本發(fā)明涉及一種貴金屬納米材料電化學(xué)免疫傳感器的制備方法及應(yīng)用，更具體而言，本發(fā)明是采用Au八面體分散液作為基底材料，Au八面體等離子膠體負載的甲苯胺藍為二抗標(biāo)記物，通過層層自組裝構(gòu)建的夾心型免疫傳感器，可以實現(xiàn)對赭曲霉毒素A的特異性檢測，屬于新型傳感器構(gòu)建技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
赭曲霉毒素A是真菌生長過程中產(chǎn)生的有毒物質(zhì)，經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)它具有較強的肝毒性和腎毒性，并會引發(fā)致畸、致突變和致癌的作用。赭曲霉毒素A在真菌毒素中毒性第二，并且廣泛存在于各類農(nóng)作物及食品中，嚴(yán)重危害著人類和動物的健康，因此赭曲霉毒素A的檢測刻不容緩。傳統(tǒng)的檢測方法包括液相色譜、氣相色譜和毛細管電泳法等方法，但多數(shù)方法需要的儀器設(shè)備昂貴，樣品準(zhǔn)備耗時長，不適于大量樣品的篩選。電化學(xué)免疫傳感器，尤其是夾心型電化學(xué)免疫傳感器，具有檢測靈敏度高、選擇性好、重現(xiàn)性好、穩(wěn)定性高等優(yōu)點，是當(dāng)今時代備受人們關(guān)注的一門技術(shù)。
本發(fā)明基于納米功能材料構(gòu)建了一種新型的電化學(xué)免疫傳感器，用于赭曲霉毒素A的檢測。利用Au八面體分散液作為基底材料，Au八面體等離子膠體負載的甲苯胺藍作為二抗標(biāo)記物，實現(xiàn)了對赭曲霉毒素A的檢測。測試結(jié)果顯示該電化學(xué)免疫傳感器靈敏度高，檢出限低，穩(wěn)定性好，基于上述發(fā)現(xiàn)，發(fā)明人完成了本發(fā)明。
技術(shù)實現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的之一是基于Au八面體分散液為基底材料，利用Au八面體等離子膠體負載的甲苯胺藍為標(biāo)記層，構(gòu)建了一種新型的夾心型電化學(xué)免疫傳感器。
本發(fā)明的目的之二是提供一種基于貴金屬材料Au的電化學(xué)免疫傳感器的制備方法，該方法制備的傳感器穩(wěn)定性好、選擇性好、靈敏度高和重現(xiàn)性好。
本發(fā)明的目的之三是實現(xiàn)了所述電化學(xué)免疫傳感器的構(gòu)建并且對赭曲霉毒素A進行了有效的檢測，達到了所述電化學(xué)免疫傳感器在測定赭曲霉毒素A的用途。
本發(fā)明的技術(shù)方案如下：
1. 一種基于Au八面體等離子膠體的赭曲霉毒素A免疫傳感器的構(gòu)建
（1）用Al2O3拋光粉打磨直徑為4 mm的玻碳電極，超純水清洗干凈，將6 μL、1.0 ~ 1.6 mg mL-1 Au八面體分散液滴加到電極表面，室溫下晾干成膜；
（2）依次滴加6 μL、1~5 μg mL-1的赭曲霉毒素A抗體anti-OTA，3 μL、質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.5% ~ 2%的BSA溶液到電極表面，超純水洗凈，室溫下晾干；
（3）滴加6 μL、10-4~100 ng mL-1的一系列不同濃度的赭曲霉毒素A到電極表面，孵化2 h，超純水沖洗，室溫下晾干；
（4）滴加6 μL的Au八面體等離子膠體負載甲苯胺藍的二抗標(biāo)記物Au opc@Ab2@Tb溶液，超純水沖洗，室溫下晾干，制得一種夾心型免疫傳感器。
