本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體來(lái)說(shuō)涉及的是一種用于前列腺癌進(jìn)展預(yù)后的檢測(cè)試劑以及相關(guān)試劑盒。
背景技術(shù)：
北美地區(qū)男性惡性腫瘤中，前列腺癌(pca)依舊是發(fā)病率最高的腫瘤，死亡率僅次于肺癌。而我國(guó)男性前列腺癌發(fā)病率呈明顯上升趨勢(shì)，在男性泌尿生殖系統(tǒng)位居第二位，僅次于膀胱腫瘤。臨床治療前列腺癌有激素、手術(shù)、放射等有效治療方法，但是，仍有許多前列腺癌患者最終都由于前列腺的進(jìn)展(生化復(fù)發(fā)、腫瘤轉(zhuǎn)移)而死亡，因此臨床醫(yī)生迫切需要尋找更好的臨床進(jìn)展預(yù)后標(biāo)記物來(lái)篩出需要進(jìn)一步干預(yù)治療的患者，并依此制定出更合適的治療方案。
轉(zhuǎn)錄因子12(transcriptionfactor12，tcf12)是helix-loop-helix蛋白家族的一份子，其功能多樣化，能在多種組織中表達(dá)。能形成二聚體和異二聚體，影響細(xì)胞發(fā)生發(fā)展和分化。在膽管癌、乳腺癌、直腸癌中均有研究表明會(huì)影響腫瘤的惡性進(jìn)展和不良預(yù)后，可作為腫瘤的進(jìn)展及預(yù)后的預(yù)測(cè)因子之一。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的在于提供一種用于前列腺癌進(jìn)展預(yù)后的檢測(cè)試劑，它能通過(guò)檢測(cè)tcf12在前列腺癌臨床樣本中的表達(dá)狀態(tài)而預(yù)測(cè)前列腺癌進(jìn)展，可以區(qū)分臨床前列腺癌患者的不同疾病進(jìn)展及預(yù)后。
本發(fā)明所述的用于前列腺癌進(jìn)展預(yù)后的檢測(cè)試劑，按照每張臨床樣本組織切片的劑量，所述檢測(cè)試劑包括：內(nèi)源性過(guò)氧化物酶阻斷劑50ul；動(dòng)物非免疫血清50ul；一抗為兔源抗tcf12多克隆抗體1ul；生物素標(biāo)記的二抗50ul；鏈霉菌抗生物素蛋白-過(guò)氧化物酶50ul；dab顯色試劑100ul；磷酸緩沖鹽溶液(pbs緩沖液)200ul。
本發(fā)明的另一目的在于提供前列腺癌進(jìn)展預(yù)后的檢測(cè)試劑盒，可用于前列腺癌生化復(fù)發(fā)、腫瘤轉(zhuǎn)移等預(yù)后診斷。
本發(fā)明所述的用于前列腺癌進(jìn)展預(yù)后的檢測(cè)試劑盒，包括本發(fā)明所述的檢測(cè)試劑。
本發(fā)明所述的用于前列腺癌進(jìn)展預(yù)后的檢測(cè)試劑及試劑盒具有以下優(yōu)點(diǎn)：第一次闡述tcf12的表達(dá)水平跟前列腺癌患者術(shù)后psa生化復(fù)發(fā)、腫瘤轉(zhuǎn)移和gleason(gs)評(píng)分存在關(guān)系，能為前列腺癌患者的疾病診治提供了可靠的方法，并且操作簡(jiǎn)單、快速，無(wú)需其他特殊儀器，可應(yīng)用于一般醫(yī)院實(shí)驗(yàn)室或者病理室，有望成為前列腺癌疾病診斷的新技術(shù)。
具體實(shí)施方式
以下通過(guò)前列腺癌患者臨床芯片樣本進(jìn)行tcf12的多克隆抗體染色試驗(yàn)，并結(jié)合臨床樣本數(shù)據(jù)來(lái)進(jìn)一步證明本發(fā)明對(duì)預(yù)測(cè)前列腺癌術(shù)后psa生化復(fù)發(fā)、腫瘤轉(zhuǎn)移和gleason評(píng)分(gs)的有利效果，證明本發(fā)明能有效預(yù)測(cè)前列腺癌患者的疾病進(jìn)展。
實(shí)驗(yàn)步驟：
1)將臨床組織從液氮中取出，將該組織裝入包埋盒中保存；
2)用自來(lái)水連續(xù)沖洗5小時(shí)；
3)放入leica自動(dòng)脫水機(jī)中進(jìn)行組織脫水；
4)進(jìn)行石蠟包埋組織；
5)將包埋好的石蠟組織塊進(jìn)行連續(xù)切片，厚度約為4μm；
6)將切好的片子在60℃的恒溫烤箱中放置約2個(gè)小時(shí)；
7)放入leica自動(dòng)脫蠟機(jī)中進(jìn)行組織切片脫蠟(包括二甲苯和梯度酒精脫蠟)；
8)蒸餾水沖洗一下，將切片置于枸櫞酸抗原修復(fù)液中(注意過(guò)程中液體量足夠以免微波爐加熱時(shí)燒干)進(jìn)行抗原修復(fù)，微波爐加熱3min，拿出來(lái)涼一下，再加熱1min，再拿出來(lái)室溫冷卻一下，再加熱1min，冷卻至室溫；
9)用阻水筆把切片組織圈住，用pbs浸泡；
10)每張切片加50ul過(guò)氧化酶阻斷溶液，以便滅活組織內(nèi)源性過(guò)氧化物酶，室溫孵育15分鐘；
