本發(fā)明屬于醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)領(lǐng)域，涉及一種檢測(cè)人表面活性蛋白a的膠體金試紙條及其制備方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)：

新生兒呼吸窘迫綜合征(neonatalrespiratorydistresssyndrome，nrds)是一種因肺表面活性物質(zhì)缺乏而導(dǎo)致的新生兒早期死亡的嚴(yán)重疾病，其病死率極高，主要見(jiàn)于早產(chǎn)兒。新生兒呼吸窘迫綜合征的防治目標(biāo)是盡早干預(yù)，盡可能提高存活率，同時(shí)最大程度減少潛在的不良反應(yīng)。自肺表面活性物質(zhì)(pulmonarysurfactant,ps)替代療法問(wèn)世以來(lái)，nrds的病死率雖降至20％，但新生兒呼吸窘迫綜合征仍是導(dǎo)致新生兒死亡的主要原因。雖然肺表面活性物質(zhì)的應(yīng)用能降低ndrs的發(fā)生率或及減少并發(fā)癥發(fā)生，但預(yù)防性給藥是必會(huì)很大程度上會(huì)造成肺表面活性物質(zhì)的濫用，可能導(dǎo)致諸多不良反應(yīng)。因此，在啟動(dòng)預(yù)防性給予肺表面活性物質(zhì)之前快速的確診是治愈新生兒呼吸窘迫綜合征的關(guān)鍵。

雖然x射線檢查是判定新生兒呼吸窘迫綜合征的金標(biāo)準(zhǔn)，但患兒大多在出生24小時(shí)后的胸片才表現(xiàn)出顯著的x射線特征，但由于該病發(fā)展迅速，等待x射線的確診將耽誤新生兒呼吸窘迫綜合征的治療。因此，臨床上常通過(guò)檢測(cè)新生兒的肺成熟度來(lái)指導(dǎo)肺表面活性物質(zhì)的預(yù)防性給藥。通過(guò)羊水檢測(cè)肺成熟度的方法有多種，比如泡沫穩(wěn)定性法，卵磷脂/鞘磷脂比值法，ps/白蛋白比值法等。雖然綜合上述方法可在一定程度預(yù)測(cè)新生兒的肺成熟度，但這些方法操作復(fù)雜、檢測(cè)時(shí)間較長(zhǎng)，并需要專門的儀器設(shè)備和專業(yè)的技術(shù)操作人員。而目前臨床上尚無(wú)適于急救需要的簡(jiǎn)便、快捷而準(zhǔn)確的預(yù)測(cè)新生兒呼吸窘迫綜征的方法。

胎兒肺成熟有賴于肺表面活性物質(zhì)的存在，因此，通過(guò)測(cè)定羊水中肺表面活性物質(zhì)的成分，可間接預(yù)測(cè)胎兒肺成熟度。肺表面活性物質(zhì)中的活性成分除了磷脂外，尚有與之結(jié)合的4種表面活性蛋白(surfactantprotein，sp)，其中表面活性蛋白a(spa)是含量最多的一種表面活性蛋白，其含量在一定程度上可以反映sp的濃度。目前，已有報(bào)道通過(guò)測(cè)定羊水、臍血、胃液中表面活性蛋白a含量可預(yù)測(cè)新生兒肺成熟度，其中檢測(cè)羊水中spa的方法的敏感度和特異度分別為88.2％和68.5％，且聯(lián)合傳統(tǒng)的泡沫穩(wěn)定性法可實(shí)現(xiàn)100％的新生兒呼吸窘迫綜征的診斷準(zhǔn)確率。因此，羊水中表面活性蛋白a可作為一種特異性的肺成熟度標(biāo)志物用于新生兒呼吸窘迫綜征的早期篩查和輔助預(yù)測(cè)，而如何快速、特異性、高靈敏度的檢測(cè)羊水中表面活性蛋白a的水平對(duì)于新生兒呼吸窘迫綜征患者的診斷和治療具有重要的臨床意義，且具有廣泛的臨床應(yīng)用前景和市場(chǎng)潛力。

