本發(fā)明涉及一種基于還原氧化石墨烯負(fù)載鈣摻雜硒化鎘納米復(fù)合材料rGO/CdSe:Ca的前列腺特異性抗原夾心型光電化學(xué)傳感器的制備方法，具體是采用花狀WO3-Au雜化材料作為抗體捕獲基底，rGO/CdSe:Ca作為檢測(cè)抗體修飾材料，制備一種檢測(cè)前列腺特異性抗原的光電化學(xué)傳感器，屬于光電化學(xué)生物傳感檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
前列腺癌是老年男性常見的惡性腫瘤，特別是在歐美國(guó)家發(fā)生率高，目前美國(guó)前列腺癌的發(fā)病率已經(jīng)超過肺癌。在我國(guó)，隨著人們生活水平和醫(yī)療水平的提高，生活方式的西方化，導(dǎo)致前列腺癌危險(xiǎn)因素和保護(hù)因素的失衡，在低危人群中出現(xiàn)明顯的發(fā)病率增高的趨勢(shì)，嚴(yán)重危害著廣大男性患者的生活質(zhì)量和生命健康，近年來(lái)，前列腺特異性抗原已經(jīng)被確認(rèn)為診斷前列腺癌的重要標(biāo)志物，因此，建立一種簡(jiǎn)便快捷的檢測(cè)前列腺特異性抗原的測(cè)定方法對(duì)提高前列腺疾病的診斷率和治療率是十分必要的。
目前放射性免疫分析和色譜分析等技術(shù)已報(bào)道可用于檢測(cè)血清樣品中經(jīng)過樣品處理的前列腺特異性抗原。放射性免疫分析方法具有快速、靈敏、特異性強(qiáng)、簡(jiǎn)便實(shí)用、成本低廉等優(yōu)點(diǎn)，然而其主要的缺點(diǎn)是存在著輻射防護(hù)及防止污染的問題，且試劑盒使用時(shí)間短，可測(cè)量范圍相對(duì)狹窄，難以實(shí)現(xiàn)操作及測(cè)量的自動(dòng)化等。色譜技術(shù)用于前列腺特異性抗原的分析測(cè)定具有分析速度快，樣品用量少等優(yōu)點(diǎn)，但檢測(cè)過程費(fèi)時(shí)且預(yù)處理時(shí)間長(zhǎng)。表面等離子熒光法、表面增強(qiáng)拉曼光譜等技術(shù)的應(yīng)用使前列腺特異性抗原檢測(cè)得到了進(jìn)一步發(fā)展。然而這些方法不僅需要昂貴試劑和自動(dòng)化儀器，而且操作復(fù)雜、耗時(shí)長(zhǎng)。
光電化學(xué)免疫傳感是將免疫化學(xué)反應(yīng)與光電化學(xué)電極相結(jié)合的一種較為新穎的生物傳感技術(shù)，兼具光化學(xué)和電化學(xué)的優(yōu)勢(shì)，近幾年被越來(lái)越多的研究者所關(guān)注。本發(fā)明制備了一種以WO3-Au雜化材料作為抗體捕獲基底，rGO/CdSe:Ca納米復(fù)合材料作為二抗標(biāo)記物載體進(jìn)行信號(hào)放大的光電化學(xué)免疫傳感器，并實(shí)現(xiàn)對(duì)前列腺特異性抗原的高靈敏檢測(cè)。
