本發(fā)明屬于海洋污染物生物檢測技術(shù)領(lǐng)域，具體地，涉及一種基于發(fā)光弧菌的海水重金屬污染監(jiān)測傳感器及其制備方法。

背景技術(shù)：

海水養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展是大勢所趨近年來，由于海洋漁業(yè)自然資源的日漸衰退，漁業(yè)捕撈量已大幅度下降，如果單純依靠海洋捕撈已遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足我國人民對海洋水產(chǎn)品的不斷增長的需求。擴(kuò)大魚類增養(yǎng)殖范圍，開發(fā)魚類蛋白資源是當(dāng)今世界水產(chǎn)增養(yǎng)殖中最活躍的科研開發(fā)工作，隨著生物科技的發(fā)展，水產(chǎn)養(yǎng)殖已成為世界上增加水產(chǎn)品來源最迅速的方式，也是水產(chǎn)品生產(chǎn)發(fā)展的必然趨勢。

海水養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展必須面對的環(huán)境污染問題從長遠(yuǎn)角度考慮，目前全國乃至廣東省海水養(yǎng)殖業(yè)處于粗放式發(fā)展階段，養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展很多以犧牲環(huán)境為代價(jià)，存在不可持續(xù)發(fā)展的問題。近年來，因環(huán)境污染及病害引起的養(yǎng)殖生物大面積死亡的現(xiàn)象仍時(shí)有發(fā)生，已成為制約養(yǎng)殖業(yè)生產(chǎn)發(fā)展的主要因素之一。鑒于目前的情況，迫切需要建立一套用于對海水養(yǎng)殖區(qū)水質(zhì)污染狀況的檢測和預(yù)警的方法體系，長期對環(huán)境污染的狀況監(jiān)控，以便及時(shí)采取有效防控措施，是對養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)的發(fā)展和人民生活健康的有效保障。

海洋環(huán)境中的細(xì)菌是海洋生態(tài)系統(tǒng)中的一個(gè)重要組成部分，它們在海洋生態(tài)系統(tǒng)的物質(zhì)循環(huán)、能量流動(dòng)、元素轉(zhuǎn)化、生態(tài)平衡及環(huán)境凈化等方面起著舉足輕重的作用。在一定條件下，海洋中的細(xì)菌和水環(huán)境之間互相聯(lián)系、互相制約，保持著自然的、暫時(shí)的相對平衡關(guān)系。當(dāng)海洋環(huán)境中的污染物增加時(shí)，隨著水質(zhì)指標(biāo)的透明度和溶氧量等生化因子發(fā)生變化，其水體和沉積物中的細(xì)菌種類、數(shù)量及種群結(jié)構(gòu)也呈現(xiàn)有規(guī)律的變化，這些變化可以用來表征海洋環(huán)境質(zhì)量的變化。

海洋生物監(jiān)測直觀反映環(huán)境污染對生物的危害以細(xì)菌為指標(biāo)檢測海洋環(huán)境質(zhì)量的研究，近年來有了很大的發(fā)展，但其方法的標(biāo)準(zhǔn)化，還需要進(jìn)一步的開展研究。我國在細(xì)菌應(yīng)用于海洋環(huán)境監(jiān)測和評估中的指示作用的研究方面起步較晚，目前尚缺乏系統(tǒng)的論述，但已經(jīng)將一些細(xì)菌指標(biāo)列入海調(diào)查和監(jiān)測的標(biāo)準(zhǔn)和規(guī)范中，如《海洋調(diào)查規(guī)范》(gb12763.6-91)調(diào)查項(xiàng)目包括海洋異養(yǎng)菌，異養(yǎng)菌、總大腸菌群及糞大腸桿菌已經(jīng)作為監(jiān)測指標(biāo)列入了《海洋監(jiān)測規(guī)范》(gb17378.1-1998)（國家質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督局），國家海水水質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)(gb3097-1997)規(guī)定海水水質(zhì)的檢測項(xiàng)目包括大腸菌群和糞大腸菌群，《海水增養(yǎng)殖區(qū)監(jiān)測技術(shù)規(guī)程》（國家海洋局，2002）中將糞大腸桿菌、弧菌數(shù)量和異養(yǎng)細(xì)菌總數(shù)列入增養(yǎng)殖區(qū)海水監(jiān)測指標(biāo)。有關(guān)沉積物中細(xì)菌指標(biāo)與環(huán)境的關(guān)系也已經(jīng)進(jìn)行了大量研究，但在沉積物質(zhì)量監(jiān)測中細(xì)菌指標(biāo)的應(yīng)用較少。目前，海洋沉積物質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)(gb18668-2002)(國家質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督局，2002)中將大腸菌群和糞大腸菌群作為指標(biāo)列入監(jiān)測項(xiàng)目，海水增養(yǎng)殖區(qū)監(jiān)測技術(shù)規(guī)程（國家海洋局，2002）將糞大腸桿菌和異養(yǎng)細(xì)菌總數(shù)列入了監(jiān)測項(xiàng)目，但相關(guān)評價(jià)方法和體系仍很不完善。