目前，spa的檢測(cè)方法主要是酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(enzymelinkedimmunosorbentassay，elasa)，由于該方法操作繁瑣、耗時(shí)長(zhǎng)，不適宜spa的快速檢測(cè)。膠體金試紙條是集單克隆抗體技術(shù)、膠體金免疫層析技術(shù)和新型層析材料為一體的一項(xiàng)新型體外診斷技術(shù)，該技術(shù)利用微孔膜的毛細(xì)管作用，使滴加在樣品墊上的溶液緩慢經(jīng)過(guò)金標(biāo)墊和醋酸纖維素膜到達(dá)試紙條的另一端，待測(cè)物金標(biāo)試劑復(fù)合物與之發(fā)生抗原抗體特異性結(jié)合而被截留，使得膠體金標(biāo)記物聚集在檢測(cè)帶上，可通過(guò)目測(cè)得到直觀的檢測(cè)結(jié)果。膠體金試紙條具有簡(jiǎn)單、快速、靈敏、準(zhǔn)確、可現(xiàn)場(chǎng)操作等優(yōu)點(diǎn)，已被廣泛應(yīng)用于傳染病、腫瘤、早孕等領(lǐng)域的體外檢測(cè)。

目前國(guó)內(nèi)外尚無(wú)基于表面活性蛋白a檢測(cè)的膠體金試紙條用于新生兒呼吸窘迫綜合征的快速檢測(cè)中，因此開(kāi)發(fā)一種用于快速檢測(cè)新生兒呼吸窘迫綜合征的膠體金試紙條，具有重要的臨床意義，可滿足臨床兒科和產(chǎn)科的迫切需求，有利于新生兒呼吸窘迫綜合征的預(yù)防性給藥，從而降低新生兒呼吸窘迫綜合征的死亡率。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

有鑒于此，本發(fā)明的目的在于提供一種檢測(cè)人表面活性蛋白a的膠體金試紙條，該膠體金試紙條能快速檢測(cè)體液中人表面活性蛋白a，兼具靈敏性和特異性，操作簡(jiǎn)單，使用方便，用時(shí)短，能應(yīng)用在新生兒呼吸窘迫綜合征早期檢測(cè)或診斷產(chǎn)品中。

為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的技術(shù)方案為：

檢測(cè)人表面活性蛋白a的膠體金試紙條，依次由吸水墊、硝酸纖維素膜、免疫膠體金墊、樣品墊和聚氯乙烯底板構(gòu)成；所述硝酸纖維素膜包有質(zhì)控線c線和檢測(cè)線t線，c線為二抗，t線為兔抗人表面活性蛋白a多克隆抗體ⅱ；所述免疫膠體金墊為包被有膠體金標(biāo)記的鼠抗人表面活性蛋白a單克隆抗體ⅰ的玻璃纖維。

所述檢測(cè)人表面活性蛋白a的膠體金試紙條在高度方向上的排布包括聚氯乙烯底板和反應(yīng)試劑載體吸附層，所述反應(yīng)試劑載體吸附層固定在所述聚氯乙烯底板上；從沾液端到手持端依次設(shè)有樣品墊、免疫膠體金墊、硝酸纖維素膜和吸水墊，在所述免疫膠體金墊和吸水墊上覆蓋有保護(hù)膜層，在所述硝酸纖維素膜上包被有條狀的檢測(cè)線t線和條狀的質(zhì)控線c線，所述檢測(cè)線t線和所述質(zhì)控線c線均呈與膠體金試紙條長(zhǎng)度方向垂直的條狀。

本發(fā)明的檢測(cè)人表面活性蛋白a的膠體金試紙條通過(guò)雙抗原夾心法，結(jié)合免疫膠體金技術(shù)快速檢測(cè)羊水中的表面活性蛋白a，用于新生兒呼吸窘迫綜合征的快速輔助檢測(cè)，兼具靈敏性和特異性，操作簡(jiǎn)單，使用方便，用時(shí)短，可滿足臨床兒科和產(chǎn)科的迫切需求，有利于新生兒呼吸窘迫綜合征的預(yù)防性給藥，從而降低新生兒呼吸窘迫綜合征的死亡率。

所述膠體金試紙條的檢測(cè)原理大體為：在樣品墊滴加入待測(cè)樣品后，通過(guò)毛細(xì)作用，待測(cè)樣品將免疫膠體金墊中鼠抗人表面活性蛋白a單克隆抗體ⅰ標(biāo)記的膠體金溶解釋放出來(lái)并向吸水墊一端的方向移動(dòng)。如果被檢測(cè)樣品中含有人表面活性蛋白a，則其與膠體金上標(biāo)記的鼠抗人表面活性蛋白a單克隆抗體ⅰ發(fā)生特異性反應(yīng)，生成膠體金-鼠抗人表面活性蛋白a單克隆抗體ⅰ-人表面活性蛋白a復(fù)合物，當(dāng)樣品在硝酸纖維素膜上繼續(xù)移動(dòng)到t線時(shí)，其中人表面活性蛋白a和兔抗人表面活性蛋白a多克隆抗體ⅱ發(fā)生特異性反應(yīng)并被其捕獲，形成膠體金-鼠抗人表面活性蛋白a單克隆抗體ⅰ-人表面活性蛋白a-兔抗人表面活性蛋白a多克隆抗體ⅱ復(fù)合物從而將膠體金固定在t線位置，在該檢測(cè)線線由于膠體金的聚集而形成一條紅色條帶，樣品繼續(xù)移動(dòng)到c線處時(shí)，多余的膠體金-鼠抗人表面活性蛋白a單克隆抗體ⅰ-人表面活性蛋白a復(fù)合物會(huì)被羊抗鼠二抗(gam)捕獲，因而在c線處形成一條紅色條帶。c線顯色證明該次測(cè)試的有效性，c線不顯色則視為測(cè)試無(wú)效，需重新檢測(cè)。