WO3納米材料由于其具有良好的可見光吸收和化學(xué)穩(wěn)定性的優(yōu)點(diǎn)，在光催化領(lǐng)域得到了關(guān)注，但在光電化學(xué)傳感器領(lǐng)域的應(yīng)用鮮有報(bào)道。最近有文獻(xiàn)報(bào)道（Wang Y, et al.Biosens. Bioelectron., 2016, 85, 205.）利用CdS敏化ITO電極水熱法原位生長(zhǎng)的WO3納米片，通過辣根過氧化氫酶實(shí)現(xiàn)對(duì)細(xì)胞內(nèi)過氧化氫的檢測(cè)。但是在ITO電極直接原位生長(zhǎng)WO3納米材料存在電極面積比較難控制的缺點(diǎn)。CdSe量子點(diǎn)具有良好的光電化學(xué)性能，在光電化學(xué)領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用。申請(qǐng)?zhí)枮?01410411550.2的專利中公開了一種單獨(dú)合成TiO2與CdSe量子點(diǎn)，通過簡(jiǎn)單震蕩方法制備的半導(dǎo)體納米材料，作為二抗標(biāo)記物的傳感器。然而，單獨(dú)制備CdSe量子點(diǎn)由于其尺寸太小，易于團(tuán)聚。并且量子點(diǎn)內(nèi)部產(chǎn)生的光生電子空穴對(duì)也易發(fā)生自身復(fù)合，影響檢測(cè)靈敏度。
鑒于此，本發(fā)明采用ITO導(dǎo)電玻璃電極，結(jié)合光電化學(xué)技術(shù)和夾心信號(hào)放大免疫分析方法，制備了一種花狀WO3-Au雜化材料作為抗體捕獲基底，rGO/CdSe:Ca納米復(fù)合材料作為二抗標(biāo)記物載體的夾心型免疫傳感器用于對(duì)前列腺特異性抗原的高靈敏檢測(cè)。本發(fā)明采用滴涂的方式將花狀WO3-Au雜化材料修飾在電極表面，與原位生長(zhǎng)方法相比，使電極的修飾面積易于控制在需要范圍之內(nèi)，而原位生長(zhǎng)方法其電極修飾面積不易控制，影響了結(jié)果的準(zhǔn)確性，本發(fā)明顯著提高了檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性。同時(shí)，WO3與Au納米粒子雜化后，兩者之間的表面等離子體共振效應(yīng)使得光電流信號(hào)顯著增強(qiáng)，并且花狀的WO3-Au雜化材料具有更好的導(dǎo)電性，大的比表面積及良好的生物相容性，可提供更多的活性位點(diǎn)及生物分子固定位點(diǎn)。另外，通過石墨烯的引入和鈣離子的摻雜，提高了材料的導(dǎo)電性，并且有效的抑制CdSe量子點(diǎn)的團(tuán)聚以及電子空穴對(duì)的復(fù)合，使得rGO/CdSe:Ca光電流信號(hào)大大增強(qiáng)，提高了檢測(cè)靈敏度。該方法具有成本低、操作簡(jiǎn)單、特異性強(qiáng)、檢測(cè)快速等特點(diǎn)。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的之一是避免傳統(tǒng)檢測(cè)方法的儀器設(shè)備復(fù)雜、操作過程繁瑣、檢測(cè)人員要求高、檢測(cè)成本高等缺點(diǎn)，提供一種基于花狀WO3-Au作為基底材料，rGO/CdSe:Ca作為檢測(cè)抗體標(biāo)記物的簡(jiǎn)單、快速、靈敏度和準(zhǔn)確性高的光電化學(xué)免疫傳感器的制備方法，實(shí)現(xiàn)對(duì)前列腺特異性抗原的快速靈敏檢測(cè)。
本發(fā)明的技術(shù)方案如下：
1.一種基于rGO/CdSe:Ca的前列腺特異性抗原夾心型光電化學(xué)傳感器的制備方法，步驟如下：
（1）將2 cm×0.9 cm的ITO導(dǎo)電玻璃依次用洗潔精、丙酮、無(wú)水乙醇和超純水超聲清洗，氮?dú)獯蹈桑?/p>