2. Au八面體分散液的制備
將20 mg mL-1、1.2 mL氯金酸及0.1~1.8 g PDDA同時加入到140 mL乙二醇溶液中，在195 °C條件下加熱0.1~10 h，通過在14500 rpm下離心并用超純水反復(fù)洗滌制得Au八面體。
3. Au八面體等離子膠體負載甲苯胺藍的二抗標(biāo)記物Au opc@Ab2@Tb溶液的制備
（1）Au八面體等離子膠體的制備
將制得的Au八面體分散液用正丁醇溶液洗滌，然后通過超聲重新分散在一定量的去離子水中，形成膠體懸浮液，再把1 mL正丁醇溶液加入到上述膠體懸浮體中，超聲振蕩0.2~5 h，通過界面自組裝形成Au八面體等離子膠體，靜置5~100 min，得到的沉淀即為Au八面體等離子膠體；
（2）Au八面體等離子膠體負載甲苯胺藍的二抗標(biāo)記物Au opc@Ab2@Tb溶液的制備
將0.5 mL、1.0 mg mL-1 Au八面體等離子膠體分散于1.0 mL超純水中搖勻，并加入0.1 mL的赭曲霉毒素A抗體anti-OTA和甲苯胺藍， 4 °C下振蕩1~5 h，得到的產(chǎn)物14500 rpm離心分離，固體重新分散在蒸餾水中即為Au八面體等離子膠體負載甲苯胺藍的二抗標(biāo)記物Au opc@Ab2@Tb溶液。
4. 赭曲霉毒素A的檢測
（1）使用電化學(xué)工作站以三電極體系進行測試，飽和甘汞電極為參比電極，鉑絲電極為輔助電極，所制備的免疫傳感器為工作電極，在10 mL的含有濃度為4~6 mmol L-1鐵氰化鉀和10-2~10 mmol L-1硝酸鉀溶液中進行測試；
（2） 用方波伏安法對赭曲霉毒素A標(biāo)準(zhǔn)溶液進行檢測，其電壓測試范圍為-0.6V ~ 0.3V；
（3）當(dāng)背景電流趨于穩(wěn)定后，觀察赭曲霉毒素A加入前后傳感器的峰電流值，然后記錄電流變化，繪制工作曲線。
本發(fā)明的有益成果
（1）本發(fā)明的發(fā)明人將Au八面體分散液作為基底材料，Au八面體等離子膠體作為二抗標(biāo)記物應(yīng)用到電化學(xué)免疫傳感器的制備當(dāng)中， 由于Au八面體和Au八面體等離子膠體具有良好的電子傳遞能力，并且能夠牢固的連接赭曲霉毒素A抗體，提高了傳感器的靈敏度和穩(wěn)定性。
（2）本發(fā)明采用甲苯胺藍作為電子媒介體，構(gòu)建了一個夾心型電化學(xué)免疫傳感器，并且對赭曲霉毒素A進行了有效的檢測，此方法操作較為簡單。
（3）本發(fā)明制備的電化學(xué)免疫傳感器用于赭曲霉毒素A的檢測，該電化學(xué)傳感器穩(wěn)定性高，重現(xiàn)性好，靈敏度高，線性范圍寬，可以實現(xiàn)簡單、快速、高靈敏和特異性檢測。
具體實施方式
實施例1 一種基于Au八面體等離子膠體的赭曲霉毒素A免疫傳感器的構(gòu)建
（1）用Al2O3拋光粉打磨直徑為4 mm的玻碳電極，超純水清洗干凈，將6 μL、1.0 mg mL-1Au八面體分散液滴加到電極表面，室溫下晾干成膜；
（2）依次滴加6 μL、1 μg mL-1的赭曲霉毒素A抗體anti-OTA，3 μL、質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.5%的BSA溶液到電極表面，超純水洗凈，室溫下晾干；
（3）滴加6 μL、10-4~100 ng mL-1的一系列不同濃度的赭曲霉毒素A到電極表面，孵化2 h，超純水沖洗，室溫下晾干；
（4）滴加6 μL的Au八面體等離子膠體負載甲苯胺藍的二抗標(biāo)記物Au opc@Ab2@Tb溶液，超純水沖洗，室溫下晾干，制得一種夾心型免疫傳感器。
