamethoxam153719-23-4c8h10cln5o3s291.714噻蟲(chóng)胺clothianidin205510-53-8c6h8cln5o2s249.685吡蟲(chóng)啉imidacloprid138261-41-3c9h10cln5o2255.666啶蟲(chóng)脒acetamiprid135410-20-7c10h11cln4222.677噻蟲(chóng)啉thiacloprid111988-49-9c10h9cln4s252.728氟啶蟲(chóng)酰胺flonicamid158062-67-0c9h6f3n3o229.169氯噻啉imidaclothiz105843-36-5c7h8cln5o2s261.6910吡呀酮pymetrozine123312-89-0c10h11n5o217.23技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：為了解決蜂蜜中多個(gè)煙堿類(lèi)藥物殘留量同時(shí)測(cè)定的技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明提供了一種固相萃取-液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜法同時(shí)測(cè)定蜂蜜中10種煙堿類(lèi)藥物殘留量同時(shí)測(cè)定的方法，該方法簡(jiǎn)便快捷，消耗資源小，檢測(cè)成本低的特點(diǎn)。為了實(shí)現(xiàn)上述的目的，本發(fā)明采用了以下的技術(shù)方案。固相萃取-液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜法同時(shí)測(cè)定蜂蜜中煙堿類(lèi)藥物殘留量的方法，所述的煙堿類(lèi)藥物為烯啶蟲(chóng)胺、呋蟲(chóng)胺、噻蟲(chóng)嗪、噻蟲(chóng)胺、吡蟲(chóng)啉、啶蟲(chóng)脒、噻蟲(chóng)啉、氟啶蟲(chóng)酰胺、氯噻啉和吡呀酮，該方法包括以下的步驟：一、樣品前處理稱取樣品2.00g，精確到0.01g，置于50ml具塞離心試管中，加入同位素內(nèi)標(biāo)物溶液，加水至20ml，渦旋，混勻，高速離心，取上清液5ml轉(zhuǎn)移至hlb固相萃取柱進(jìn)行凈化，甲醇：水＝1：9的混合溶液進(jìn)行淋洗，抽干，甲醇洗脫，收集5ml洗脫溶液并用氮?dú)獯抵两?，用甲醇?.15％甲酸＝1：9的溶液定容至10ml，過(guò)0.22μm濾膜，待液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜儀測(cè)定；同位素內(nèi)標(biāo)溶液的加入為：噻蟲(chóng)胺-d3、吡蟲(chóng)啉-d4、噻蟲(chóng)啉-d4、噻蟲(chóng)嗪-d3、啶蟲(chóng)脒-d3和呋蟲(chóng)胺-d3內(nèi)標(biāo)物20ng；二、測(cè)定1)標(biāo)準(zhǔn)工作液和樣品溶液在設(shè)定的液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜條件下進(jìn)樣，以質(zhì)量濃度x為橫坐標(biāo)，峰面積的比值(外標(biāo)法為峰面積)y為縱坐標(biāo)，繪制5點(diǎn)標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，用標(biāo)準(zhǔn)工作曲線對(duì)樣品進(jìn)行定量，樣品溶液中各化合物的響應(yīng)值應(yīng)在儀器檢測(cè)的線性范圍內(nèi)；設(shè)定的各化合物的母離子、子離子和碰撞能量等質(zhì)譜參數(shù)如下：設(shè)定的液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜儀的參數(shù)如下：2)在上述色譜條件下，判斷樣品中是否存在相應(yīng)的被測(cè)物，需要滿足如下條件：樣品溶液中出現(xiàn)的質(zhì)量色譜峰保留時(shí)間與混合基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)工作液一致，允許偏差小于±2.5％，該色譜峰所對(duì)應(yīng)的化合物在設(shè)定的質(zhì)譜定性離子的相對(duì)離子豐度與濃度相當(dāng)?shù)幕旌匣|(zhì)標(biāo)準(zhǔn)工作液的相對(duì)離子豐度一致，相對(duì)離子豐度偏差不超過(guò)設(shè)定的規(guī)定，則可確定含有該化合物；設(shè)定的相對(duì)離子豐度的最大允許偏差如下：相對(duì)離子豐度>50％，允許的相對(duì)偏差±20％相對(duì)離子豐度20％～50％，允許的相對(duì)偏差±25％相對(duì)離子豐度10％～20％，允許的相對(duì)偏差±30％相對(duì)離子豐度≤10％，允許的相對(duì)偏差±50％。