（2）取6 μL、2~ 8 mg/mL的花狀WO3-Au納米雜化材料滴加到導(dǎo)電玻璃電極的導(dǎo)電面，室溫下自然晾干；
（3）在WO3-Au納米雜化材料修飾的電極表面，滴加6 μL、濃度為1~15 μg/mL的前列腺特異性抗原的檢測(cè)抗體溶液，超純水沖洗電極表面，4 ℃冰箱中晾干；
（4）在修飾電極表面滴加3 μL、質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.5~3%的BSA溶液，以封閉電極表面上非特異性活性位點(diǎn)，超純水沖洗電極表面，4 ℃冰箱中晾干；
（5）繼續(xù)滴加6 μL、0.005~50 ng/mL的前列腺特異性抗原溶液，超純水沖洗電極表面，4 ℃冰箱中晾干；
（6）滴加6 μL、2~ 8 mg/mL的rGO/CdSe:Ca標(biāo)記的前列腺特異性抗原的抗體溶液滴在電極表面與抗原特異性識(shí)別，室溫孵化1 h，清洗干凈，制得前列腺特異性抗原夾心型光電化學(xué)免疫傳感器，于4 ℃冰箱中儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>
2. 花狀WO3-Au納米雜化材料的制備方法，步驟如下：
（1）0.5~3 g 氯化鎢加入25~100 mL 無(wú)水乙醇中，所得溶液移入反應(yīng)釜，120~180 ℃反應(yīng)12~48 h，降至室溫，離心，洗滌，真空干燥；
（2）取0.1~0.5 g所得產(chǎn)品加入50~200 mL超純水中，0.5~1.0 mL 1% 氯金酸逐滴加入，磁力攪拌2~6 h后，1.0~2.0 mL 氯金酸逐滴加入，繼續(xù)攪拌5~10 h，離心，洗滌，干燥，得到WO3-Au納米雜化材料。
3. rGO/CdSe:Ca抗體孵化溶液的制備方法，步驟如下：
（1）0.09~0.1 g氯化鎘和1~2 mg氯化鈣加入30 mL水中，0.056 mL 3-巰基丙酸加入攪拌5 min，1 mol/L的氫氧化鈉溶液調(diào)成pH為7~10，加入1~2 mg 氧化石墨烯攪拌；
（2）0.05~0.07 g 硒粉與0.3~0.4 g硼氫化鈉混合在圓底燒瓶中，加入3~10 mL 水，氮?dú)猸h(huán)境下攪拌成勻液，將該溶液快速傾入上述液，磁力攪拌10~20 min，所得懸濁液移入反應(yīng)釜120~200 ℃反應(yīng)30~60 min，泠卻至室溫，離心，洗滌，干燥；
（3）將50~100 μL、20 μg/mL EDC和10 mg/mL NHS加入1 mL、1~5 mg/mL的rGO/CdSe:Ca溶液中，1 mL、10 μg/mL的前列腺特異性抗原的檢測(cè)抗體溶液加入，暗處孵化1~5 h。
4.前列腺特異性特異抗原的檢測(cè)方法，步驟如下；
（1）使用電化學(xué)工作站的三電極體系進(jìn)行測(cè)試，飽和甘汞電極作為參比電極，鉑絲電極為對(duì)電極，所制備的前列腺特異性抗原夾心型光電化學(xué)傳感器為工作電極，在含有10 mL、0.15 mol/L的抗壞血酸的pH 7.4的PBS緩沖溶液中進(jìn)行測(cè)試；
（2）用時(shí)間-電流法對(duì)前列腺特異性抗原溶液進(jìn)行檢測(cè)，輸入電壓為 0 V，光源選擇430 nm，記錄電流變化，繪制工作曲線；
