本發(fā)明涉及高正電荷綠色熒光蛋白在制備肝癌早期診斷試劑盒中的應(yīng)用，屬于醫(yī)學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

肝細(xì)胞癌(hepatocellularcarcinoma,hcc)是世界第五大常見癌癥，其中約50％發(fā)生在我國，是我國第二大癌癥死亡原因，嚴(yán)重威脅著人民的健康和生命。hcc的治療非常困難，在早期往往沒有明顯癥狀，當(dāng)癥狀出現(xiàn)時(shí)已到中晚期。因此早期診斷成為hcc治療的關(guān)鍵和新的研究熱點(diǎn)，其中尋找hcc特異性生物標(biāo)志分子成為主要挑戰(zhàn)。

目前甲胎球蛋白(afp)是被廣泛用于臨床的hcc分子標(biāo)志物，但在hcc的早期診斷中，如果僅靠檢測血清中的afp，將使直徑5厘米及更小的腫瘤漏檢。另外，afp水平在大量良性肝病患者血清中也顯著提高，這極大地影響了其在hcc診斷中的特異性。因此，在hcc早期診斷和治療中，急需新的更為靈敏和專一的生物標(biāo)志分子。

glypican-3(gpc3)是細(xì)胞表面磷脂酰肌醇蛋白聚糖家族(glypicans)的成員之一，最早由jorgefilmus教授發(fā)現(xiàn)鑒定。gpc3由單鏈核心蛋白和兩條硫酸乙酰肝素(hs)側(cè)鏈組成，并通過羧基末端的一個(gè)糖基磷酸化肌醇分子(gpi)錨定在細(xì)胞膜表面。在胚胎發(fā)育階段gpc3在各種組織中廣泛表達(dá)，但在成年后因dna甲基化而沉默。近年來，gpc3被發(fā)現(xiàn)在約75％的hcc病人中專一性表達(dá)，但在肝臟的正常組織和良性病變中不表達(dá)，因此是比afp更為特異的hcc生物標(biāo)志分子。

在最近的研究中，經(jīng)基因工程改造的高正電荷綠色熒光蛋白(scgfp)被開發(fā)并應(yīng)用于核酸與蛋白的分析檢測等方面。研究人員通過實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，此scgfp還可被用于糖胺聚糖的分析檢測，是一種糖胺聚糖的生物相容性高靈敏熒光探針，可以與帶負(fù)電荷的糖胺聚糖側(cè)鏈發(fā)生強(qiáng)烈的電荷相互作用。

中國專利文獻(xiàn)cn104678092a(申請?zhí)?01510044900.0)公開了高正電荷綠色熒光蛋白在糖胺聚糖研究中的應(yīng)用，所述高正電荷熒光蛋白的氨基酸序列如seqidno.1所示。本發(fā)明首次將高正電gfp作為生物相容性、高靈敏度和高選擇性熒光探針，應(yīng)用于活細(xì)胞表面的gags的可視化，血清中g(shù)ags的高靈敏性定量分析，肝素中過硫酸化的硫酸軟骨素污染分析等。擴(kuò)大高正電荷綠色熒光蛋白的應(yīng)用范圍成為目前的研究熱點(diǎn)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供高正電荷綠色熒光蛋白在制備肝癌早期診斷試劑盒中的應(yīng)用。

本發(fā)明所述技術(shù)方案如下：

高正電荷綠色熒光蛋白在制備肝癌早期診斷試劑盒中的應(yīng)用。

根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的，所述的所述高正電荷熒光蛋白的氨基酸序列如seqidno.1所示。

根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的，所述帶高正電荷的熒光蛋白的濃度為0.001～0.01μg/μl。

根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的，所述肝癌早期診斷試劑盒檢測的為早期肝癌標(biāo)志物gpc3。

一種用于蛋白聚糖gpc3的檢測試劑盒，包括：

預(yù)先固定好gpc3抗體的微孔板；

高正電荷綠色熒光蛋白，濃度0.01μg/μl；

透明質(zhì)酸/硫酸軟骨素降解酶；

磷酸鹽緩沖液(pbs)：nacl137mm，kcl2.7mm，na2hpo410mm，kh2po42mmph7.4

以及，避光所需的錫箔紙。

上述透明質(zhì)酸/硫酸軟骨素降解酶、gpc3抗體為本領(lǐng)域普通市售產(chǎn)品，透明質(zhì)酸/硫酸軟骨素降解酶來自sigma公司,gpc3抗體來自abcam公司。

有益效果

本發(fā)明利用蛋白聚糖由核心蛋白和側(cè)鏈糖胺聚糖兩部分組成的特點(diǎn)，采用抗體與核心蛋白的專一性識別和scgfp與側(cè)鏈的電荷結(jié)合作用，實(shí)現(xiàn)對蛋白聚糖的快速靈敏檢測?；谶@一原理，在本發(fā)明所底乎的試劑盒檢測比傳統(tǒng)elisa更為簡單快速的熒光檢測方法，可減少抗體的使用量，并且步驟簡單，節(jié)約測定時(shí)間，這對于臨床上通過檢測病人血清中g(shù)pc3含量來對早期肝癌進(jìn)行診斷具有著重要作用。