11)pbs沖洗或浸泡3×3min；
12)甩去pbs液，每張組織切片加50ul的非免疫性動(dòng)物血清封閉非特異性結(jié)合，室溫下孵育10-15分鐘；
13)甩干血清，每張切片加200ulpbs稀釋好的第一抗體(兔源抗tcf12多克隆抗體1ul：pbs緩沖液200ul)；
14)置于孵育盒內(nèi)，4℃恒溫下過(guò)夜；
15)第二天將過(guò)夜的切片進(jìn)行室溫下復(fù)溫約30min；
16)pbs沖洗或浸泡3×10min；
17)甩去pbs液，每張切片加50ul生物素標(biāo)記第二抗體，室溫下孵育30min；
18)pbs沖洗或浸泡3×10min；
19)甩去pbs液，每張切片加50ul鏈霉菌抗生物素-過(guò)氧化物酶溶液，室溫下孵育15min；
20)pbs沖洗或浸泡3×3min；
21)甩去pbs液，每張切片加100ul新鮮配制的二氨基聯(lián)苯胺(diaminobenzidine,dab)顯色液，顯微鏡下觀(guān)察，看到黃染之后立即將切片浸入蒸餾水中中止染色；
22)將切片放入leica自動(dòng)病理機(jī)上進(jìn)行蘇木素復(fù)染及封片(乙醇、二甲苯)；
23)晾干，放置leica光鏡下觀(guān)察；
24)免疫組織化學(xué)檢測(cè)結(jié)果判斷。
結(jié)果判定：leica熒光顯微鏡下，每張切片隨機(jī)選取五個(gè)高倍鏡視野觀(guān)察細(xì)胞，細(xì)胞漿和(或)細(xì)胞核出現(xiàn)棕黃或棕褐色顆粒為陽(yáng)性細(xì)胞，根據(jù)陽(yáng)性細(xì)胞染色強(qiáng)度以及陽(yáng)性細(xì)胞在總細(xì)胞中所占數(shù)量比例判定實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
先按染色強(qiáng)度評(píng)分：無(wú)色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分；然后按陽(yáng)性細(xì)胞率評(píng)分：腫瘤細(xì)胞內(nèi)無(wú)陽(yáng)性染色者為0分，陽(yáng)性細(xì)胞率≤10％為1分，11％～50％為2分，51％～75％為3分，＞75％為4分。
針對(duì)tcf12評(píng)分采用定量的方法，即兩者評(píng)分相加作為最后的染色評(píng)分結(jié)果，范圍0～7分。
結(jié)果顯示，在50例接受前列腺癌根治術(shù)的患者的標(biāo)本制成的組織芯片的tcf12免疫評(píng)分上，tcf12的蛋白主要在前列腺癌細(xì)胞的細(xì)胞漿和細(xì)胞核中著色，并且與患者的gs評(píng)分相關(guān)。結(jié)合前列腺癌數(shù)據(jù)庫(kù)(taylordataset)分析，前列腺癌組織標(biāo)本的tcf12免疫評(píng)分低表達(dá)與患者高gs評(píng)分、腫瘤轉(zhuǎn)移和psa生化和不良生化復(fù)發(fā)生存期相關(guān)(所有p值均<0.05)。
將全部患者中tcf12免疫評(píng)分分?jǐn)?shù)根據(jù)中位數(shù)平均分為兩組，分別設(shè)定為高表達(dá)組和低表達(dá)組，kaplan–meier和logrank方法分析結(jié)果顯示tcf12的低表達(dá)與患者總體無(wú)生化復(fù)發(fā)生存率有關(guān)(p＝0.004)。cox回歸模型單因素分析方法分析結(jié)果提示，tcf12低表達(dá)(p＝0.006)、gleason高評(píng)分(p<0.001)和腫瘤病理高分期(p＝0.0001)可作為預(yù)測(cè)因子評(píng)估前列腺癌患者術(shù)后無(wú)生化復(fù)發(fā)生存率；此外，cox回歸模型多因素分析結(jié)果顯示，tcf12低表達(dá)(p＝0.046)、gleason高評(píng)分(p<0.001)和腫瘤病理高分期(p＝0.012)同時(shí)也是患者術(shù)后無(wú)生化復(fù)發(fā)生存率的預(yù)測(cè)因子，其他指標(biāo)在模型中均不能成為獨(dú)立的預(yù)后因子。
上述臨床驗(yàn)證的結(jié)果進(jìn)一步表明：該試劑和試劑盒可以顯示作為判斷前列腺癌進(jìn)展及預(yù)后的分子標(biāo)記物tcf12的表達(dá)水平。運(yùn)用本發(fā)明提供的試劑盒，檢測(cè)人體前列腺組織tcf12的表達(dá)水平，根據(jù)其表達(dá)水平可以方便快捷地為臨床前列腺癌患者的腫瘤的惡性進(jìn)展和預(yù)后程度判斷提供幫助，并對(duì)疾病治療選擇提供幫助。