（3）將待測(cè)樣品溶液代替前列腺特異性抗原溶液進(jìn)行檢測(cè)，按照工作曲線的繪制方法進(jìn)行測(cè)定。實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明，本發(fā)明所采用的時(shí)間-光電流差值與前列腺特異性抗原的濃度0.005~50 ng/mL范圍內(nèi)保持良好的線性關(guān)系，檢測(cè)線達(dá)到2 pg/mL。
本發(fā)明的有益成果
（1）WO3與Au納米粒子之間的表面等離子體共振效應(yīng)使得光電流信號(hào)顯著增強(qiáng)，并且花狀WO3-Au雜化材料具有較好的導(dǎo)電性，大的比表面積及良好的生物相容性，可提供更多活性位點(diǎn)及生物分子固定位點(diǎn)，提高了捕獲抗體在其表面的負(fù)載量，增加了傳感器的靈敏度和穩(wěn)定性。
（2）rGO/CdSe:Ca納米復(fù)合材料通過鈣離子摻雜以及石墨烯的引入，使得光電流信號(hào)大大增強(qiáng)，提高了檢測(cè)靈敏度。
（3）本發(fā)明利用抗原、抗體的免疫反應(yīng)，提高了檢測(cè)方法的特異性。
（4）本發(fā)明制備的夾心型光電化學(xué)免疫傳感器用于前列腺特異性特異抗原的檢測(cè)，響應(yīng)時(shí)間短，檢測(cè)線較低，線性范圍寬，可以實(shí)現(xiàn)簡(jiǎn)單、快速、高靈敏和特異性檢測(cè)。
具體實(shí)施方式
實(shí)施例1 一種基于rGO/CdSe:Ca的前列腺特異性抗原夾心型光電化學(xué)傳感器的制備方法
（1）將2 cm×0.9 cm的ITO導(dǎo)電玻璃依次用洗潔精、丙酮、無(wú)水乙醇和超純水超聲清洗，氮?dú)獯蹈桑?/p>
（2）取6 μL、2 mg/mL的花狀WO3-Au納米雜化材料滴加到導(dǎo)電玻璃電極的導(dǎo)電面，室溫下自然晾干；
（3）在WO3-Au納米雜化材料修飾的電極表面，滴加6 μL、濃度為1 μg/mL的前列腺特異性抗原的檢測(cè)抗體溶液，超純水沖洗電極表面，4 ℃冰箱中晾干；
（4）在修飾電極表面滴加3 μL、質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.5%的BSA溶液，以封閉電極表面上非特異性活性位點(diǎn)，超純水沖洗電極表面，4 ℃冰箱中晾干；
（5）繼續(xù)滴加6 μL、0.005~50 ng/mL的前列腺特異性抗原溶液，超純水沖洗電極表面，4 ℃冰箱中晾干；
（6）滴加6 μL、2 mg/mL的rGO/CdSe:Ca標(biāo)記的前列腺特異性抗原的抗體溶液滴在電極表面與抗原特異性識(shí)別，室溫孵化1 h，清洗干凈，制得前列腺特異性抗原夾心型光電化學(xué)免疫傳感器，于4℃冰箱中儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>
實(shí)施例2 一種基于rGO/CdSe:Ca的前列腺特異性抗原夾心型光電化學(xué)傳感器的制備方法
（1）將2 cm×0.9 cm的ITO導(dǎo)電玻璃依次用洗潔精、丙酮、無(wú)水乙醇和超純水超聲清洗，氮?dú)獯蹈桑?/p>
（2）取6 μL、5 mg/mL的花狀WO3-Au納米雜化材料滴加到導(dǎo)電玻璃電極的導(dǎo)電面，室溫下自然晾干；
（3）在WO3-Au納米雜化材料修飾的電極表面，滴加6 μL、濃度為10 μg/mL的前列腺特異性抗原的檢測(cè)抗體溶液，超純水沖洗電極表面，4 ℃冰箱中晾干；
（4）在修飾電極表面滴加3 μL、質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2 %的BSA溶液，以封閉電極表面上非特異性活性位點(diǎn)，超純水沖洗電極表面，4 ℃冰箱中晾干；