進(jìn)一步，所述樣品墊為玻璃纖維膜；所述吸水墊為吸水紙。

進(jìn)一步，所述二抗選用羊抗鼠二抗。

進(jìn)一步，所述膠體金試紙條的寬度為3-5mm；所述t線和c線的各相鄰線的間隔為4-6mm；所述樣品墊與免疫膠體金墊之間重疊1-2mm；所述免疫膠體金墊與硝酸纖維素膜之間重疊1-2mm；所述硝酸纖維素膜與吸水墊之間重疊1-2mm。

作為一種優(yōu)選，所述膠體金試紙條的寬度為4mm；所述t線和c線的各相鄰線的間隔為5mm；所述樣品墊與免疫膠體金墊之間重疊1mm；所述免疫膠體金墊與硝酸纖維素膜之間重疊1mm；所述硝酸纖維素膜與吸水墊之間重疊2mm。

進(jìn)一步，所述膠體金標(biāo)記的鼠抗人表面活性蛋白a單克隆抗體ⅰ為每80-150μg鼠抗人表面活性蛋白a單克隆抗體ⅰ采用1mlod520nm值為1.5-2.0的膠體金溶液標(biāo)記，膠體金顆粒平均直徑為30-50nm；所述t線上兔抗人表面活性蛋白a多克隆抗體ⅱ的合適包被量為0.3-1.5μg；所述c線上二抗的合適包被量為0.15-0.75μg。

作為一種優(yōu)選，所述鼠抗人表面活性蛋白a單克隆抗體ⅰ的合適用量為120μl。

免疫膠體金技術(shù)的反應(yīng)過(guò)程是一個(gè)由金顆粒、抗原與抗體動(dòng)態(tài)結(jié)合的反應(yīng)過(guò)程，在這個(gè)過(guò)程中每個(gè)環(huán)節(jié)的好壞都直接影響試驗(yàn)的成敗，如：

1)制備顆粒均勻、分散度好的膠體金在金標(biāo)免疫快速試驗(yàn)中非常關(guān)鍵，如果金顆粒直徑的變異范圍太大就會(huì)影響到試驗(yàn)的穩(wěn)定性和重復(fù)性，如果金顆粒的形狀不規(guī)則或粒徑不均一，使得膠體金標(biāo)記物容易解離和沉淀而產(chǎn)生金標(biāo)擴(kuò)散不完全、反應(yīng)區(qū)底色過(guò)深和假陽(yáng)性現(xiàn)象；而且膠體金質(zhì)量不好，膠體金結(jié)合物就不能快速而完整的從玻璃纖維上解離，從而影響試驗(yàn)結(jié)果。膠體金制備基于還原法，改變還原劑的性質(zhì)和濃度，可制備粒徑不同的膠體金懸液，根據(jù)試驗(yàn)?zāi)康倪x擇膠體金的粒徑，根據(jù)選擇的粒徑確定還原劑。

2)標(biāo)記蛋白、t線和c線的抗原或者抗體的純度和濃度直接影響金標(biāo)探針的質(zhì)量。獲得純度高、濃度適中的抗原、抗體，關(guān)鍵在于制備和純化方法的選擇及條件的優(yōu)化。試驗(yàn)前須采用高速離心去雜質(zhì)，應(yīng)用飽和硫酸銨沉淀、親和層析、透析除鹽等一系列處理方法，盡可能去除單克隆抗體、二抗和相關(guān)蛋白溶液中的高濃度的雜質(zhì)和多余離子，避免其干擾目的蛋白與膠體金的吸附結(jié)合，或?qū)е履z體金粒子的凝聚。同時(shí)，充分處理各種大分子蛋白，使其盡量分散為單體和具有適當(dāng)?shù)姆肿淤|(zhì)量，提高膠體金與蛋白質(zhì)的結(jié)合比，便于與膠體金充分而穩(wěn)定的結(jié)合。