弧菌是自然海水中生存的正常菌群成員之一，但是也是海水養(yǎng)殖業(yè)中最為常見的條件致病菌。一般情況下，自然海水中弧菌的數(shù)量較低，但在排污口附近海區(qū)及海水養(yǎng)殖環(huán)境中其數(shù)量明顯較高。已有的調(diào)查結(jié)果表明，弧菌喜好生長于有機(jī)質(zhì)豐富的環(huán)境中，其數(shù)量的多寡可以指示環(huán)境的污染程度。

弧菌作為指示水質(zhì)污染的指示菌的研究弧菌是自然海水中生存的正常菌群成員之一，也是目前海水養(yǎng)殖業(yè)中最為常見的條件致病菌。若沿海城市的海濱、海水浴場、娛樂場和各類供食用的養(yǎng)殖場等遭受其嚴(yán)重污染時(shí)，都可能引起某些疾病的發(fā)生和流行。因此調(diào)查和監(jiān)測沿岸水域中海洋弧菌菌群數(shù)，將具有重要的衛(wèi)生學(xué)和流行病學(xué)意義。國內(nèi)外對河口、港灣、沿岸水域和某些經(jīng)濟(jì)性養(yǎng)殖場水域中的弧菌菌群的調(diào)查已經(jīng)取得了一些進(jìn)展。指示菌在污染水監(jiān)測中的優(yōu)勢用指示生物測評水污染有許多優(yōu)勢，一些常規(guī)生化參數(shù)如溫度、ph值、溶解氧、氧化還原電位及電導(dǎo)率等，可以連續(xù)監(jiān)測，但大部分測定項(xiàng)目或參數(shù)則需要定期采樣，因而只能反映采樣瞬時(shí)的污染物濃度，不能及時(shí)反映海水污染的動(dòng)態(tài)變化情況。與傳統(tǒng)理化手段相比，指示生物測評具有以下優(yōu)點(diǎn)：（1）連續(xù)監(jiān)測，污水中污染物的含量和其他環(huán)境條件隨時(shí)間而變化。這些變化是因?yàn)槲鬯乃亢退|(zhì)不穩(wěn)定而造成的。（2）真實(shí)全面，海水污染過程和效果是水中各種因素綜合作用的結(jié)果，不是簡單的加減關(guān)系，而理化分析得到的結(jié)果只能反映某個(gè)因素的作用，并不能反映綜合作用的真實(shí)情況。（3）反應(yīng)靈敏，指示生物中某些生物對水中物質(zhì)的敏感性有時(shí)比精密儀器還要強(qiáng)，根據(jù)監(jiān)測結(jié)果能更及時(shí)地掌握海水污染的情況。

可以說，生物監(jiān)測比常規(guī)理化監(jiān)測具有明顯的優(yōu)勢，應(yīng)用生物對生境退化進(jìn)行動(dòng)態(tài)監(jiān)測與評估能更準(zhǔn)確反映環(huán)境對生物脅迫的綜合狀況，指示生物所表現(xiàn)的各相關(guān)參數(shù)的改變，可直接表示水體綜合狀況，更能反映生境退化的真實(shí)狀況。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是克服現(xiàn)有技術(shù)中海水生物監(jiān)測方面的缺陷和不足，提供一種基于發(fā)光弧菌的海水重金屬污染檢測傳感器及檢測方法。本發(fā)明通過從海水中分離發(fā)光弧菌，制備相應(yīng)的發(fā)光生物傳感器，應(yīng)用于海水污染的監(jiān)測，本研究對于海洋弧菌與海洋環(huán)境之間的關(guān)系探索也具有重要的科學(xué)意義。