（5）繼續(xù)滴加6 μL、0.005~50 ng/mL的前列腺特異性抗原溶液，超純水沖洗電極表面，4 ℃冰箱中晾干；
（6）滴加6 μL、5 mg/mL的rGO/CdSe:Ca標(biāo)記的前列腺特異性抗原的抗體溶液滴在電極表面與抗原特異性識(shí)別，室溫孵化1 h，清洗干凈，制得前列腺特異性抗原夾心型光電化學(xué)免疫傳感器，于4℃冰箱中儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>
實(shí)施例3 一種基于rGO/CdSe:Ca的前列腺特異性抗原夾心型光電化學(xué)傳感器的制備方法
（1）將2 cm×0.9 cm的ITO導(dǎo)電玻璃依次用洗潔精、丙酮、無(wú)水乙醇和超純水超聲清洗，氮?dú)獯蹈桑?/p>
（2）取6 μL、8 mg/mL的花狀WO3-Au納米雜化材料滴加到導(dǎo)電玻璃電極的導(dǎo)電面，室溫下自然晾干；
（3）在WO3-Au納米雜化材料修飾的電極表面，滴加6 μL、濃度為15 μg/mL的前列腺特異性抗原的檢測(cè)抗體溶液，超純水沖洗電極表面，4 ℃冰箱中晾干；
（4）在修飾電極表面滴加3 μL、質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3%的BSA溶液，以封閉電極表面上非特異性活性位點(diǎn)，超純水沖洗電極表面，4 ℃冰箱中晾干；
（5）繼續(xù)滴加6 μL、0.005~50 ng/mL的前列腺特異性抗原溶液，超純水沖洗電極表面，4 ℃冰箱中晾干；
（6）滴加6 μL、8 mg/mL的rGO/CdSe:Ca標(biāo)記的前列腺特異性抗原的抗體溶液滴在電極表面與抗原特異性識(shí)別，室溫孵化1 h，清洗干凈，制得前列腺特異性抗原夾心型光電化學(xué)免疫傳感器，于4℃冰箱中儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>
實(shí)施例4 花狀WO3-Au納米雜化材料的制備方法
（1）0.5 g 氯化鎢加入25 mL 無(wú)水乙醇中，所得溶液移入反應(yīng)釜，120 ℃反應(yīng)12 h，降至室溫，離心，洗滌，真空干燥；
（2）取0.1 g所得產(chǎn)品加入50 mL超純水中，0.5 mL 1% 氯金酸逐滴加入，磁力攪拌2 h后，1.0 mL 氯金酸逐滴加入，繼續(xù)攪拌5~10 h，離心，洗滌，干燥，得到WO3-Au納米雜化材料。
實(shí)施例5 花狀WO3-Au納米雜化材料的制備方法
（1）2 g 氯化鎢加入50 mL無(wú)水乙醇中，所得溶液移入反應(yīng)釜，150 ℃反應(yīng) 24 h，降至室溫，離心，洗滌，真空干燥；
（2）取0.3 g所得產(chǎn)品加入100 mL超純水中，0.75 mL 1% 氯金酸逐滴加入，磁力攪拌4 h后，1.5 mL 氯金酸逐滴加入，繼續(xù)攪拌8 h，離心，洗滌，干燥，得到WO3-Au納米雜化材料。
實(shí)施例6 花狀WO3-Au納米雜化材料的制備方法
（1）3 g 氯化鎢加入100 mL無(wú)水乙醇中，所得溶液移入反應(yīng)釜，180 ℃反應(yīng)48 h，降至室溫，離心，洗滌，真空干燥；