3)膠體金標(biāo)記的兩個(gè)關(guān)鍵環(huán)節(jié)是標(biāo)記時(shí)的ph和最佳蛋白質(zhì)標(biāo)記量的確定。根據(jù)膠體金標(biāo)記的原理，只有在ph接近和稍高于蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)時(shí)，膠體金蛋白質(zhì)的吸附力最強(qiáng)；ph過(guò)高過(guò)低都不利于兩者的結(jié)合，因此標(biāo)記時(shí)選擇精密的酸堿度測(cè)定儀器或者試紙條，采用不同方法重復(fù)校正，并進(jìn)行梯度試驗(yàn)找到最佳的標(biāo)記ph溶膠與被標(biāo)蛋白質(zhì)的用量比例是否合適是影響標(biāo)記成功的一個(gè)重要因素。過(guò)多蛋白質(zhì)標(biāo)記，造成浪費(fèi)的同時(shí)引起試紙的拖帶現(xiàn)象；過(guò)少蛋白質(zhì)標(biāo)記，導(dǎo)致膠體金標(biāo)記不完全，從而降低試紙的靈敏度及假陽(yáng)性現(xiàn)象的出現(xiàn)。也需要在試驗(yàn)中進(jìn)行梯度試驗(yàn)，反復(fù)比較不同標(biāo)記量的標(biāo)記物在破壞試驗(yàn)中的穩(wěn)定性，確定最佳的標(biāo)記量。

本發(fā)明的目的之二在于提供一種所述的膠體金試紙條的制備方法，包括以下步驟：

1)膠體金溶液的制備：將氯化金水溶液用檸檬三鈉還原成的膠體金溶液；

2)人表面活性蛋白a免疫膠體金溶液的制備：將步驟1)制得的膠體金溶液ph值調(diào)至7-8.5，根據(jù)上述配比將鼠抗人表面活性蛋白a單克隆抗體ⅰ加入膠體金溶液，混合均勻反應(yīng)，再加入bsa溶液進(jìn)行封閉后1500r/min離心，棄沉淀后12000r/min離心去掉上清得沉淀，將沉淀液用金標(biāo)復(fù)溶液稀釋，即獲得人表面活性蛋白a免疫膠體金溶液；

3)免疫膠體金墊的制備：向步驟2)制得的人表面活性蛋白a免疫膠體金溶液用噴金機(jī)噴涂到處理好的玻璃纖維素膜上，烘干后得到免疫膠體金墊；

4)反應(yīng)膜的制備：先將兔抗人表面活性蛋白a多克隆抗體ⅱ用0.01m的磷酸鹽緩沖液進(jìn)行稀釋，加入2％的蔗糖，用劃膜噴金儀將該溶液劃在硝酸纖維素膜t線上；后將羊抗鼠二抗用0.01m的磷酸鹽緩沖液進(jìn)行稀釋，加入2％的蔗糖，用劃膜噴金儀將該溶液劃在硝酸纖維素膜c線上；烘后得到反應(yīng)膜；

5)組裝切條：將樣品墊、步驟3)制得的免疫膠體金墊、步驟4)制得的反應(yīng)膜和吸水紙依次貼到一張帶不干膠的聚氯乙烯膠板上，并貼上帶有插入液體面最高限位的指示線max的膠帶，然后切割成試紙條進(jìn)行密封包裝，得膠體金試紙條。

具體的一種膠體金試紙條的制備方法，包括以下步驟：

1)膠體金溶液的制備：將100ml0.01％氯化金水溶液用1-3ml的1％檸檬三鈉還原成30-50nm的膠體金溶液。

2)人表面活性蛋白a免疫膠體金溶液的制備：用0.1mol/lk2co3溶液將步驟1)制得的膠體金溶液ph值調(diào)至7-8.5，將膠體金溶液按1ml膠體金溶液中加入80-150μg鼠抗人表面活性蛋白a單克隆抗體ⅰ，混合均勻反應(yīng)2小時(shí)，再加入10％bsa溶液至終濃度0.5-2％進(jìn)行封閉。將制備好的免疫金以1500r/min4℃離心20分鐘，棄沉淀；后12000rpm離心20分鐘，去上清，將沉淀液用金標(biāo)復(fù)溶液稀釋到工作濃度，即獲得人表面活性蛋白a免疫膠體金溶液。