附圖說明

圖1、運(yùn)用高正電綠色熒光蛋白檢測pbs中早期肝癌標(biāo)志物gpc3；

圖2、運(yùn)用高正電綠色熒光蛋白檢測血清中早期肝癌標(biāo)志物gpc3；

圖3、鹽濃度對血清中g(shù)pc3檢測的影響；

圖4、酶預(yù)處理對血清中g(shù)pc3檢測的影響；

圖5、運(yùn)用高正電綠色熒光蛋白檢測肝癌病人及正常人、良性肝病病人早期肝癌標(biāo)志物gpc3。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合實(shí)施例及說明書附圖對本發(fā)明的技術(shù)方案做進(jìn)一步的闡述，其是為了全面公開本發(fā)明如何實(shí)施的一些常用技術(shù)，而不是為了限制本發(fā)明的應(yīng)用范圍。發(fā)明人已經(jīng)盡最大努力確保實(shí)施例中各參數(shù)的準(zhǔn)確性(例如量，溫度，等等)，但是一些實(shí)驗(yàn)誤差和偏差也應(yīng)該予以考慮。

按照中國專利文獻(xiàn)cn104678092a(申請?zhí)?01510044900.0)中公開的技術(shù)方案合成高正電荷綠色熒光蛋白，其氨基酸序列如seqidno.1所示。

實(shí)施例1、用高正電綠色熒光蛋白檢測pbs中不同濃度的gpc3。

使用gpc3抗體(購自abcam公司，30ng/ml)60μl鋪于384微孔白板上，并用1％bsa對其進(jìn)行封閉。封閉結(jié)束后用pbs清洗3次，然后加入溶在pbs中不同濃度的gpc3和gpc3δgag(無糖胺聚糖側(cè)鏈的gpc3)，室溫放置2小時(shí)，孵育結(jié)束后，用pbs洗滌3次，加入0.3μg高正電荷綠色熒光蛋白(scgfp)，室溫避光放置10min，pbs洗滌5次，測定熒光強(qiáng)度(ex：470nm，em：509nm)。結(jié)果顯示，隨著gpc3和gpc3δgag含量的增加，熒光強(qiáng)度也增加；在同濃度時(shí)，gpc3比gpc3δgag結(jié)合熒光的能力更強(qiáng)(如圖1所示)。這說明，gpc3的糖胺聚糖側(cè)鏈在熒光結(jié)合過程中起著重要的作用，并且由此建立了一種比傳統(tǒng)方法更為簡便快捷的gpc3檢測方法。

實(shí)施例2、用高正電綠色熒光蛋白檢測血清中不同濃度的gpc3。

如上所述，將gpc3的專一性抗體鋪板于384微孔白板中，并進(jìn)行封閉。然后加入溶解在適當(dāng)稀釋的胎牛血清中的gpc3和gpc3δgag，室溫放置2小時(shí)，孵育結(jié)束后，用pbs洗滌3次，加入0.3μgscgfp，室溫避光放置10min，pbs洗滌5次，測定熒光強(qiáng)度(ex：470nm，em：509nm)。結(jié)果顯示，隨著gpc3和gpc3δgag含量的增加，熒光強(qiáng)度也增加；在同濃度時(shí)，gpc3比gpc3δgag結(jié)合熒光的能力更強(qiáng)；但是相對于在pbs中靈敏度低了一些(如圖2所示)。這說明，高正電綠色熒光蛋白可以檢測血清中的gpc3，為臨床中肝癌的早期診斷提供了一種簡便快捷的方法。

實(shí)施例3、鹽濃度對血清中g(shù)pc3檢測的影響

將含有g(shù)pc3的胎牛血清中加入不同濃度的nacl，在30℃孵育1小時(shí)，間或溫和震蕩，然后以實(shí)施例2中的方法檢測鹽濃度對血清中g(shù)pc3檢測的影響。結(jié)果顯示與不加nacl相比，0.5mnacl可以顯著提高檢測樣品的熒光強(qiáng)度(如圖3所示)。

實(shí)施例4、酶處理處理對血清中g(shù)pc3檢測的影響

在確定最佳鹽濃度后，將含有g(shù)pc3的血清用透明質(zhì)酸/硫酸軟骨素降解酶在最佳鹽濃度下于30℃預(yù)處理1小時(shí)，然后以實(shí)施例2中的方法檢測酶預(yù)處理對血清中g(shù)pc3檢測的影響。結(jié)果顯示，酶處理后熒光相對強(qiáng)度明顯增強(qiáng)(如圖4所示)。