（2）取0.5 g所得產(chǎn)品加入200 mL超純水中， 1.0 mL 1% 氯金酸逐滴加入，磁力攪拌6 h后，2.0 mL 氯金酸逐滴加入，繼續(xù)攪拌10 h，離心，洗滌，干燥，得到WO3-Au納米雜化材料。
實(shí)施例7 rGO/CdSe:Ca抗體孵化溶液的制備方法
（1）0.09 g 氯化鎘和1mg 氯化鈣加入30 mL水中，0.056 mL 3-巰基丙酸加入攪拌5 min，1 mol/L的氫氧化鈉溶液調(diào)成pH為7，加入1 mg 氧化石墨烯攪拌；
（2）0.05 g 硒粉與0.3 g硼氫化鈉混合在圓底燒瓶中，加入3 mL 水，氮?dú)猸h(huán)境下攪拌成勻液，將該溶液快速傾入上述液，磁力攪拌10 min，所得懸濁液移入反應(yīng)釜120 ℃反應(yīng)30 min，泠卻至室溫，離心，洗滌，干燥；
（3）將50μL、20 μg/mL EDC和10 mg/mL NHS加入1 mL、1 mg/mL的rGO/CdSe:Ca溶液中，1 mL、10 μg/mL的前列腺特異性抗原的檢測(cè)抗體溶液加入，暗處孵化1 h。
實(shí)施例8 rGO/CdSe:Ca抗體孵化溶液的制備方法
（1）0.095 g 氯化鎘和1.5 mg 氯化鈣加入30 mL水中，0.056 mL 3-巰基丙酸加入攪拌5 min，1 mol/L的氫氧化鈉溶液調(diào)成pH為9，加入1.5 mg 氧化石墨烯攪拌；
（2）0.06 g 硒粉與0.35 g硼氫化鈉混合在圓底燒瓶中，加入5 mL 水，氮?dú)猸h(huán)境下攪拌成勻液，將該溶液快速傾入上述液，磁力攪拌15 min，所得懸濁液移入反應(yīng)釜150 ℃反應(yīng)50 min，泠卻至室溫，離心，洗滌，干燥；
（3）將80 μL、20 μg/mL EDC和10 mg/mL NHS加入1 mL、3 mg/mL的rGO/CdSe:Ca溶液中，1 mL、10 μg/mL的前列腺特異性抗原的檢測(cè)抗體溶液加入，暗處孵化3 h。
實(shí)施例9 rGO/CdSe:Ca抗體孵化溶液的制備方法
（1）0.1 g 氯化鎘和2 mg 氯化鈣加入30 mL水中，0.056 mL 3-巰基丙酸加入攪拌5 min，1 mol/L的氫氧化鈉溶液調(diào)成pH為10，加入2 mg氧化石墨烯攪拌；
（2）0.07 g 硒粉與0.4 g硼氫化鈉混合在圓底燒瓶中，加入10 mL 水，氮?dú)猸h(huán)境下攪拌成勻液，將該溶液快速傾入上述液，磁力攪拌20 min，所得懸濁液移入反應(yīng)釜200 ℃反應(yīng)60 min，泠卻至室溫，離心，洗滌，干燥；
（3）將100 μL、20 μg/mL EDC和10 mg/mL NHS加入1 mL、5 mg/mL的rGO/CdSe:Ca溶液中，1 mL、10 μg/mL的前列腺特異性抗原的檢測(cè)抗體溶液加入，暗處孵化5 h。
實(shí)施例10 前列腺特異性特異抗原的檢測(cè)
（1）使用電化學(xué)工作站的三電極體系進(jìn)行測(cè)試，飽和甘汞電極作為參比電極，鉑絲電極為對(duì)電極，所制備的前列腺特異性抗原夾心型光電化學(xué)傳感器為工作電極，在含有10 mL、0.15 mol/L的抗壞血酸的pH 7.4的PBS緩沖溶液中進(jìn)行測(cè)試；
（2）用時(shí)間-電流法對(duì)前列腺特異性抗原溶液進(jìn)行檢測(cè)，輸入電壓為 0 V，光源選擇430 nm，記錄電流變化，繪制工作曲線；
（3）將待測(cè)樣品溶液代替前列腺特異性抗原溶液進(jìn)行檢測(cè)，按照工作曲線的繪制方法進(jìn)行測(cè)定。