3)免疫膠體金墊的制備：向步驟2)制得的人表面活性蛋白a免疫膠體金溶液用噴金機(jī)噴涂到處理好的玻璃纖維素膜上，烘干后得到免疫膠體金墊。

4)反應(yīng)膜的制備：先將兔抗人表面活性蛋白a多克隆抗體ⅱ用0.01m的磷酸鹽緩沖液進(jìn)行稀釋到工作濃度，加入2％的蔗糖，用劃膜噴金儀將該溶液劃在硝酸纖維素膜t線上；后將羊抗鼠二抗(gam)0.01m的磷酸鹽緩沖液進(jìn)行稀釋到工作濃度，加入2％的蔗糖，用劃膜噴金儀將該溶液劃在硝酸纖維素膜c線上。37℃烘干4-6小時(shí)，得到反應(yīng)膜。

5)組裝切條：將樣品墊、步驟3)制得的免疫膠體金墊、步驟4)制得的反應(yīng)膜和吸水紙依次貼到一張帶不干膠的pvc膠板上，并貼上帶有插入液體面最高限位的指示線max的膠帶，然后根據(jù)切割成試紙條，并將組裝好的試紙條密封包裝保存。

進(jìn)一步，步驟4)中兔抗人表面活性蛋白a多克隆抗體ⅱ稀釋后的濃度為0.5-2mg/ml；步驟4)中羊抗鼠二抗稀釋后的濃度為0.5-2mg/ml。

本發(fā)明的目的之三在于提供一種所述的膠體金試紙條在檢測(cè)體液中人表面活性蛋白a中的應(yīng)用，所述體液包括羊水、血液、胃液、肺液。

本發(fā)明的目的還在于提供一種用于檢測(cè)表面活性蛋白a的膠體金試紙條在制備新生兒呼吸窘迫綜合征早期檢測(cè)或診斷產(chǎn)品中的應(yīng)用。凡是對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行簡(jiǎn)單替換或修改制備的可用于檢測(cè)表面活性蛋白a的膠體金試紙條應(yīng)用在新生兒呼吸窘迫綜合征早期檢測(cè)或診斷產(chǎn)品中，均屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。

本發(fā)明的目的還在于提供一種新生兒呼吸窘迫綜合征的早期檢測(cè)或診斷的試劑盒，所述試劑盒包括所述的膠體金試紙條。所述試劑盒能設(shè)置包括殼體、加樣孔、顯色觀察窗等用于包裝、保存、便于操作和觀察的裝置。

本發(fā)明的目的還在于提供一種檢測(cè)人表面活性蛋白a的膠體金試紙條的使用方法，在檢測(cè)中，檢測(cè)樣品溶液中人表面活性蛋白a的含量為≥400ng/ml。

本發(fā)明的有益效果在于：本發(fā)明的檢測(cè)人表面活性蛋白a的膠體金試紙條將膠體金免疫層析技術(shù)和免疫間接法原理相結(jié)合，將測(cè)試線包被人表面活性蛋白的抗體，通過(guò)免疫間接法原理，一步法就能夠快速檢測(cè)出體液中人表面活性蛋白a；到目前為止，沒(méi)有關(guān)于人表面活性蛋白a通過(guò)膠體金試紙條快速檢測(cè)的相關(guān)產(chǎn)品。

與現(xiàn)有檢測(cè)人表面活性蛋白a的elisa試劑盒相比，本發(fā)明的膠體金試紙條具有以下優(yōu)點(diǎn)：

(1)檢測(cè)羊水中人表面活性蛋白a，檢測(cè)速度快、效率高，一般在5～15分鐘內(nèi)即可讀取顯色結(jié)果并進(jìn)行判斷，不需要額外的樣品培養(yǎng)時(shí)間或反應(yīng)時(shí)間，為新生兒呼吸窘迫綜合征的快速確診提供時(shí)間基礎(chǔ)。

(2)該膠體金試紙條特異性強(qiáng)、符合率高。可通過(guò)目視的顯色(例如顯紅色或不顯色)來(lái)體現(xiàn)人表面活性蛋白a的陽(yáng)性或陰性。根據(jù)本發(fā)明對(duì)實(shí)際樣品的檢測(cè)結(jié)果來(lái)看，其靈敏度和特異度分別為90％和70％，且聯(lián)合傳統(tǒng)的泡沫穩(wěn)定性法可達(dá)到近100％的新生兒呼吸窘迫綜征的診斷準(zhǔn)確率。

(3)操作簡(jiǎn)單，價(jià)格低廉，不需要專業(yè)技術(shù)人員或大型儀器設(shè)備即可實(shí)施檢測(cè)，尤其適合在偏遠(yuǎn)貧困地區(qū)使用。