實(shí)施例5、臨床血清中g(shù)pc3的比較分析

將臨床血清樣本(正常組、良性肝病組、hcc組，均由齊魯醫(yī)院提供)用含有一定濃度nacl的pbs適當(dāng)稀釋，在最佳鹽濃度下用hclase于30℃預(yù)處理1小時(shí)，然后用實(shí)施例2中的方法檢測各樣本的熒光強(qiáng)度并分析比較。結(jié)果顯示，相對于正常人與良性肝病病人血清來說，肝癌病人血清恢復(fù)熒光的能力更強(qiáng)(如圖5所示)。這說明，高正電綠色熒光蛋白可以應(yīng)用于臨床肝癌病人的早期診斷。

實(shí)施例6、一種用于蛋白聚糖gpc3的快速靈敏檢測試劑盒，包括：

預(yù)先固定好gpc3抗體的微孔板；

高正電荷綠色熒光蛋白，其濃度為0.01μg/μl；其制備方法為本領(lǐng)域常規(guī)技術(shù)，可參考文獻(xiàn)lawrence,m.s.；phillips,k.j.；liu,d.r.j.am.chem.soc.2007,129,10110-10112.中的構(gòu)建表達(dá)方法；

透明質(zhì)酸/硫酸軟骨素降解酶；

緩沖液：磷酸鹽緩沖液(pbs)；

以及，避光所需的錫箔紙。

說明書中涉及的參考文獻(xiàn)

1.boschfx,ribesj,díazm,clériesr.primarylivercancer:worldwideincidenceandtrends.gastroenterology2004,127:s5-s16.

2.llovetjm,burroughsa,bruixj.hepatocellularcarcinoma.lancet2003,362:1907-17.

3.bruixj,shermanm.managementofhepatocellularcarcinoma.hepatology2005,42:1208-36.

4.filmusj,churchjg,buickrn.isolationofacdnacorrespondingtoadevelopmentallyregulatedtranscriptinratintestine.mol.cellbiol.1988,8:4243-9.

5.filmusj,sellecksb.glypicans:proteoglycanswithasurprise.j.clin.invest.2001,108:497–501.

6.filmusj,capurrom,rastj.glypicans.genomebiol2008,9:224.

7.huberr,hansenrs,strazzullom,pengueg,mazzarellar,d'ursom,schlessingerd,piliag,gartlersm,d'espositom.dnamethylationintranscriptionalrepressionoftwodifferentiallyexpressedx-linkedgenes,gpc3andsybl1.proc.natl.acad.sci.usa.1999,96:616-21.

8.hsuhc,chengw,laipl.cloningandexpressionofadevelopmentallyregulatedtranscriptmxr7inhepatocellularcarcinoma:biologicalsignificanceandtemporospatialdistribution.cancerres.1997,57:5179–84.

9.zhuzw,friessh,wangl,etal.enhancedglypican-3expressiondifferentiatesthemajorityofhepatocellularcarcinomasfrombenignhepaticdisorders.gut2001,48:558–64.

10.capurrom,wanlessir,shermanm,etal.glypican-3:anovelserumandhistochemicalmarkerforhepatocellularcarcinoma.gastroenterology2003,125:81–90.

11.wenshuangwang,naihanhan,fuchuanli,etal.superchargedfluorescentproteinasaversatileprobeforthedetectionofglycosaminoglycansinvitroandinvivo.anal.chem.2015,87:9302-7。

sequencelisting

<110>山東大學(xué)

<120>高正電荷綠色熒光蛋白在制備肝癌早期診斷試劑盒中的應(yīng)用

<160>1

<170>patentinversion3.5

<210>1

<211>248

<212>prt

<213>人工合成

<400>1

metglyhishishishishishisglyglyalaserlysglygluarg

151015

leupheargglylysvalproileleuvalgluleulysglyaspval

202530

asnglyhislyspheservalargglylysglylysglyaspalathr

354045

argglylysleuthrleulyspheilecysthrthrglylysleupro

505560

valprotrpprothrleuvalthrthrleuthrtyrglyvalglncys

65707580

pheserargtyrprolyshismetlysarghisaspphephelysser

859095

alametprolysglytyrvalglngluargthrileserphelyslys

100105110

aspglylystyrlysthrargalagluvallysphegluglyargthr

115120125

leuvalasnargilelysleulysglyargaspphelysglulysgly

130135140

asnileleuglyhislysleuargtyrasnpheasnserhislysval

145150155160

tyrilethralaasplysarglysasnglyilelysalalysphelys

165170175

ilearghisasnvallysaspglyservalglnleualaasphistyr

180185190

glnglnasnthrproileglyargglyprovalleuleuproargasn

195200205

histyrleuserthrargserlysleuserlysaspprolysglulys

210215220

argasphismetvalleuleugluphevalthralaalaglyilelys

225230235240

hisglyargaspgluargtyrlys

245