實施例2 一種基于Au八面體等離子膠體的赭曲霉毒素A免疫傳感器的構(gòu)建
（1）用Al2O3拋光粉打磨直徑為4 mm的玻碳電極，超純水清洗干凈，將6 μL、1.2 mg mL-1Au八面體分散液滴加到電極表面，室溫下晾干成膜；
（2）依次滴加6 μL、3.5 μg mL-1的赭曲霉毒素A抗體anti-OTA，3 μL、質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的BSA溶液到電極表面，超純水洗凈，室溫下晾干；
（3）滴加6 μL、10-4~100 ng mL-1的一系列不同濃度的赭曲霉毒素A到電極表面，孵化2 h，超純水沖洗，室溫下晾干；
（4）滴加6 μL的Au八面體等離子膠體負載甲苯胺藍的二抗標(biāo)記物Au opc@Ab2@Tb溶液，超純水沖洗，室溫下晾干，制得一種夾心型免疫傳感器。
實施例3 一種基于Au八面體等離子膠體的赭曲霉毒素A免疫傳感器的構(gòu)建
（1）用Al2O3拋光粉打磨直徑為4 mm的玻碳電極，超純水清洗干凈，將6 μL、1.6 mg mL-1Au八面體分散液滴加到電極表面，室溫下晾干成膜；
（2）依次滴加6 μL、5 μg mL-1的赭曲霉毒素A抗體anti-OTA，3 μL、質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%的BSA溶液到電極表面，超純水洗凈，室溫下晾干；
（3）滴加6 μL、10-4~100 ng mL-1的一系列不同濃度的赭曲霉毒素A到電極表面，孵化2 h，超純水沖洗，室溫下晾干；
（4）滴加6 μL的Au八面體等離子膠體負載甲苯胺藍的二抗標(biāo)記物Au opc@Ab2@Tb溶液，超純水沖洗，室溫下晾干，制得一種夾心型免疫傳感器。
實施例4 Au八面體分散液的制備
將20 mg mL-1、1.2 mL氯金酸及0.1 g PDDA同時加入到140 mL乙二醇溶液中，在195 °C條件下加熱0.1 h，通過在14500 rpm下離心并用超純水反復(fù)洗滌制得Au八面體。
實施例5 Au八面體分散液的制備
將20 mg mL-1、1.2 mL氯金酸及1.0 g PDDA同時加入到140 mL乙二醇溶液中，在195 °C條件下加熱5 h，通過在14500 rpm下離心并用超純水反復(fù)洗滌制得Au八面體。
實施例6 Au八面體分散液的制備
將20 mg mL-1、1.2 mL氯金酸及1.8 g PDDA同時加入到140 mL乙二醇溶液中，在195 °C條件下加熱10 h，通過在14500 rpm下離心并用超純水反復(fù)洗滌制得Au八面體。
實施例7 Au八面體等離子膠體負載甲苯胺藍的二抗標(biāo)記物Au opc@Ab2@Tb溶液的制備
（1）Au八面體等離子膠體的制備
將制得的Au八面體分散液用正丁醇溶液洗滌，然后通過超聲重新分散在一定量的去離子水中，形成膠體懸浮液，再把1 mL正丁醇溶液加入到上述膠體懸浮液中，超聲振蕩0.2 h，通過界面自組裝形成Au八面體等離子膠體，靜置5 min，得到的沉淀即為Au八面體等離子膠體；
（2）Au八面體等離子膠體負載甲苯胺藍的二抗標(biāo)記物Au opc@Ab2@Tb溶液的制備
將0.5 mL、1.0 mg mL-1 Au八面體等離子膠體分散于1.0 mL超純水中搖勻，并加入0.1 mL的赭曲霉毒素A抗體anti-OTA和甲苯胺藍， 4 °C下振蕩1 h，得到的產(chǎn)物14500 rpm離心分離，固體重新分散在蒸餾水中即為Au八面體等離子膠體負載甲苯胺藍的二抗標(biāo)記物Au opc@Ab2@Tb溶液。