(4)可適用于新生兒呼吸窘迫綜合征的早期診斷，通過(guò)肉眼即可讀出檢測(cè)結(jié)果，從而獲取更多新生兒肺成熟度的相關(guān)信息，輔助臨床兒科或產(chǎn)科醫(yī)生給予正確的醫(yī)療診斷等，實(shí)現(xiàn)新生兒呼吸窘迫綜合征早發(fā)現(xiàn)、早診斷、早治療、早痊愈，具有重要的臨床意義。

附圖說(shuō)明

圖1為本發(fā)明制備的膠體金的tem照片(比例尺為100nm)。

圖2為本發(fā)明用于快速檢測(cè)人表面活性蛋白a的膠體金試紙條的示意圖。其中1為樣品墊，2為免疫膠體金墊，3為硝酸纖維素膜，4為檢測(cè)線t，5為質(zhì)控線c，6為聚氯乙烯底板，7為吸水墊。

圖3為本發(fā)明用于快速檢測(cè)人表面活性蛋白a的膠體金試紙條檢測(cè)結(jié)果示意圖。其中：8為c、t兩條線顯色為陽(yáng)性；9為c線一條線顯色為陰性；10為c、t兩條線均未顯色為無(wú)效。

圖4為本發(fā)明用于快速檢測(cè)人表面活性蛋白a的膠體金試紙條檢測(cè)結(jié)果圖。

具體實(shí)施方式

以下將參照附圖，對(duì)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例進(jìn)行詳細(xì)描述。優(yōu)選實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，所舉實(shí)施例是為了更好地對(duì)本發(fā)明的內(nèi)容進(jìn)行說(shuō)明，但并不是本發(fā)明的內(nèi)容僅限于所舉實(shí)施例。所以熟悉本領(lǐng)域的技術(shù)人員根據(jù)上述發(fā)明內(nèi)容對(duì)實(shí)施方案進(jìn)行非本質(zhì)的改進(jìn)和調(diào)整，仍屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。

實(shí)施例1檢測(cè)人表面活性蛋白a的膠體金試紙條

檢測(cè)人表面活性蛋白a的膠體金試紙條，依次由吸水墊7、硝酸纖維素膜3、免疫膠體金墊2、樣品墊1和聚氯乙烯底板6構(gòu)成；所述硝酸纖維素膜包有質(zhì)控線c線5和檢測(cè)線t線4，c線為二抗，t線為兔抗人表面活性蛋白a多克隆抗體ⅱ；所述免疫膠體金墊為包被有膠體金標(biāo)記的鼠抗人表面活性蛋白a單克隆抗體ⅰ的玻璃纖維。

實(shí)施例2：檢測(cè)人表面活性蛋白a的膠體金試紙條的制備方法

膠體金的制備：

1.在100ml的圓底燒瓶中加入48.5ml去離子水?dāng)嚢璨⒅蠓?，采用潔凈的冷凝管進(jìn)行回流，保持10min。

2.分別取0.5ml的haucl4水溶液(1wt％)加入到1ml的檸檬酸三鈉水溶液(0.35-1.485wt％)，攪拌均勻配置成2.5ml的混合溶液，隨后迅速加入到1步中的沸水中?？梢杂^察到溶液的顏色由無(wú)色迅速轉(zhuǎn)變?yōu)樗{(lán)灰色，經(jīng)由紫色過(guò)度最終轉(zhuǎn)變?yōu)橥噶恋募t色。

3.反應(yīng)溶液繼續(xù)加熱攪拌回流1h，停止加熱，持續(xù)攪拌自然降為室溫。

膠體金標(biāo)記復(fù)合物的制備：

1.將1ml膠體金溶液加入到酸洗過(guò)的圓底燒瓶中，再加入40μl的0.1m的k2co3溶液，磁力攪拌混合3分鐘(100r/min)。

2.快速攪拌下(500r/min)逐滴緩慢加入120μg鼠抗人表面活性蛋白a單克隆抗體ⅰ(3min加完)，室溫不時(shí)攪拌(200r/min)反應(yīng)2小時(shí)。

3.反應(yīng)結(jié)束后在上述反應(yīng)液中加入1/50反應(yīng)液總體積的10％bsa(ph為7.4的0.01mpbs稀釋)，室溫下反應(yīng)2h并不時(shí)攪拌(200r/min)。