本方法經(jīng)水稀釋樣品和提取，hlb固相萃取凈化的前處理過(guò)程，采用液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜法測(cè)定，外標(biāo)法和同位素內(nèi)標(biāo)稀釋法定量。測(cè)定定量限(以s/n等于10計(jì))蜂蜜樣品中烯啶蟲(chóng)胺(0.5μg/kg)、呋蟲(chóng)胺(5μg/kg)、噻蟲(chóng)嗪(0.5μg/kg)、噻蟲(chóng)胺(0.5μg/kg)、吡蟲(chóng)啉(2.5μg/kg)、啶蟲(chóng)脒(0.0025μg/kg)、噻蟲(chóng)啉(0.01μg/kg)、氟啶蟲(chóng)酰胺(2.5μg/kg)、氯噻啉(2.5μg/kg)和吡呀酮(0.25μg/kg)。線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)大于0.995；總體回收率：75.4％～106.8％；相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差：1.8％～11.9％。該方法簡(jiǎn)便快捷，消耗資源小，檢測(cè)成本低，所提及的前處理過(guò)程、涉及化合物以及測(cè)定所用儀器可以與已有方法進(jìn)行很好的互補(bǔ)，適用于蜂蜜中煙堿類(lèi)藥物殘留量同時(shí)測(cè)定的要求，可以為維護(hù)食品安全和保障蜂蜜質(zhì)量進(jìn)一步提供有力的技術(shù)保障。附圖說(shuō)明圖1空白蜂蜜中添加目標(biāo)化合物的加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)測(cè)試各化合物的總離子流圖(添加濃度：呋蟲(chóng)胺、噻蟲(chóng)胺、烯啶蟲(chóng)胺、噻蟲(chóng)嗪濃度：5μg/kg，吡蚜酮、啶蟲(chóng)脒、氟啶蟲(chóng)酰胺、吡蟲(chóng)啉、氯噻啉濃度：25μg/kg，噻蟲(chóng)啉濃度：100μg/kg)。圖2吡蟲(chóng)啉(256.1/175.1)的選擇性離子流圖。圖3吡蟲(chóng)啉(256.1/209.1)的選擇性離子流圖。圖4吡蟲(chóng)啉-d4(260.2/179.0)的選擇性離子流圖。圖5吡蚜酮(218.1/105.2)的選擇性離子流圖。圖6吡蚜酮(218.1/78.2)的選擇性離子流圖。圖7啶蟲(chóng)脒(223.1/56.1)的選擇性離子流圖。圖8啶蟲(chóng)脒(223.1/90.1)的選擇性離子流圖。圖9啶蟲(chóng)脒-d3(226.1/126.1)的選擇性離子流圖。圖10呋蟲(chóng)胺(203.1/129.1)的選擇性離子流圖。圖11呋蟲(chóng)胺(203.1/157.1)的選擇性離子流圖。圖12呋蟲(chóng)胺-d3(206.1/132.0)的選擇性離子流圖。圖13氟啶蟲(chóng)酰胺(230.1/203.0)的選擇性離子流圖。圖14氟啶蟲(chóng)酰胺(230.1/148.1)的選擇性離子流圖。圖15氯噻啉(262.1/181.2)的選擇性離子流圖。圖16氯噻啉(262.1/122.2)的選擇性離子流圖。圖17噻蟲(chóng)胺(250.1/169.1)的選擇性離子流圖。圖18噻蟲(chóng)胺(250.1/113.1)的選擇性離子流圖。圖19噻蟲(chóng)胺-d3(253.1/172.1)的選擇性離子流圖。圖20噻蟲(chóng)啉(253.1/90.1)的選擇性離子流圖。圖21噻蟲(chóng)啉(253.1/186.1)的選擇性離子流圖。圖22噻蟲(chóng)啉-d4(257.1/126.1)的選擇性離子流圖。圖23噻蟲(chóng)胺(292.1/211.1)的選擇性離子流圖。圖24噻蟲(chóng)胺(292.1/132.1)的選擇性離子流圖。圖25噻蟲(chóng)胺-d3(295.0/214.2)的選擇性離子流圖。圖26烯啶蟲(chóng)胺(271.1/56.1)的選擇性離子流圖。圖27烯啶蟲(chóng)胺(271.1/126.1)的選擇性離子流圖。具體實(shí)施方式固相萃取-液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜法同時(shí)測(cè)定蜂蜜中煙堿類(lèi)藥物殘留量的方法，該方法包括以下的步驟：一、樣品的稀釋提取和凈化蜂蜜中富含果糖和葡萄糖，通常對(duì)蜂蜜進(jìn)行稀釋或有機(jī)溶劑提取是前處理的關(guān)鍵步驟，本發(fā)明結(jié)合hlb固相萃取柱的特點(diǎn)，以保證質(zhì)量、綠色環(huán)保、簡(jiǎn)便快捷為主要的思路，對(duì)比了水溶液和ph＝8的磷酸鹽緩沖溶液兩種稀釋溶劑，結(jié)果表明各化合物在兩種稀釋溶液中的回收率并無(wú)明顯差異。