實施例8 Au八面體等離子膠體負載甲苯胺藍的二抗標(biāo)記物Au opc@Ab2@Tb溶液的制備
（1）Au八面體等離子膠體的制備
將制得的Au八面體分散液用正丁醇溶液洗滌，然后通過超聲重新分散在一定量的去離子水中，形成膠體懸浮液，再把1 mL正丁醇溶液加入到上述膠體懸浮液中，超聲振蕩2.5 h，通過界面自組裝形成Au八面體等離子膠體，靜置50 min，得到的沉淀即為Au八面體等離子膠體；
（2）Au八面體等離子膠體負載甲苯胺藍的二抗標(biāo)記物Au opc@Ab2@Tb的制備
將0.5 mL、1.0 mg mL-1 Au八面體等離子膠體分散于1.0 mL超純水中搖勻，并加入0.1 mL的赭曲霉毒素A抗體anti-OTA和甲苯胺藍， 4 °C下振蕩3 h，得到的產(chǎn)物14500 rpm離心分離，固體重新分散在蒸餾水中即為Au八面體等離子膠體負載甲苯胺藍的二抗標(biāo)記物Au opc@Ab2@Tb溶液。
實施例9 Au八面體等離子膠體負載甲苯胺藍的二抗標(biāo)記物Au opc@Ab2@Tb溶液的制備
（1）Au八面體等離子膠體的制備
將制得的Au八面體分散液用正丁醇溶液洗滌，然后通過超聲重新分散在一定量的去離子水中，形成膠體懸浮液，再把1 mL正丁醇溶液加入到上述膠體懸浮液中，超聲振蕩5 h，通過界面自組裝形成Au八面體等離子膠體，靜置100 min，得到的沉淀即為Au八面體等離子膠體；
（2）Au八面體等離子膠體負載甲苯胺藍的二抗標(biāo)記物Au opc@Ab2@Tb溶液的制備
將0.5 mL、1.0 mg mL-1 Au八面體等離子膠體分散于1.0 mL超純水中搖勻，并加入0.1 mL的赭曲霉毒素A抗體anti-OTA和甲苯胺藍， 4 °C下振蕩5 h，得到的產(chǎn)物14500 rpm離心分離，固體重新分散在蒸餾水中即為Au八面體等離子膠體負載甲苯胺藍的二抗標(biāo)記物Au opc@Ab2@Tb溶液。
實施例10 赭曲霉毒素A的檢測
（1）使用電化學(xué)工作站以三電極體系進行測試，飽和甘汞電極為參比電極，鉑絲電極為輔助電極，所制備的免疫傳感器為工作電極，在10 mL的含有濃度為4 mmol L-1鐵氰化鉀和10-2 mmol L-1硝酸鉀溶液中進行測試；
（2）用方波伏安法對赭曲霉毒素A標(biāo)準(zhǔn)溶液進行檢測，其電壓測試范圍為-0.6V ~ 0.3V；
（3）當(dāng)背景電流趨于穩(wěn)定后，觀察赭曲霉毒素A加入前后傳感器的峰電流值，然后記錄電流變化，繪制工作曲線。
實施例11 赭曲霉毒素A的檢測
（1）使用電化學(xué)工作站以三電極體系進行測試，飽和甘汞電極為參比電極，鉑絲電極為輔助電極，所制備的免疫傳感器為工作電極，在10 mL的含有濃度為5 mmol L-1鐵氰化鉀和1 mmol L-1硝酸鉀溶液中進行測試；
（2）用方波伏安法對赭曲霉毒素A標(biāo)準(zhǔn)溶液進行檢測，其電壓測試范圍為-0.6V ~ 0.3V；
（3）當(dāng)背景電流趨于穩(wěn)定后，觀察赭曲霉毒素A加入前后傳感器的峰電流值，然后記錄電流變化，繪制工作曲線。
實施例12 赭曲霉毒素A的檢測
（1）使用電化學(xué)工作站以三電極體系進行測試，飽和甘汞電極為參比電極，鉑絲電極為輔助電極，所制備的免疫傳感器為工作電極，在10 mL的含有濃度為6 mmol L-1鐵氰化鉀和10 mmol L-1硝酸鉀溶液中進行測試；
（2）用方波伏安法對赭曲霉毒素A標(biāo)準(zhǔn)溶液進行檢測，其電壓測試范圍為-0.6V ~ 0.3V；
（3）當(dāng)背景電流趨于穩(wěn)定后，觀察赭曲霉毒素A加入前后傳感器的峰電流值，然后記錄電流變化，繪制工作曲線。