4.將制備好的免疫金以1500r/min4℃離心20分鐘，棄沉淀。

5.上清液以12000r/min4℃離心20分鐘，小心除去上清液，收集離心沉淀并用金標(biāo)清洗液稀釋。

6.重復(fù)步驟4、5兩次。

7.最終沉淀用金標(biāo)復(fù)溶液復(fù)合物溶到金原液體積的1/10，2-8℃保存?zhèn)溆?長(zhǎng)期保存的話需要向其中加入0.02％的疊氮鈉)。

結(jié)合墊的處理：

結(jié)合墊是標(biāo)記蛋白干燥的載體，結(jié)合墊吸收并將檢測(cè)液傳遞到固相層析膜上。結(jié)合墊的處理要保證金標(biāo)復(fù)合物的穩(wěn)定性且需要能夠?qū)⒔饦?biāo)復(fù)合物完全釋放，考慮到與同蛋白的長(zhǎng)期共存因素，結(jié)合墊只能保持偏中性的ph，低的鹽離子濃度，為蛋白創(chuàng)造一個(gè)好的保存環(huán)境，減少甚至消除金標(biāo)復(fù)合物在結(jié)合墊上的滯留。具體處理步驟如下：

將玻璃纖維剪切成10cm*10cm的規(guī)格，放在預(yù)先配置好的40ml處理液(0.5％tween-20,20％蔗糖，0.2％tritonx-100的0.01m的pbs溶液(ph＝7.4))中，常溫浸泡30min。處理好的玻纖放在網(wǎng)格托架上，37℃烘箱中鼓風(fēng)干燥12h，切割成0.7*0.4cm的方塊，密封保存在相對(duì)濕度小于15％，室溫條件下的干燥皿中備用。

樣品墊的處理：

樣品墊主要用于平緩測(cè)試液流速，使其在結(jié)合墊上均勻展開(kāi)，同時(shí)調(diào)整檢測(cè)溶液ph和粘度并濾除溶液中可能存在的較大的雜質(zhì)。樣品墊的前處理液一般要有緩沖體系、去污劑、增稠劑、阻滯劑等組成，使樣品墊具有較大的前處理和過(guò)濾能力。對(duì)樣品墊前處理液的優(yōu)化，目的在于膜的封閉和水化，最大限度減少樣品溶液的干擾。具體處理步驟如下：

將玻璃纖維剪切成10cm*10cm的規(guī)格，放在預(yù)先配置好的40ml處理液(0.1％tween-20,2％氯化鈉，1％bsa的0.01m的pbs溶液(ph＝7.4))中，常溫浸泡30min。處理好的玻纖放在網(wǎng)格托架上，37℃烘箱中鼓風(fēng)干燥12h，切割成1.5*0.4cm的方塊，密封保存在相對(duì)濕度小于15％，室溫條件下的干燥皿中備用。

硝酸纖維素膜上抗體的包被：

硝酸纖維素膜切割成0.4cm寬的小塊，調(diào)整最終單支試紙條上t線上兔抗人表面活性蛋白a多克隆抗體ⅱ的包被量為0.5μg。c線上羊抗鼠二抗(gam)的合適包被量為0.3μg。c,t兩線包被抗體的距離為5mm。37℃烘箱中鼓風(fēng)干燥5h，切割成1.5*0.4cm的方塊，密封保存在相對(duì)濕度小于15％，室溫條件下的干燥皿中備用。

鼠抗人表面活性蛋白a單克隆抗體ⅰ金標(biāo)墊的制備：

在處理好的小塊結(jié)合墊(0.7*0.4cm)上，將鼠抗人表面活性蛋白a單克隆抗體ⅰ金標(biāo)復(fù)合物2.5μl噴灑于硝酸纖維素膜上，于37℃烘干8h，密封保存在相對(duì)濕度小于15％，室溫條件下的干燥皿中備用。

檢測(cè)人表面活性蛋白a的膠體金試紙條的組裝：

如圖2所示，以表面涂有生物惰性粘膠的pvc粘板(長(zhǎng)8cm，寬4mm)為基底，在其表面從樣品端起順序粘貼有樣品墊1、膠體金復(fù)合物標(biāo)記的結(jié)合墊2、電紡硝酸纖維素納米纖維膜3和吸水墊7。其中樣品墊1一端蓋住結(jié)合墊2，交疊寬度為1mm；結(jié)合墊3的另一端蓋住硝酸纖維素納米纖維膜3的一端，交疊寬度為1mm；吸收墊7蓋住硝酸纖維素納米纖維膜膜3的另一端，交疊寬度為2mm。