最后選擇水為樣品的稀釋提取試劑。具體操作：稱取樣品2.00g(精確到0.01g)于50ml具塞離心試管中，加入內(nèi)標(biāo)物，加水至20ml，渦旋，混勻，高速離心，取上清液5ml待凈化。二、凈化本發(fā)明嘗試選擇mcx，hlb，c18三種不同類(lèi)型的固相萃取柱進(jìn)行凈化效果的考察。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：1、c18固相萃取柱采用甲醇上樣同時(shí)進(jìn)行洗脫方式，結(jié)果表明呋蟲(chóng)胺回收率20％左右，氟啶蟲(chóng)酰胺回收率50％左右。2、mcx固相萃取柱采用酸性甲醇上樣，中性甲醇淋洗，堿性甲醇洗脫的方式，結(jié)果表明烯啶蟲(chóng)胺的回收率30％左右，且凈化實(shí)驗(yàn)的重現(xiàn)性不理想。3、hlb固相萃取柱采用水溶液上樣，混合溶劑淋洗，甲醇洗脫的方式。結(jié)果表明，淋洗溶液的比例在甲醇含量達(dá)到20％時(shí)，呋蟲(chóng)胺可以被淋洗溶液洗脫，因此采用甲醇：水(1：9)進(jìn)行淋洗，采用甲醇進(jìn)行洗脫。具體操作：上述提取液過(guò)hlb固相萃取柱進(jìn)行凈化，甲醇：水(1：9)進(jìn)行淋洗，抽干，甲醇洗脫，收集5ml洗脫溶液并用氮?dú)獯抵两桑眉状迹?.15％甲酸溶液(1：9)定容至10ml，過(guò)0.22μm濾膜，待液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜儀測(cè)定。三、測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)工作液和樣品溶液在表2和表3設(shè)定的液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜條件下進(jìn)樣，以質(zhì)量濃度x為橫坐標(biāo)，峰面積的比值y為縱坐標(biāo)(外標(biāo)法定量的化合物以峰面積為縱坐標(biāo))，繪制5點(diǎn)標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，用標(biāo)準(zhǔn)工作曲線對(duì)樣品進(jìn)行定量，樣品溶液中各化合物的響應(yīng)值應(yīng)在儀器檢測(cè)的線性范圍內(nèi)。在上述色譜條件下，判斷樣品中是否存在相應(yīng)的被測(cè)物，需要滿足如下條件：樣品溶液中出現(xiàn)的質(zhì)量色譜峰保留時(shí)間與混合基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)工作液一致，允許偏差小于±2.5％，該色譜峰所對(duì)應(yīng)的化合物在表2中的質(zhì)譜定性離子的相對(duì)離子豐度與濃度相當(dāng)?shù)幕旌匣|(zhì)標(biāo)準(zhǔn)工作液的相對(duì)離子豐度一致，相對(duì)離子豐度偏差不超過(guò)規(guī)定，則可確定含有該化合物。設(shè)定的相對(duì)離子豐度的最大允許偏差如下：相對(duì)離子豐度>50％，允許的相對(duì)偏差±20％相對(duì)離子豐度20％～50％，允許的相對(duì)偏差±25％相對(duì)離子豐度10％～20％，允許的相對(duì)偏差±30％相對(duì)離子豐度≤10％，允許的相對(duì)偏差±50％。表2為各類(lèi)化合物的母離子、子離子和碰撞能量等質(zhì)譜參數(shù)。在表2和表3設(shè)定的液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜條件下，空白樣品添加回收實(shí)驗(yàn)的回收率和精密度見(jiàn)表4，各類(lèi)化合物的質(zhì)譜色譜峰見(jiàn)圖1和圖2～圖27(添加濃度：呋蟲(chóng)胺、噻蟲(chóng)胺、烯啶蟲(chóng)胺、噻蟲(chóng)嗪濃度：5μg/kg，吡蚜酮、啶蟲(chóng)脒、氟啶蟲(chóng)酰胺、吡蟲(chóng)啉、氯噻啉濃度：25μg/kg，噻蟲(chóng)啉濃度：100μg/kg)。表2各類(lèi)化合物的質(zhì)譜參數(shù)表3液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜的儀器條件參數(shù)表4蜂蜜中各煙堿類(lèi)化合物添加水平、回收率和精密度(n＝6)當(dāng)前第1頁(yè)12