本發(fā)明的目的是提供一種基于基于發(fā)光弧菌的海水重金屬污染監(jiān)測傳感器。

本發(fā)明的另一目的是提供上述傳感器的制備方法。

本發(fā)明的在再一目的是提供上述傳感器檢測海水重金屬污染物的方法。

本發(fā)明的上述目的是通過以下技術(shù)方案給予實(shí)現(xiàn)的：

一種基于發(fā)光弧菌的海水重金屬污染監(jiān)測傳感器，所述監(jiān)測傳感器包括發(fā)光弧菌和生物發(fā)光光度計(jì)。

發(fā)光弧菌是一類非致病的革蘭氏陰性兼性厭氧微生物，它們在適當(dāng)條件下能發(fā)射出肉眼可見的藍(lán)綠色光。當(dāng)發(fā)光細(xì)菌與水樣毒性組分接觸時(shí)，可影響或干擾細(xì)菌的新陳代謝，使細(xì)菌的發(fā)光強(qiáng)度下降或熄滅。在一定毒物濃度范圍內(nèi)，有毒物質(zhì)濃度與發(fā)光強(qiáng)度呈負(fù)相關(guān)線性關(guān)系，因而可使用生物發(fā)光光度計(jì)測定水樣的相對發(fā)光強(qiáng)度來監(jiān)測有毒物質(zhì)的濃度。

優(yōu)選地，所述發(fā)光弧菌為費(fèi)式弧菌。

另外，上述監(jiān)測傳感器在水體污染物監(jiān)測及檢測方面的應(yīng)用亦在本發(fā)明保護(hù)范圍內(nèi)。

上述生物傳感器的制備方法，包括如下步驟：先從海洋中分離發(fā)光弧菌，再研究發(fā)光弧菌與環(huán)境毒性之間的關(guān)系，建立線性關(guān)系，最后通過生物發(fā)光光度計(jì)監(jiān)測發(fā)光弧菌的亮度。

同時(shí)，所述監(jiān)測傳感器的制備方法在制備生物傳感器方面的應(yīng)用也在本發(fā)明保護(hù)范圍內(nèi)。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益效果：

（1）本發(fā)明制備的監(jiān)測傳感器靈敏、高效、結(jié)構(gòu)簡單、成本低。

（2）本發(fā)明所述監(jiān)視傳感器的制備方法簡單、易于制備。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合具體實(shí)施例對本發(fā)明作出進(jìn)一步地詳細(xì)闡述，所述實(shí)施例只用于解釋本發(fā)明，并非用于限定本發(fā)明的范圍。下述實(shí)施例中所使用的試驗(yàn)方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法；所使用的材料、試劑等，如無特殊說明，為可從商業(yè)途徑得到的試劑和材料。

實(shí)施例1海洋弧菌與海水水質(zhì)污染定量關(guān)系的確定

定點(diǎn)定時(shí)從幾個(gè)典型養(yǎng)殖區(qū)取樣，利用弧菌生長特異性培養(yǎng)基對海水中的弧菌總數(shù)進(jìn)行計(jì)數(shù)，然后與樣品中的大腸桿菌總數(shù)、致病細(xì)菌數(shù)、環(huán)境污染程度（cod,bod）、赤潮發(fā)生和養(yǎng)殖區(qū)流行病發(fā)生狀況進(jìn)行綜合對比分析，找到它們之間的內(nèi)在聯(lián)系，為用弧菌作為指示海水環(huán)境污染程度提供理論基礎(chǔ)。通過標(biāo)準(zhǔn)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，確定弧菌總數(shù)是否可以作為重要的指標(biāo)指示海水水質(zhì)狀況。

實(shí)施例2致病弧菌的分子生物學(xué)檢測

擬選擇典型致病弧菌的致病基因作為生物marker，設(shè)計(jì)引物，利用pcr技術(shù)進(jìn)行定性檢測，用qpcr進(jìn)行定量檢測。另外利用基因工程技術(shù)表達(dá)弧菌致病毒素，利用純化的毒素蛋白免疫家兔制備單克隆抗體，利用酶聯(lián)免疫吸附（elisia）的方法對環(huán)境中弧菌毒素定量測定。通過比較利用分子生物學(xué)方法測得的數(shù)據(jù)與海水水質(zhì)污染狀況，優(yōu)化出用于指示海水水質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)分子生物學(xué)弧菌檢測方法。

實(shí)施例3發(fā)光弧菌生物傳感器的研制

利用實(shí)驗(yàn)室已經(jīng)分離的發(fā)光海洋弧菌，在實(shí)驗(yàn)室條件下研究各種理化指標(biāo)對發(fā)光強(qiáng)度的影響，建立理化因子與弧菌生物發(fā)光的內(nèi)在聯(lián)系，構(gòu)建發(fā)光弧菌生物傳感器。然后把發(fā)光弧菌生物傳感器用于實(shí)際樣品測試，進(jìn)一步優(yōu)化各種參數(shù)，建立標(biāo)準(zhǔn)的用于檢測海洋海水理化因子的方法。