具體操作過(guò)程為：撕去粘板上粘膠保護(hù)紙層露出生物惰性粘膠，包被好檢測(cè)線和質(zhì)控線的硝酸纖維素納米纖維膜貼于距樣品端2.1cm處，將膠體金復(fù)合物標(biāo)記的結(jié)合墊2貼于距樣品端1.4cm處，再將樣品墊和吸收墊按照?qǐng)D1中順序貼于兩端。檢測(cè)樣品時(shí)，將100μl待檢樣品溶液加入組裝好的試紙條的樣品墊上，樣品溶液在毛細(xì)作用下向前泳動(dòng)，經(jīng)過(guò)結(jié)合墊時(shí)其上干燥的金標(biāo)復(fù)合物復(fù)溶并隨樣品溶液向前遷移，在特定的抗原或抗體區(qū)帶位置發(fā)生特異性結(jié)合，膠體金顆粒在相應(yīng)區(qū)域聚集增強(qiáng)顯色，可用肉眼進(jìn)行觀察，從而實(shí)現(xiàn)定性和半定量的檢測(cè)。以?shī)A心式反應(yīng)為例說(shuō)明檢測(cè)結(jié)果：陽(yáng)性結(jié)果呈現(xiàn)c、t兩條線顯色，即檢測(cè)線4和質(zhì)控線5；陰性結(jié)果只出現(xiàn)c一條線，即質(zhì)控線5；如果無(wú)線條出現(xiàn)則說(shuō)明該次檢測(cè)時(shí)間太短或是試紙條失效。

實(shí)施例3：實(shí)施例2制備的膠體金試紙條的靈敏度分析

取上述實(shí)施例2制作的檢測(cè)人表面活性蛋白a的膠體金試紙條25條。將人表面活性蛋白a抗原梯度溶解于標(biāo)準(zhǔn)稀釋液中，濃度分別為1000ng/ml,500ng/ml,400ng/ml,200ng/ml,0ng/ml,每個(gè)樣品濃度測(cè)試5條，測(cè)試時(shí)間為10分鐘。表1所示為目測(cè)判讀結(jié)果。結(jié)果顯示，當(dāng)檢測(cè)樣品溶液中人表面活性蛋白a的含量低于200ng/ml時(shí)，本發(fā)明試紙條不顯色，即檢出率為0。當(dāng)檢測(cè)樣品溶液中人表面活性蛋白a的含量≥400ng/ml時(shí)，試紙條能正常檢測(cè)判讀，檢出率為100％。結(jié)果表明，本發(fā)明提供的人表面活性蛋白a的膠體金試紙條大大提高了檢測(cè)的方便性，且準(zhǔn)確率高，具有重要的臨床應(yīng)用價(jià)值。

表1膠體金試紙條的靈敏度分析

實(shí)施例4：實(shí)施例2制備的膠體金試紙條的臨床應(yīng)用

檢測(cè)羊水中人表面活性蛋白a：取上述實(shí)施例2制備的膠體金試紙條，在室溫平衡10分鐘，用吸管吸取2-3滴待測(cè)羊水滴于樣品墊上，檢測(cè)結(jié)果在5-20分鐘后讀取。

臨床檢測(cè)驗(yàn)證：我們隨機(jī)檢測(cè)了10例新生兒呼吸窘迫綜征患者和10例正常新生兒的血清，經(jīng)過(guò)elisa驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)本試紙條對(duì)于人表面活性蛋白a含量≥400ng/ml的樣品的檢出率為100％，這也驗(yàn)證了實(shí)施3的分析結(jié)果；臨床檢測(cè)中對(duì)新生兒呼吸窘迫綜征檢測(cè)的靈敏度和特異度分別為90％和70％，檢測(cè)結(jié)果如圖4，示意圖3和表2所示，其中：c、t兩條線顯色為陽(yáng)性；c線一條線顯色為陰性；c、t兩條線均未顯色為無(wú)效。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明本發(fā)明實(shí)施例2制備的膠體金試紙條的準(zhǔn)確性好、靈敏度高，對(duì)新生兒呼吸窘迫綜征具有較好的預(yù)測(cè)性。

表2膠體金試紙條的對(duì)實(shí)際臨床樣本檢測(cè)的靈敏度和特異度分析

最后說(shuō)明的是，以上實(shí)施例僅用以說(shuō)明本發(fā)明的技術(shù)方案而非限制，盡管參照較佳實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行了詳細(xì)說(shuō)明，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，可以對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行修改或者等同替換，而不脫離本發(fā)明技術(shù)方案的宗旨和范圍，其均應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的權(quán)利要求范圍當(dāng)中。